JPH04113262A - バイオセンサおよびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明ζよ　生体試料中の微量の特定成分物質について
、試料液を希釈することなく、酵素反応を利用して電気
化学的に迅速かつ簡便に定量することのできるバイオセ
ンサに関すも 従来の技術 従来　血液などの生体試料中の特定成分について、試料
液の希釈や撹拌などを行なうことなく簡易に定量しうる
方式として、第３図に示すようなバイオセンサが提案さ
れている。このバイオセンサは　絶縁性の基板１上にス
クリーン印刷等の方法でカーボンなどの導電物質からな
る電極系２゜３を形成し　前記電極系２、３上に一部露
出した絶縁層４と親水性高分子層５、酸化還元酵素層６
および電子受容体層７からなる積層構造の酵素反応層を
形成したものである。試料液を酵素反応層へ滴下すると
、酸化還元酵素と電子受容体が試料液に溶解し　試料液
中の被測定物質との間で酵素反応が進行し電子受容体が
還元される。反応終了後、還元された電子受容体を電極
上で酸化し　このとき得られる酸化電流値から試料液中
の被測定物質濃度を求める。

発明が解決しようとする課題 この様な従来の構成では　試料液中に血球などの固形成
分が含まれている場合、粘度が高いため反応が遅れたり
、電極表面へ付着して電極反応が影響されて応答がばら
つい九　また　従来　バイオセンサの製造において、酵
素反応層はあらかじめ親水性高分子層を形成後、酵素の
水溶液を塗布乾燥し　さらに電子受容体の層を形成して
いｔも　　このた敢　各層が試料液に溶解するのに時間
を要し反応開始が遅れるた敢　測定時間を短縮できない
という問題があっ九 本発明は上記課題を解決するもので、生体試料中の微量
の特定成分物質について、試料液を希釈することなく、
迅速かつ簡便に定量することのできるバイオセンサを提
供することを目的としている。

課題を解決するための手段 本発明は上記目的を達成するためζＱ　絶縁性の基板上
に少なくとも測定極と対極からなる電極系を設け、酵素
と電子受容体と試料液の反応に際しての物質濃度変化を
電気化学的に前記電極系で検知し　試料液中の被測定物
質濃度を測定するバイオセンサにおいて、前記電極系の
表面に酸化還元酵素と親水性高分子および電子受容体か
らなる酵素反応層を形成したものである。

また　親水性高分子溶液を塗布し　さらに親水性高分子
と酵素と電子受容体の混合溶液を塗布　乾燥することに
より酵素反応層を形成させてバイオセンサを製造するよ
うにしたものである。

作用 本発明によれ（Ｌ　製造容易で製造コストも低いので電
極系をも含めたディスポーザブルタイプ（使い捨て可能
型）のバイオセンサを構成することができ、酵素反応層
を形成する限　酵素と電子受容体を混合しているので試
料液が供給されると速やかに溶けて反応が始まるた臥　
測定時間が短縮でき、バイオセンサの製造工程も簡易と
なったまた　酵素反応層を加熱乾燥するた敢　電子受容
体は溶けやすい微粒子状態となり、反応速度の向上に貢
献し九　製膜性のよい親水性高分子と膨潤の速い親水性
高分子を混ぜることにより、試料溶液が測定部に速やか
に供給されかつ試料溶液中のタンパク質などによる影響
を小さくすることができ、試料液をセンサに添加するこ
とにより、極めて容易に被測定物質濃度を測定すること
ができる。

実施例 以下、本発明の一実施例について第１図および第２図を
参照しなから説明すも バイオセンサの一例として、グルコースセンサについて
説明すも　第１図および第２図は　グルコースセンサの
一実施例について示したもので、バイオセンサの斜視図
と縦断面図である。ポリエチレンテレフタレートからな
る絶縁性の基板１くスクリーン印刷により導電性カーボ
ンペーストを印刷し　加熱乾燥することにより、測定極
２、対極３からなる電極系を形成する。次に　電極系を
部分的に覆１．％　　各々の電極の電気化学的に作用す
る部分となる２ａ、３ａ（面積約１ｍｍ”）を残すよう
ＪＱ　　絶縁性ペーストを前記と同様に印刷Ｌ　加熱処
理をして絶縁層４を形成する。この電極系（２ａ、３ａ
）の表面を覆うようにセルロース系の親水性高分子の一
種であるカルボキシメチルセルロース（以下ＣＭＣとい
う）の水溶液を塗布乾燥しざら＆、；ＣＭＣとゼラチン
の水溶液を作製し　酸化還元酵素としてグルコースオキ
シダーゼ（以下ＧＯＤという）と電子受容体であるフェ
リシアン化カリウムを溶かしたものを滴下し　摂氏４０
度で１５分間加熱して酵素反応層８を形成し島上記のよ
うに構成したグルコースセンサに試料液としてグルコー
ス標準液を供給部に５μ９滴下し１分後に対極を基準に
して測定極にアノード方向へ＋０．５Ｖの定電圧を印加
し５秒後の電流を測定する。グルコース標準液によりフ
ェリシアン化カリウムが溶解し　グルコースが酵素反応
層において酸化される際　フェロシアン化カリウムに還
元される。そこで、上記の定電圧の印加により、生成し
たフェロシアン化カリウムの濃度に基づく酸化電流が得
られ　この電流値は被測定物質であるグルコースの濃度
に対応する。応答電流を測定したところ９００　ｍｇｌ
♂という高濃度まで良好な直線性が得られた　一方　酵
素反応層が第３図に示す従来例のような積層構造の場合
にζ；１，９００ｍｇ／ｄｉ！まで直線性を得るには反
応時間を２分必要とした　これζ戴　反応層が積層され
ているた数　試料が供給され各層が溶解してから反応が
始まるた教　反応の開始が遅れているのが原因と考えら
れる。そこで、酵素と親水性高分子および電子受容体を
混合し　酵素反応層を摂氏２５度の常温で乾燥形成させ
たところあらがた乾燥するのに２５分要した　摂氏４０
度で加熱形成させた酵素反応層と加熱しないで形成させ
た酵素反応層のバイオセンサについて応答性を調べたと
ころグルコース濃度が１００ｍｇ／改においては加熱し
たほうが３０秒で反応が終了するのに比べ加熱しないほ
うは１分間近く反応が終了するのに要した　これは加熱
した場合は乾燥が速やかに行なわれるためフェリシアン
化カリウムの粒子が細かい状態で均一に分布しているの
に比べ　加熱しない場合はフェリシアン化カリウムが大
きな結晶に成長するため溶解速度が低下し反応速度が減
少したと考えられる。

また　摂氏４０度に加熱した場合も９００ｍｇ／准まで
直線性が保たれているのが確認できているたべ　短時間
の加熱では酵素の活性に影響はないと考えられも　乾燥
温度を摂氏３０度から摂氏１゜０度まであげ湿度は２０
％以下にコントロールしてバイオセンサを作製しグルコ
ース濃度６００ｍｇ／ｄｉ！に対する応答を調べたとこ
へ　摂氏７０度までは応答の劣化はみられなかっ九　ま
た　摂氏７０度で（戴　乾燥時間を５分と短縮できた　
摂氏８０度以上に加熱すると応答が低下したがこれは酵
素が熱により失活したためと考えられる。また酵素反応
層を形成する際　乾燥に要する時間法摂氏２５度では２
５分間要したカミ　ドライエアーを流した雰囲気の中で
乾燥すれば摂氏２５度でも１５分間で乾燥し　応答速度
が改善され乾燥温度を摂氏４０度で作製したセンサと同
様の応答特性が得られ九　これは　乾燥気体により水分
の蒸発が促進されたため乾燥が早く、フェリシアン化カ
リウムなどの粒径が細かい状態で形成できたためと考え
られも　ドライエアーの代わりに窒素やアルゴンを流し
ても同様の効果が得られ九　さらに加熱と併用すること
により、摂氏７０度まで加熱しなくても摂氏５０度で５
分間と短時間に乾燥が終了し酵素活性への影響も軽減で
きな　さら番ミ乾燥時間が長くなると酵素反応層が電極
表面から剥離する現象がみられたカミ　乾燥気体を導入
して乾燥時間を短縮することで剥離を防ぐことができ次
く　グルコース標準液の代わりに血液を用いて応答を測
定したとこへ　直線性は変わらなかった力（直線の傾き
が２０％低下した　これ（よ　血球成分が電極付近に付
着して電極反応に影響を与えたり、試料の粘度が高いた
めに応答速度が低下したためと考えられる。しかり、Ｃ
ＭＣを用いないで同様に作製したセンサでζ友　応答が
４０％以上低下し　ばらつきが大きくなっ九　ＣＭＣが
膨潤して血球の影響を小さくするのに効果があると考え
られる。

親水性高分子としてＣＭＣのみを用いたセンサで（戴　
酵素反応層の表面がフェリシアン化カリウムの結晶によ
り粗面状態になり、血液に溶解する除泡の発生がみられ
九　ＣＭＣにゼラチンを混ぜることにより、酵素反応層
の表面がなめらかになり、溶解時に気体が取り残されず
、泡の発生を抑えることができ丸　さらに　センサを乾
燥状態で保存したとこ＆　　ＣＭＣのみではフェリシア
ン化カリウムの結晶にそってひび割れが生じるカミ　ゼ
ラチンを添加することで製膜性が向上したため長期に保
存しても形状の変化はみられなかった　しかし　ゼラチ
ンだけでセンサを形成すると、グルコース水溶液の応答
に対して血液の応答が３０％以上低下し　ばらついた　
これは　ゼラチンがＣＭＣはど膨潤しないためと考えら
れる。このように　親水性高分子としてＣＭＣのように
膨潤するものと、ゼラチンのように製膜性の良いものを
混合して用いることにより、血球の影響を小さくし泡な
どの形成も防げるため測定精度のよいセンサが製造でき
九　製膜性のよい親水性高分子としてはゼラチンの他に
　ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンあるい
はこれらを混合しても使用でき、これらの０．１ｗｔ％
以下の低濃度の水溶液を加えるだけで効果が得られ九　
また　膨潤性の高い親水性高分子として、ポリアクリル
酸ナトリウムや寒天がＣＭＣと同様の効果がみられたこ
れらの高分子は容易に水溶液とすることができるので、
適当な濃度の水溶液を塗布　乾燥することにより、必要
な厚さの薄膜を形成することができも な耘　本発明のバイオセンサは上記実施例に示したグル
コースセンサに限らず、アルコールセンサやコレステロ
ールセンサなど、酸化還元酵素の関与する系に用いるこ
とができる。酸化還元酵素として実施例ではグルコース
オキシダーゼを用いた力（他の酵泰　たとえばアルコー
ルオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼミ　牛サ
ンチンオキシダーゼ等を用いることができる。また　電
子受容体として、上記実施例に用いたフェリシアン化カ
リウムが安定に反応するので適しているがＰ−ベンゾキ
ノンを使えば　反応速度が大きいので高速化に適してい
る。まｆ、２．６−シクロロフエノールインドフエノー
ノｋ　メチレンブルー、フェナジンメトサルフェート、
　β−ナフトキノン４−スルホン酸カリウベ　フェロセ
ン等が使用できる 発明の効果 このように本発明のバイオセンサ（よ　絶縁性の基板上
に電極系を印刷よ　酸化還元酵素と電子受容体および複
数の親水性高分子からなる混合溶液を塗布乾燥して酵素
反応層を形成することにより、極めて容易に生体試料中
の被測定物質の濃度を測定することができ、測定精度を
向上させたものであも　酵素反応層（よ　酵素と電子受
容体が近接ししかも短時間で形成することにより、電子
受容体であるフェリシアン化カリウムが微粒となり、反
応速度が向上し丸　製造工程についても簡略化できた　
さらに　膨潤しやすい親水性高分子と製膜性のよい親水
性高分子を用いることにより、血球の影響や泡の形成を
防ぎ測定精度も向上でき九

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の一実施例のバイオセンサの一部断面斜
視医　第２図は同バイオセンサの縦断面図　第３図は従
来例のバイオセンサの縦断面図であ４ １・・・絶縁性の基板　２・・・測定機　３・・・対振
４・・・絶縁皿　８・・・酵素反応凰 代理人の氏名　弁理士　小鍜治　明　はか２名第２図 第３図 ！ 絹練牲の３抜 ８−ｍ−酵素　反広　１

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）少なくとも測定極と対極からなる電極系を設けた
   絶縁性の基板を備え前記電極系の表面に酸化還元酵素、
   電子受容体および複数種の親水性高分子からなる酵素反
   応層を設け、前記酸化還元酵素および電子受容体と試料
   液中の被測定物質との反応に際しての物質濃度変化を電
   気化学的に前記電極系で検知し前記試料液中の被測定物
   質濃度を測定するバイオセンサ。
2. （２）酵素反応層中の親水性高分子がカルボキシメチル
   セルロース、ポリアクリル酸ナトリウム、寒天よりなる
   親水性高分子の群とポリビニルアルコール、ゼラチン、
   ポリビニルピロリドンよりなる親水性高分子の群との中
   からおのおの１種以上の親水性高分子を選択した２種以
   上の親水性高分子の組み合せからなる請求項１記載のバ
   イオセンサ。
3. （３）絶縁性の基板上に少なくとも測定極と対極からな
   る電極系を設け、この電極系上に親水性高分子溶液を塗
   布し、その上に酸化還元酵素、電子受容体、複数種の親
   水性高分子を含む溶液を塗布、乾燥して酵素反応層を形
   成することを特徴とするバイオセンサの製造法。
4. （４）酵素反応層は摂氏３０度から摂氏７０度の温度で
   乾燥することを特徴とする請求項３記載のバイオセンサ
   の製造法。
5. （５）酵素反応層を乾燥気体中で形成することを特徴と
   する請求項３記載のバイオセンサの製造法。