JPH0262952A

JPH0262952A - バイオセンサ及びその製造方法

Info

Publication number: JPH0262952A
Application number: JP63080842A
Authority: JP
Inventors: Mariko Kawaguri; 真理子河栗; Mayumi Fujita; 真由美藤田; Shiro Nankai; 史朗南海; Takashi Iijima; 孝志飯島
Original assignee: Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Panasonic Holdings Corp
Priority date: 1988-01-29
Filing date: 1988-03-31
Publication date: 1990-03-02
Anticipated expiration: 2011-05-29
Also published as: JP2502666B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】産業上利用分野本発明は、種々の微量の生体試料中の特定成分について
、試ＦＪ液を希釈することなく迅速かつ簡便に定量する
ことのできるバイオセンサおよびその製造方法に関する
。

従来の技術従来、血液などの生体試料中の特定成分について、試料
液の希釈や攪拌などを行なう事なく簡易に定員しうる方
式として、特開昭６１−２９４３５１号公報に記載のバ
イオセンサを提案した（第４図）。

このバイオセンサは、絶縁性の基板１上にスクリーン印
刷等の方法でカーボンなどからなる電極系２、　３．　
４を形成し、この上を酸化還元酵素と電子受容体を担持
した多孔体９で覆い保持枠８とカバー１０で全体を一体
化したものである。試料液を多孔体上へ滴下すると、多
７１体に担持されている酸化還元酵素と電子受容体が試
料液に溶解し、試料液中の基質との間で酵素反応が進行
し電子受容体が還元される。反応終了後、このとき得ら
れる酸化電流値から試料液中の基質濃度を求める。

発明が解決しようとする課題この様な従来の構成では、電極系を含む基板面の濡れが
必ずしも一様とならないため、多孔体と基板との間に気
泡が残り応答電流に影響を与えたり、反応速度が低下し
た。また、電極に吸着し易い物質が試料液中にあると、
応答が低下した。

課題を解決するための手段本発明は上記課題を解決するために、絶縁性の基板上に
少なくとも測定極と対極からなる電極系を設ζす、酵素
と電子受容体と試料液の反応に際しての物質濃度変化を
電気化学的に前記電極系で検知し、試料液中の基質濃度
を測定するバイオセンサにおいて、面記電極系の表面に
酸化還元酵素と親水性高分子からなる酵素層を設け、そ
の上部に電子受容体層を形成したものである。

作用本発明によれば、電極系をも含めたディスポーザブルタ
イプのバイオセンサを構成することができ、試料液をセ
ンサに添加することにより、極めて容易に基質濃度を測
定することができる。しかも、電極系の表面に直接、酵
素層及び電子受容体層を形成することにより、独立した
２層が接近して容易に形成されるため小型化が可能とな
り、反応も迅速に行なわれ、さらに、酵素層の親水性高
分子により試料中の固形成分や蛋白質が電極表面に吸着
するのを防ぎ、電極表面のぬれ性を向上して精度の良い
測定が可能となった。

また、電子受容体層の作製に有機溶媒を用いることによ
り早く薄い層ができ、さらに、界面活性剤を加えること
により、有機溶媒にうまく電子受容体を分散させ、製造
を簡易にし、より強固な層が形成できた。

実施例以下、本発明の一実施例について説明する。

（実施例１）バイオセンサの一例として、グルコースセンサについて
説明する。第１図は、グルコースセンサの一実施例につ
いて示したもので、構成部分の分解図である。ポリエチ
レンテレフタレートからなる絶縁性の基板１に、スクリ
ーン印刷により導電性カーボンペーストを印刷し、加熱
乾燥することにより、対極２、測定極３、参照極４から
なる電極系を形成する。次に電極系を部分的に覆い、各
々の電極の電気化学的に作用する部分となる２′３’４
’（各１ｍｍ２）を残すように、絶縁性ペーストを前記
と同様に印刷し、加熱処理をして絶縁Ｎ５を形成する。

この電極系（２’　　３’、４′）の表面を覆うように
セルロース系の親水性高分子の一種であるＣＭＣ（カル
ボキシメチルセルロース）の水溶液を塗布し、４５℃で
３０分乾燥した。

得られたＣＭＣ層の上に酸化還元酵素としてグルコース
オキシダーゼ（ＣＯＤ）をｐＨ５，６のリン酸緩衝液に
溶解したものを塗布した後、室温で乾燥し、酵素層であ
るＣＭＣ，−ＧＯＤ層６を得た。この操作により、ＣＭ
Ｃ層が一部溶解してＣＯＤと混合した状態のＣＭＣ−Ｃ
ｏＤ層が形成された。

その上に有機溶媒としてトルエンに電子受容体であるフ
ェリシアン化カリウムの微結晶を混ぜたものを滴下し、
室温で放置してトルエンを気化させることによりフェリ
シアン化カリウム層を形成した。フェリシアン化カリウ
ムの水溶液をＣＯＤ−ＣＭＣ層に滴下して乾燥してもフ
ェリシアン化カリウムの層は形成される。しかし、ＣＯ
Ｄを塗布しているため、高温の乾燥ができず、乾燥に時
間がかがりフェリシアン化カリウムの結晶が大きくなり
溶解速度が遅いため反応速度が遅くなった。

上記に用いたフェリシアン化カリウム微結晶の粒径ζこ
ついては、市販のフェリシアン化カリウムの結晶を粉砕
し、ふるいにより所定の粒径のものを集めてフェリシア
ン化カリウム層を形成し、各種の粒径のもので作成した
センサについて応答を比較した。第３図は、横軸にふる
いのメツシュの大きさ、縦軸にグルコース４００ｍｇ／
ｄｌに対する反応終了時間を示した。（）の中は穴の径
（μｍ）を表わしている。第３図むこ示すように細かい
粒径の方が速やかに溶は反応終了に必要な時間が短かっ
た。１４５メツシユ（日本工業規格）を通過したフェリ
シアン化カリウム（粒径１１００Ｊａ以下）で作製した
センサは、２分以内に反応が終了した。さらに、フェリ
シアン化カリウム層を作製するどき粒径が小さい方が均
一に膜ができ応答のばらつきが少なかった。フェリシア
ン化カリウムの微結晶は粉砕でも作製できるが、フェリ
シアン化カリウムの水溶液をエタノール中で再結晶させ
ると簡易に１０μｍ以下の粒径が作成でき、フェリシア
ン化カリウム層を形成させると密な膜となり、反応終了
時間も１分３０秒まで短縮できた。

１００μｍ以下に微粒化したフェリシアン化カリウムを
トルエンに混ぜて滴下すると、トルエンがすみやかに気
化し、微粒子のままのフェリシアン化カリウム層が形成
でき、溶解速度も速く迅速に測定できた。さらに、溶液
状態のフェリシアン化カリウムとＣＯＤは反応して保存
特性が悪くなる欠点があったが、有機溶媒、をもちいる
ことにより、ＣＯＤが溶解せずに、フェリシアン化カリ
ウムの層が形成でき、ＣＯＤとの反応が抑制できた。

上記のように構成したグルコースセンサに試料液として
グルコース標準液を１０μｍ滴下し、２分後に参照極を
基準にして測定極に７ノード方向へ＋０．６■のパルス
電圧を印加し５秒後の電流を測定する。グルコース標準
液にフェリシアン化カリウムが溶解し、これがＣＭＣ−
Ｃ０Ｄ層に達してグルコースが酸化され、このときフェ
リシアン化カリウムがフェロシアン化カリウムに還元さ
れる。そこで、上記のパルス電圧の印加により、生成し
たフェロシアン化カリウムの濃度に基づく酸化電流が得
られ、この電流値は基質であるグルコースの濃度に対応
する。グルコースの標準液を滴下し応答電流を測定した
ところ５００ｍｇ／ｄｌという高濃度まで良好な直線性
が得られた。

上記のグルコースセンサに血液サンプルを１０μｍ滴下
して２分後の応答電流を測定すると、非常に再現性のよ
い応答が得られた。フェリシアン化カリウムを担持した
バルブをＣＭＣ−ＧＯＤＦ’の上へ置くと、応答電流が
低下し、反応終了までに５分以上要した。これは、フェ
リシアン化カリウムが試料液に溶けてＣＭＣ−Ｃ０Ｄ層
に達する前に血球などが混入して反応を妨げていると考
えられる。しかし、ＣＭＣ−Ｃ０Ｄ層の上に直接フェリ
シアン化カリウム層を形成することで試料液がくると速
やかに反応が始まって２分で終了した。

ＣＭＣＮがあることにより、液が滴下されるとＣＭＣ層
が膨潤し、電流がスムーズに流れた。Ｇ。

Ｄを電極表面に直接量ると電極表面に吸着され応答が低
下するが、予めＣＭＣ層を設けることによりＣＯＤの吸
着も防く、ことができた。ＣＯＤ−ＣＭＣ層とフェリシ
アン化カリウム層は、電極上に単に塗布するだけで作成
でき、担持する材料や濾過膜などを必要としないためセ
ンサを大量生産する際、非常にメリットがあると考えら
れる（実施例２）実施例１に示したようにしてＣＭＣ−ＣＯＤ層を形成し
た後、フェリシアン化カリウム層を形成する際トルエン
に界面活性剤としてレシチン（ホスファチジルコリン）
を溶解して１ｗｔ％溶液を調製し、これにフェリシアン
化カリウムの微結晶を混ぜたものを用いてフェリシアン
化カリウムとレシチンの層を形成した。レシチンの濃度
が０．０１ｗｔ％以上になるとフェリシアン化カリウム
がうまくトルエン中で分散したため滴下が容易となり、
３μｍの微量な液でも薄膜状のフェリシアン化カリウム
−レシチン層が形成できた。レシチンがない場合は、フ
ェリシアン化カリウム層が不均一に形成されたり基板を
まげるとはがれるという欠点が見られたが、レシチンを
添加することにより均一ではがれにくいフェリシアン化
カリウム層が容易に形成できた。レシチンの濃度が高く
なるとともに、フェリシアン化カリウム層がはがれにく
くなるが、フェリシアン化カリウムの溶解速度も落ちる
ため、０．０１−３ｗ　ｔ％が適当と考えられる。上記
センサにグルコース標準液を滴下して実施例１と同様に
して応答を測定したところ、グルコース濃度５００ｍｇ
／　ｄ　１まで直線性が得られた。さらに、血液を滴下
したところ、レシチン層によりすみやかにひろがり反応
が始まったため、６μｍという＠量のサンプルでも再現
性のよい応答が得られた。レシチンのかわりにポリエチ
レングリコールアルキルフェニルエーテル（商品名：　
トリトンＸ）を用いたところ、フェリシアン化カリウム
の微粒子をトルエン中に分散させるためには　０．１ｚ
以上必要であったが、レシチンと同様に良好なフェリシ
アン化カリウム層が形成できた。界面活性剤としては、
前記の例の他に、オレイン酸やポリオキシエチレングリ
セリン脂肪酸エステルやシクロデキストリンなど、電子
受容体を有機溶媒に分散させ、かつ酵素活性に影響なお
、よぼさないものであれば、特に制限されることはない
。

親水性高分子としてＣＭＣの他にもゼラチンやメチルセ
ルロースなども使用でき、てんふん系、カルボキシメチ
ルセルロース系、ゼラチン系、アクリル酸塩系、ビニル
アルコール系、ビニルピロリドン系、無水マレイン酸系
のものが好ましい。

これらの高分子は容易に水溶液とすることができるので
、適当な濃度の水溶液を塗布、乾燥することにより、必
要な厚さの薄膜を電極上に形成することができる。

電子受容体を混合する有機溶媒としては、トルエンや石
油エーテルなと、ＣＯＤ活性および印刷電極への影響の
少ないものであればよい。

電極系を形成する方法としてのスクリーン印刷は、均一
な特性を有するディスポーザブルタイプのバイオセンサ
を安価に製造することができ、特に、価格が安く、しか
も安定した電極材料であるカーボンを用いて電極を形成
するのに好都合な方法である。上記実施例においては電
極系として３電極力式の場合について述べたが、対極と
測定極からなる２電極力式でも測定は可能である。

なお、本発明のバイオセンサは上記実施例に示したグル
コースセンサに限らず、アルコールセンサやコレステロ
ールセンサなと、酸化還元酵素の関与する系に用いるこ
とができる。酸化還元酵素として実施例ではグルコース
オキシダーゼを用いたが、他の酵素、たとえばアルコー
ルオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、キサン
チンオキシダーゼ、等を用いることができる。また、電
子受容体として、上記実施例に用いたフェリシアン化カ
リウムが安定に反応するので適しているがＰ−ヘンゾキ
ノンを使えば、反応速度が大きいので高速化に適してい
る。また、　２．６−シクロロフエノールインドフエノ
ール、メチレンブルーフェナジンメトサルフェート、β
−ナフトキノン４−スルホン酸カリウム、フェロセン等
が使用できる発明の効果このように本発明のバイオセンサは、絶縁性の基板上に
電極系を印刷し、酸化還元酵素と親水性高分子からなる
酵素層と電子受容体層を形成することにより、極めて容
易に生体試料中の基質濃度を測定することができ、試料
中のタンパク質などの妨害物質が電極表面に吸着するの
を親水性高分子で防ぎ、測定精度を向上させたものであ
る。ざらに、本発明の製造方法は、酸化還元ｅ素と電子
受容体を独立させながら担持して近接できるため速やか
に反応ができ迅速な測定を可能にした。また、電子受容
体層を形成するとき界面活性剤を添加することにより、
ｔｉｌｔの電子受容体を均一にかつはがれにくい薄膜層
に担持てき、１呆存性や大潰生産に大きな効果がある。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の一実施例のバイオセンサの斜視図、第
２図は同バイオセンサの縦断面図、第３図は同バイオセ
ンサの応答特性図、第４図は従来例のバイオセンサの斜
視図である。！・・・絶縁性基板、２・・・対極、３・・・測定極、
４・・・参照極、５・・・絶縁層、６・・・ＣＭＣ−Ｃ
０Ｄ層、７・・・フェリシアン化カリウム層、８・・・
保持枠、９・・・多孔体、１０・・・カバー代理人の氏名　弁理士　中尾敏男　はか１名菓　ｌ范　２図／−−一兇琢挽基板２−ｍ一対極〈３−−−　ラＸ’ｌ　　ヱピ：Ａ字〉（４−ネ３＋１
！、糧５・−糸色瓢１層６−ＣＭＣ−６ＤＤ層 γ−７ニワシアンイしカワウム層図

Claims

【特許請求の範囲】

（１）少なくとも測定極と対極からなる電極系を設けた
絶縁性の基板を備え、前記電極系の表面に酸化還元酵素
と親水性高分子からなる酵素層を設け、その上部に電子
受容体層を形成し、前記酵素と電子受容体と試料液の反
応に際しての物質濃度変化を電気化学的に前記電極系で
検知し前記基質濃度を測定することを特徴とするバイオ
センサ。
（２）少なくとも測定極と対極からなる電極系を設けた
絶縁性の基板を備え、前記電極系の表面に酸化還元酵素
と親水性高分子からなる酵素層を設け、その上部に界面
活性剤を含有した電子受容体層を形成し、前記酵素と電
子受容体と試料液の反応に際しての物質濃度変化を電気
化学的に前記電極系で検知し前記基質濃度を測定するこ
とを特徴とするバイオセンサ。
（３）電極系が、絶縁性の基板上にスクリーン印刷で形
成されたカーボンを主体とする材料からなる請求項１ま
たは２に記載のバイオセンサ。
（４）親水性高分子が、デンプン系、カルボキシメチル
セルロース系、ゼラチン系、アクリル酸塩系、ビニルア
ルコール系、ビニルピロリドン系、無水マレイン酸系か
ら選択された一つの系の物質もしくは二種以上の系の混
合物である請求項１または２に記載のバイオセンサ。
（５）電子受容体層が、粒径が１００μｍ以下の電子受
容体の微粒子からなる請求項１または２に記載のバイオ
センサ。
（６）絶縁性の基板上に電極系を作製し、前記電極上に
、親水性高分子および酸化還元酵素を塗布し、乾燥して
酵素層を形成後、電子受容体と有機溶媒の混合物を前記
酵素層の上に展開し有機溶媒を除去して電子受容体層を
形成させるバイオセンサの製造方法。
（７）絶縁性の基板上に電極系を作製し、前記電極上に
、親水性高分子および酸化還元酵素を塗布し、乾燥して
酵素層を形成後、電子受容体と界面活性剤と有機溶媒の
混合物を前記酵素層の上に展開し有機溶媒を除去して電
子受容体層を形成させるバイオセンサの製造方法。