JP2002340838A - アルコール測定方法、並びにそれに用いる試薬系キット及びバイオセンサ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 試料中に含まれる広い濃度範囲のアルコール
を、試料の希釈を必要とせず、迅速、簡便、高感度かつ
正確に定量または検出することができるアルコール測定
方法、並びにそれに用いる試薬系キット及びバイオセン
サを提供する。 【解決手段】 １つまたは複数の絶縁性の基板１、前記
基板１上に配置された作用極４及び対極５を含む電極
系、並びに少なくともアルコールデヒドロゲナーゼまた
はアルコールオキシダーゼ、及びアミノ残基、Ｎ−誘導
化アミノ残基またはＮ，Ｎ−誘導化アミノ残基を有する
化合物を包含する試薬系７を備えたことを特徴とするバ
イオセンサ。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、試料中に含まれる
広い濃度範囲のアルコールを、迅速、簡便、高感度かつ
正確に定量または検出することができるアルコール測定
方法、並びにそれに用いる試薬系キット及びバイオセン
サに関する。

【０００２】

【従来の技術】試料中に含まれるアルコールの簡易な定
量を実現させることを目的として、近年、酵素が有する
特異的触媒作用を利用した種々の測定方法が開発されて
いる。アルコール濃度の簡便な測定法は、特に、酒類、
発酵製品及び食品を製造する企業からの需要が高い。

【０００３】以下に、試料中のアルコールを定量する方
法の一例について説明する。電気化学的なアルコールの
定量法としては、アルコールデヒドロゲナーゼ（以下、
ＡＤＨと略称する）、及びニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチド（以下、ＮＡＤと略称する）を、電子伝達体
と電極とともに用いる方法が一般的によく知られている
（例えば、Ｈ． Ｙｏｎｅｙａｍａら、Ｒｅｖ． Ｐｏ
ｌａｒｏｇｒ． Ｊｐｎ、１９９４、４０、７０）。Ａ
ＤＨは、ＮＡＤまたはニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチドリン酸（以下、ＮＡＤＰと略称する）の存在下、
基質であるアルコールを選択的に酸化する酵素である。
基質が１級アルコールの場合、対応するアルデヒドが生
成物として与えられ、２級アルコールの場合、対応する
ケトンが生成物として与えられる。このＡＤＨによるア
ルコールの酸化反応過程において、ＮＡＤまたはＮＡＤ
Ｐは還元され、それぞれＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨが生
成する。生成したＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを酸化型の
電子伝達体によって酸化し、還元型の電子伝達体を得
る。得られた還元型の電子伝達体を電極で酸化し、この
とき流れる電流を測定する。以上の機構から容易に想像
できる通り、通常、アルコール濃度が高いほど電流は大
きくなるので、得られた電流の大きさから試料中のアル
コール濃度を見積ることが可能である。

【０００４】アルコールオキシダーゼ（以下、ＡＯｘと
略称する）を酵素として用いた場合、ＮＡＤＨ及びＮＡ
ＤＰＨは不要である。ＡＯｘの自然界における電子伝達
体である酸素またはＡＯｘに対する人工の電子伝達体を
用い、それぞれの還元体を電極において酸化することに
より得られる電流を、ＡＤＨの場合と同様に試料中のア
ルコール濃度の指標として用いることができる。なお、
ＡＤＨには、上記ＮＡＤ、及びＮＡＤＨ依存型以外に、
ピロロキノリンキノン（以下、ＰＱＱと略称する）を捕
因子として蛋白中に保持したＰＱＱ依存型ＡＤＨ（以
下、ＰＱＱ−ＡＤＨと略称する）が存在するが、この酵
素を用いる場合にも、ＡＯｘと同様の方法を用いた測定
ができる。

【０００５】以上に示した酵素などの試薬の全てまたは
一部は、試料液中に添加する方式で溶存させてもよい
が、測定に必要な試薬を全て乾燥状態に近い状態で電極
系と一体化させることも可能である。これにより、得ら
れる電極系は取り扱いの簡便なアルコールセンサとし
て、アルコールの定量に用いることができる。

【０００６】電子伝達体のかわりに、アルコールの酸化
反応の進行に伴い色素を生成するような、色素源となる
化合物を溶存させ、生成色素量を分光学的に調べること
によっても、アルコール濃度の定量を行うことができ
る。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】上記のような測定法及
びセンサを用いることによって、測定可能な濃度の上限
を０．０５Ｍ程度とするアルコール濃度の定量が実現さ
れている。しかしながら、アルコールの定量法に対する
需要が高い酒造業界において望まれている測定可能濃度
の上限は、少なくとも１．０Ｍ以上である。例えば、ビ
ールの製造工程でのアルコール度数管理においては、一
般にアルコール度数５．０％、すなわちエタノール濃度
１．１Ｍ程度の定量が求められる。試料を抽出し、溶媒
にて希釈した後、定量に供することも可能であるが、そ
の場合、定量の簡便性は実現されない。

【０００８】ＡＤＨ及びＡＯｘを用いた酵素反応におい
ては、生成物から反応基質への逆反応（還元反応）が存
在し、アルコールの酸化反応は完全に正反応側へとは進
行せず、酵素反応は平衡状態を示すことが明らかにされ
ている（例えば、堀越弘毅ら、酵素・科学と工学、第５
章）。すなわち、試料中に存在するアルコールの一部は
酸化されずに反応は見かけ上停止する。これに伴い、特
に高アルコール濃度においては、アルコール濃度を増大
させても、還元型電子伝達体の生成濃度がほぼ一定とな
る傾向が見られるものと考えられる。その結果、従来の
測定法においては、比較的低いアルコール濃度でアルコ
ールの酸化電流が飽和し、定量可能濃度の上限が低くな
るという問題が生じていた。

【０００９】本発明は、上記従来の問題点に鑑み、試料
中に含まれる広い濃度範囲のアルコールを、試料の希釈
を必要とせず、迅速、簡便、高感度かつ正確に定量また
は検出することができるアルコール測定方法、並びにそ
れに用いる試薬系キット及びバイオセンサを提供するこ
とを目的とする。

【００１０】

【課題を解決するための手段】上記課題を解決するた
め、本発明のアルコール測定方法は、試料液中のアルコ
ールを定量または検出する方法であって、少なくともア
ルコールデヒドロゲナーゼまたはアルコールオキシダー
ゼ、及びアミノ残基、Ｎ−誘導化アミノ残基またはＮ，
Ｎ−誘導化アミノ残基を有する化合物を包含する試薬系
を用い、前記試料液と前記試薬系とを反応させる工程
Ａ、及び前記工程Ａにおいて生じた、アルコールの酸化
量に基づく信号を測定する工程Ｂを含むことを特徴とす
る。

【００１１】また、本発明の試薬系キットは、上記のア
ルコール測定方法に用いる試薬系キットであって、少な
くともアルコールデヒドロゲナーゼまたはアルコールオ
キシダーゼ、及びアミノ残基、Ｎ−誘導化アミノ残基ま
たはＮ，Ｎ−誘導化アミノ残基を有する化合物を包含す
る試薬系を含むことを特徴とする。

【００１２】また、本発明のバイオセンサは、上記のア
ルコール測定方法に用いるバイオセンサであって、１つ
または複数の絶縁性の基板、前記基板上に配置された作
用極及び対極を含む電極系、並びに少なくともアルコー
ルデヒドロゲナーゼまたはアルコールオキシダーゼ、及
びアミノ残基、Ｎ−誘導化アミノ残基またはＮ，Ｎ−誘
導化アミノ残基を有する化合物を包含する試薬系を備え
たことを特徴とする。

【００１３】

【発明の実施の形態】本発明の一実施の形態におけるア
ルコール測定方法は、試料液中のアルコールを定量また
は検出する方法であって、少なくともアルコールデヒド
ロゲナーゼまたはアルコールオキシダーゼ、及びアミノ
残基、Ｎ−誘導化アミノ残基またはＮ，Ｎ−誘導化アミ
ノ残基を有する化合物を包含する試薬系を用い、前記試
料液と前記試薬系とを反応させる工程Ａ、及び前記工程
Ａにおいて生じた、アルコールの酸化量に基づく信号を
測定する工程Ｂを含むことを特徴とする。

【００１４】ここで、試薬系に、アルコールの酸化に伴
い呈色する化合物をさらに包含し、工程Ｂにおいて、試
料液の吸光度を測定することが好ましい。

【００１５】アルコールの酸化に伴い呈色する化合物と
しては、例えば、酸素存在下でアルコールが酸化される
際に生じる過酸化水素と反応して色素を形成する物質が
挙げられる。これらの物質を試薬系に包含させ、試料と
の反応により生成した色素量を分光学的に測定すること
によって、アルコールの定量を行うことができる。この
場合、フェノール及び４−アミノアンチピリンの組み合
わせに代表される、いわゆる「Ｔｒｉｎｄｅｒ試薬」を
ペルオキシダーゼとともに包含させる方法が例として挙
げられる。また、アルコールの酸化に伴い呈色する化合
物としては、ＰＱＱ−ＡＤＨ以外のＡＤＨを用いる場合
には、ＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨと直接またはジアフ
ォラーゼを介して反応する呈色試薬を用いることがで
き、一方、ＡＯｘあるいはＰＱＱ−ＡＤＨを用いる場合
には、アルコールを酸化したＡＯｘあるいはＰＱＱ−Ａ
ＤＨから電子を受容し呈色するような試薬を用いること
ができる。このような試薬の例として、フェリシアン化
物イオン、フェナジニウム及びフェノチアジニウム誘導
体が挙げられる。これらの試薬は、酸化還元によりその
吸収スペクトルに大きな変化を生ずる。

【００１６】本発明の一実施の形態における試薬系キッ
トは、上記のアルコール測定方法に用いる試薬系キット
であって、少なくともアルコールデヒドロゲナーゼまた
はアルコールオキシダーゼ、及びアミノ残基、Ｎ−誘導
化アミノ残基またはＮ，Ｎ−誘導化アミノ残基を有する
化合物を包含する試薬系を含むことを特徴とする。

【００１７】本発明の一実施の形態におけるバイオセン
サは、上記のアルコール測定方法に用いるバイオセンサ
であって、１つまたは複数の絶縁性の基板、前記基板上
に配置された作用極及び対極を含む電極系、並びに少な
くともアルコールデヒドロゲナーゼまたはアルコールオ
キシダーゼ、及びアミノ残基、Ｎ−誘導化アミノ残基ま
たはＮ，Ｎ−誘導化アミノ残基を有する化合物を包含す
る試薬系を備えたことを特徴とする。

【００１８】本発明のバイオセンサにおいて、基板上に
配置されて前記基板との間に電極系への試料液供給路を
形成するカバー部材をさらに備え、試薬系が前記試料液
供給路に露出する部分に設けられていることが好まし
い。

【００１９】また、試薬系に電子伝達体をさらに包含す
ることが好ましい。電子伝達体としては、例えば、フェ
リシアン化物イオン、オスミウム−トリス（ビピリジニ
ウム）やフェロセン誘導体などの金属錯体、ｐ−ベンゾ
キノンなどのキノン誘導体、フェナジンメトサルフェー
トなどのフェナジニウム誘導体、メチレンブルーなどの
フェノチアジニウム誘導体、ＮＡＤ、ＮＡＤＰなどが挙
げられる。この中で、良好な安定性及び速い電子移動反
応速度の点から、フェリシアン化物イオンを用いること
が好ましい。これらの電子伝達体は、ポリマーバックボ
ーンに結合した形態、またはそれ自身の一部もしくは全
部がポリマー鎖を形成するような形態であってもよい。
また、酸素を電子伝達体として用いることも可能であ
る。電子伝達体は、これらの一種または二種以上が使用
される。酵素としてＡＤＨを用いる場合には、ＮＡＤＨ
またはＮＡＤＰＨの酸化を加速するために、ジアフォラ
ーゼを上記電子伝達体とともに用いてもよい。

【００２０】また、本発明のバイオセンサにおいて、試
薬系が、電極系上またはその近傍に設けられていること
が好ましい。

【００２１】本発明のアルコール測定方法、試薬系キッ
ト及びバイオセンサにおいて用いる、アミノ残基、Ｎ−
誘導化アミノ残基またはＮ，Ｎ−誘導化アミノ残基を有
する化合物は、分子内の炭素数が１〜１０であることが
好ましく、例えば、グリシン、アンモニア、セミカルバ
ジド、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、グリシンのＮ
−誘導体及びＮ，Ｎ−誘導体、アンモニアのＮ−誘導体
及びＮ，Ｎ−誘導体、セミカルバジドのＮ−誘導体及び
Ｎ，Ｎ−誘導体、ヒドラジンのＮ−誘導体及びＮ，Ｎ−
誘導体、並びにヒドロキシルアミンのＮ−誘導体及び
Ｎ，Ｎ−誘導体などが挙げられる。これらの化合物は固
体状態、または液体もしくは溶液状態で、試薬系内に包
含させることができる。包含させる状態は、前記化合物
の安定性及び試料へ溶解度によって決定される。

【００２２】本発明のアルコール測定方法、試薬系キッ
ト及びバイオセンサにおいて、試薬系がｐＨ緩衝剤をさ
らに包含することが好ましい。酵素活性は溶液のｐＨに
大きく依存するので、酵素を効率よく機能させるため
に、試料液のｐＨを調整することが重要となる。本発明
において試薬系に包含されるＡＤＨ及びＡＯｘの場合、
前記ｐＨ緩衝剤によって発現されるｐＨが４〜９である
ことが特に好ましい。ｐＨ緩衝剤としては、後述の実施
例に用いるリン酸塩の組み合わせによる緩衝剤の他に、
例えば、リン酸塩、酢酸塩、ホウ酸塩、クエン酸塩、ま
たはフタル酸塩のうち、一種または複数を含む緩衝剤を
用いることができる。また、上記塩の水素塩の一種また
は複数を含む緩衝剤や、いわゆる「グッドの緩衝液」に
用いられる試薬を用いてもよい。これらのｐＨ緩衝剤が
試薬系に含まれる形態は、固体であっても液体であって
もよい。

【００２３】以下、図１及び図２を参照して本発明のバ
イオセンサの構造を説明するが、本発明はこれらのみに
限定されるものではない。

【００２４】図１は、本発明によるバイオセンサの試薬
系を取り除いた分解斜視図である。ポリエチレンテレフ
タレートからなる電気絶縁性の基板１上に、スクリーン
印刷により銀ペーストを印刷し、リード２及び３、なら
びに後述の電極の下地を形成している。次いで、樹脂バ
インダーを含む導電性カーボンペーストを基板１上に印
刷して作用極４を形成している。この作用極４は、リー
ド２と接触している。さらに、この基板１上に絶縁性ペ
ーストを印刷して絶縁層６を形成している。絶縁層６
は、作用極４の外周部を覆っており、これにより作用極
４の露出部分の面積を一定に保っている。そして、樹脂
バインダーを含む導電性カーボンペーストをリード３と
接触するように基板１上に印刷してリング状の対極５を
形成している。

【００２５】上記の基板１に、後述のように試薬系を形
成した後、スリット１０を有するスペーサー８及び空気
孔１１を備えたカバー９を図１の一点鎖線で示すような
位置関係をもって接着することにより、バイオセンサが
作製される。スペーサー８のスリット１０の部分に試料
液供給路が形成される。センサの端部におけるスリット
１０の開放端部は、試料液供給路への試料供給口とな
る。

【００２６】図２は、本発明によるバイオセンサの縦断
面図である。電極系を形成した基板１上に、酵素及び電
子伝達体を含む試薬系７が形成されている。試薬系７
は、電極系上に形成してある。これにより、電極での電
気化学反応に供される電子伝達体の量を実質的により多
くし、より大きな応答酸化電流を得ることができる。試
薬系７は、図示の例では、高分子層７ａと、その上に形
成されたＡＤＨまたはＡＯｘ、電子伝達体、及びアミノ
残基、Ｎ−誘導化アミノ残基またはＮ，Ｎ−誘導化アミ
ノ残基を有する化合物を含有する試薬層７ｂからなる。

【００２７】ここで、高分子層７ａは、その上に試薬系
の溶液を滴下した場合、溶液の保持材として機能するた
め、センサ基板上に試薬系を担持する上で都合が良い。
また、電極系へのタンパク質の吸着などを防止する効果
も得られる。用いられる高分子は、疎水的であっても親
水的であってもよいが、後者がより好ましい。例えば、
親水性の高分子の例として、水溶性セルロース誘導体で
あるカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセ
ルロース、エチルセルロースなど、またはポリビニルア
ルコール、ゼラチン、ポリアクリル酸、デンプンとその
誘導体、無水マレイン酸重合体、メタクリレート誘導体
などが挙げられる。

【００２８】図２に示す構造のセンサの試料液供給路と
なるスリット１０の開放端部に試料液を接触させると、
試料液は、試料液供給路内へ毛細管現象により導入さ
れ、試薬系７を溶解して酵素反応が進行する。このよう
に、電極系を設けた基板１に、スペーサー８及びカバー
９からなるカバー部材を組み合わせて試料液供給路を形
成すると、測定対象となる基質を含む試料液のセンサへ
の供給量を一定にすることができるので、測定の精度を
向上させることができる。

【００２９】このように試料液供給路を設けたセンサに
おいては、試薬系は供給される試料液に溶解するよう
に、電極系上はもちろん試料液供給路内に露出する部分
に設ければよい。例えば、カバー９における試料液供給
路内に露出する部分、基板１上における電極系とは接し
ないが試料液供給路内に露出する部分に設けてもよい。
また、試薬系は、複数に分割して、１つは基板上に、他
の１つはカバー部材側に設けてもよい。その際、各分割
された層は、必ずしも全ての試薬を含む必要はない。例
えば、酸化還元酵素と電子伝達体またはｐＨ緩衝剤を別
々の層に含ませてもよい。

【００３０】また、対極５または作用極４のうちどちら
か一方を、それに対応するリード３または２とともに形
成した絶縁性の第２の基板を、カバー９のかわりに用い
てもよい。この場合も、基板１、スペーサー８及び第２
の基板により試料液供給路が形成されるので、試料液の
センサへの供給量を一定にすることができ、測定の精度
を向上させることができる。

【００３１】また、上記のような試料液供給路を形成せ
ず、基板１のみでセンサを構成することもできる。この
場合は、試薬系は電極系上またはその近傍に設ける。

【００３２】

【実施例】以下、実施例を用いて本発明を説明するが、
本発明はこれらのみに限定されるものではない。

【００３３】（実施例１）ＡＯｘ及びフェリシアン化物
イオンを含む水溶液に、アミノ残基を有する化合物であ
るグリシンを溶解した。得られた溶液を、１ｃｍの光路
長を有する石英製のセルに入れ、フェリシアン化物イオ
ンに起因する４２０ｎｍにおける溶液の吸光度を測定し
た。続いて、その溶液に既知量のエタノールを添加し、
吸光度の経時変化をモニターした。吸光度は時間ととも
に減少した。この結果は、エタノールの酸化がＡＯｘの
作用により進行し、それにともなってフェリシアン化物
イオンが還元され、濃度が減少したことを示唆してい
る。また、吸光度はエタノール添加後約５分でほぼ一定
の値を示し、その値は、エタノール添加前の３０％以下
であった。一方、グリシンを溶解しないで同様の実験を
行ったところ、エタノール添加前の吸光度は、上述のグ
リシン存在下での値と同じであるにもかかわらず、５分
後の値はグリシン存在下におけるそれの約１．２倍であ
った。以上の結果は、グリシンが反応液中に存在するこ
とにより、エタノールの酵素酸化反応の平衡がより生成
物側に傾いていることを示すものである。反応生成物で
あるアセトアルデヒドが、グリシンのアミノ基にすばや
く結合し、他の化合物に変化することにより、上記のよ
うな平衡移動が生じたものと考えられる。エタノール添
加５分後の吸光度を、添加したエタノール濃度に対して
プロットした。吸光度変化の見られるエタノール濃度範
囲の上限は、グリシンを溶存させた系の方が、溶存させ
ない系と比較して、有意により大きい値であった。この
ように、アルデヒドを生成物として与えるアルコールの
酵素酸化反応において、アミノ残基を有する化合物を存
在させることによって、生成物を効果的に除去し、測定
可能濃度の上限の向上を実現することができた。

【００３４】ＡＯｘのかわりにＡＤＨとＮＡＤを用いる
系、ＰＱＱ−ＡＤＨを用いる系においても、同様に、グ
リシンの使用によって、測定可能濃度の上限の向上が得
られる。Ｎ−誘導化アミノ基を有する化合物としてＮ−
メチルグリシンを、Ｎ，Ｎ−誘導化アミノ基を有する化
合物としてジメチルアンモニウムを用いる場合にも、と
もに上記のような上限の向上が見られる。

【００３５】なお、上記実施例においては、反応時間を
５分、セルの光路長を１ｃｍ、測定する吸光度を４２０
ｎｍとしたが、これら測定条件はそれらの値に限定され
ない。

【００３６】（実施例２）基板１の電極系上にカルボキ
シメチルセルロース（以下、ＣＭＣと略称する）のナト
リウム塩の水溶液を滴下し、乾燥することによってＣＭ
Ｃ層７ａを形成した。このＣＭＣ層７ａの上に、ＡＯ
ｘ、電子伝達体であるフェリシアン化カリウム、及びグ
リシンを溶解した水溶液を滴下し、乾燥させることによ
り、試薬層７ｂを形成した。上記の基板にスペーサー８
及びカバー９を組み合わせて図２のようなセンサを作成
した。同様に、グリシンを含まない溶液の滴下を行い作
成したセンサを比較例として用いた。

【００３７】５０及び１００ｍＭのエタノールを含む水
溶液を試料として、センサの試料液供給路の開口部、す
なわちスペーサー８のスリット１０の開放端部に供給し
た。５５秒の反応時間経過後に対極５に対して５００ｍ
Ｖの電圧を作用極４に印加し、その５秒後に流れた電流
値を測定した。比較例のセンサにおいて得られた電流値
は、エタノール濃度が５０及び１００ｍＭの場合でほぼ
同じであった。一方、本実施例のセンサでは、１００ｍ
Ｍで得られた電流値は５０ｍＭのときに得られたそれの
約１．４倍であった。また、エタノール濃度が５０ｍＭ
の試料に対する電流値は、比較例に比べて実施例のバイ
オセンサの方が高い値が得られた。

【００３８】このように、アルコールの酵素酸化反応を
電極系と組み合わせたバイオセンサによるアルコールの
定量においても、アミノ残基を有する化合物を存在させ
ることによって、測定可能濃度の上限の向上及び高感度
化を実現することが可能であった。また、それぞれの電
流値の再現性は非常に良く、試料液供給路によるサンプ
ル量の規定が効果的であることが示唆された。

【００３９】なお、グリシンに代えて、Ｎ，Ｎ−ジメチ
ルヒドラジン、ヒドロキシルアミン、または分子内にア
ミノ残基と１０個の炭素を有するＬ−アラニル−Ｌ−ア
ラニル−Ｌ−アラニンメチルエステルアセテート（Ａ３
−ＭＥＡ）を用いても、本実施例のバイオセンサと同様
の効果が得られた。

【００４０】（実施例３）本実施例では、実施例２にお
いて用いたバイオセンサから、カバー部材であるスペー
サー８及びカバー９を除いたものを使用した。一定量の
試料液を、ピペットを用いて電極系上に滴下し、実施例
２と同様の測定を行った。その結果、本実施例において
も、アミノ残基を有する化合物を存在させることによっ
て、測定可能濃度の上限の向上及び高感度化を実現する
ことが可能であった。ただし、測定により得られた電流
値の再現性は、滴下した試料液のセンサ上での広がりが
不均一となるため、実施例２のバイオセンサの方が良好
であった。

【００４１】（実施例４）本実施例では、イソプロパノ
ールを含む水溶液を試料とし、セミカルバジドをグリシ
ンの代わりに用いて、実施例２に示した方法でセンサを
作成した。試料中のイソプロパノールに対する応答電流
は、実施例２に述べた方法と同様にして測定した。本実
施例においても、セミカルバジドを包含したセンサは、
それを包含しないセンサよりも、有意に高い測定可能濃
度の上限及び感度を示した。このように、ケトンを生成
物として与える２級アルコールの酵素酸化反応において
も、セミカルバジドを存在させることにより、反応の平
衡を生成物側に移動させることが可能であった。この場
合も、生成物がアルデヒドである場合と同様に、ケトン
がセミカルバジドと結合して、溶液から除去される効果
が発現したものと考えられる。

【００４２】（実施例５）ｐＨ緩衝剤を試薬系７内にさ
らに包含させた場合のセンサ特性を評価した。本実施例
において調製したセンサは、ｐＨ緩衝剤としてリン酸水
素二カリウムとリン酸二水素カリウムの混合物を試薬系
７内に担持した以外、実施例２で用いたものと同様であ
る。一定量のエタノールを含む水溶液を試料として、セ
ンサの試料液供給路の開口部、すなわちスペーサー８の
スリット１０の開放端部に供給した。実施例２と同様
に、５５秒後に対極５に対して５００ｍＶの電圧を作用
極４に印加し、その５秒後における電流値を測定した。
１００ｍＭのエタノールを含む試料について得られた電
流値は、５０ｍＭのときに得られたそれの約１．５倍で
あった。このように、試薬系にｐＨ緩衝剤をさらに包含
させた場合であっても、測定可能濃度の上限の向上を実
現することが可能であった。また、エタノール濃度の増
加に対する電流値の増大量は、実施例２で得られた結果
と比較すると、ｐＨ緩衝剤を包含させた本実施例におけ
るセンサの方がより大きくなっている。これは、アルコ
ール酸化の酵素反応の平衡をより生成物側に傾けること
ができるｐＨが、ｐＨ緩衝剤によって与えられたためで
あると考えることができる。さらに、ｐＨの安定により
酵素活性が安定化するため、電流値の再現性が非常に良
くなることが見出された。

【００４３】なお、上記実施例では電極系への印加電圧
を５００ｍＶとしたが、印加電圧はこの値に限定される
ことはない。電子伝達体が作用極において酸化される電
圧であればよい。

【００４４】また、上記実施例では反応時間を５５秒と
したが、これに限定されず、観測可能な大きさの電流を
得ることのできる時間であればよい。また、試料中の基
質の定量における指標は、電気化学反応の進行に伴って
変化する出力であれば、実質的に指標の対象とすること
ができる。例えば、電流を測定する方法以外に、ある時
間における通電電荷量を指標として用いることが可能で
ある。通電電荷量は、時間に対する電流の積分値である
ので、測定対象とする基質の濃度と関連付けることが可
能である。

【００４５】上記試薬系、もしくは試薬系に含まれる試
薬のうち１つまたは複数を作用極に固定化することによ
って、酵素及び電子伝達体を不溶化、または非溶出化さ
せてもよい。固定化する場合は、共有結合法、架橋固定
法、または配位結合や特異的結合性の相互作用を用いた
固定化法を用いることが好ましい。または、酵素及び電
子伝達体を高分子物質によって包摂し、擬似的な固定化
状態を与える方法も、容易な試薬系形成法として有効で
ある。

【００４６】上記実施例においては、電極系の作製方法
としてスクリーン印刷を用いたが、これに限定されな
い。例えば、スパッタリング法、イオンプレーティング
法、蒸着法、化学蒸着法のいずれかで作製した導電性膜
をフォトリソグラフィー及びエッチングと組み合わせて
パターン作製をしてもよい。パターン形成はレーザーに
よる導電性膜のトリミングによっても行うことができ
る。マスクを通したスパッタリング法によって、電極パ
ターンを形成してもよい。さらには、パターン化した導
電性膜をそのまま絶縁性の基板上に接着させてもよい。

【００４７】また、上記実施例においては、電極系の材
料としてカーボンを用いた例を述べたが、金、白金、パ
ラジウムなどの他の電極材料を用いてもよい。

【００４８】これら電極系の形状、配置、個数等は、上
記実施例に示したものに限定されるものではない。例え
ば、作用極と対極を異なる絶縁性の基板上に形成させて
もよいし、それぞれを複数個形成させてもよい。さらに
は、リード／端子の形状、配置、個数等も、上記実施例
に示したものに限定されるものではない。

【００４９】

【発明の効果】以上のように本発明によれば、試料中に
含まれる広い濃度範囲のアルコールを、試料の希釈を必
要とせず、迅速、簡便、高感度かつ正確に定量または検
出することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の一実施の形態におけるバイオセンサの
試薬系を除いた斜視図

【図２】同バイオセンサの要部の縦断面図

【符号の説明】

１ 基板 ２，３ リード ４ 作用極 ５ 対極 ６ 絶縁層 ７ 試薬系 ７ａ 高分子層（ＣＭＣ層） ７ｂ 試薬層 ８ スペーサー ９ カバー １０ スリット １１ 空気孔

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 27/30 ３５３Ｊ ３５３Ｄ (72)発明者 池田 信 大阪府門真市大字門真1006番地 松下電器 産業株式会社内 (72)発明者 南海 史朗 大阪府門真市大字門真1006番地 松下電器 産業株式会社内 Ｆターム(参考） 2G054 AA02 AB03 CA30 CE01 EA04 4B063 QA01 QQ16 QR03 QR04 QR49 QR66 QR82 QS28 QX05

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 試料液中のアルコールを定量または検出
   する方法であって、少なくともアルコールデヒドロゲナ
   ーゼまたはアルコールオキシダーゼ、及びアミノ残基、
   Ｎ−誘導化アミノ残基またはＮ，Ｎ−誘導化アミノ残基
   を有する化合物を包含する試薬系を用い、前記試料液と
   前記試薬系とを反応させる工程Ａ、及び前記工程Ａにお
   いて生じた、アルコールの酸化量に基づく信号を測定す
   る工程Ｂを含むことを特徴とするアルコール測定方法。
2. 【請求項２】 試薬系に、アルコールの酸化に伴い呈色
   する化合物をさらに包含し、工程Ｂにおいて、試料液の
   吸光度を測定することを特徴とする、請求項１記載のア
   ルコール測定方法。
3. 【請求項３】 請求項１または２記載のアルコール測定
   方法に用いる試薬系キットであって、少なくともアルコ
   ールデヒドロゲナーゼまたはアルコールオキシダーゼ、
   及びアミノ残基、Ｎ−誘導化アミノ残基またはＮ，Ｎ−
   誘導化アミノ残基を有する化合物を包含する試薬系を含
   むことを特徴とする試薬系キット。
4. 【請求項４】 請求項１記載のアルコール測定方法に用
   いるバイオセンサであって、１つまたは複数の絶縁性の
   基板、前記基板上に配置された作用極及び対極を含む電
   極系、並びに少なくともアルコールデヒドロゲナーゼま
   たはアルコールオキシダーゼ、及びアミノ残基、Ｎ−誘
   導化アミノ残基またはＮ，Ｎ−誘導化アミノ残基を有す
   る化合物を包含する試薬系を備えたことを特徴とするバ
   イオセンサ。
5. 【請求項５】 基板上に配置されて前記基板との間に電
   極系への試料液供給路を形成するカバー部材をさらに備
   え、試薬系が前記試料液供給路に露出する部分に設けら
   れたことを特徴とする、請求項４記載のバイオセンサ。
6. 【請求項６】 試薬系に電子伝達体をさらに包含するこ
   とを特徴とする、請求項４または５記載のバイオセン
   サ。
7. 【請求項７】 試薬系が、電極系上またはその近傍に設
   けられたことを特徴とする、請求項４〜６のいずれかに
   記載のバイオセンサ。
8. 【請求項８】 アミノ残基、Ｎ−誘導化アミノ残基また
   はＮ，Ｎ−誘導化アミノ残基を有する化合物の分子内の
   炭素数が１〜１０であることを特徴とする、請求項１ま
   たは２記載のアルコール測定方法。
9. 【請求項９】 アミノ残基、Ｎ−誘導化アミノ残基また
   はＮ，Ｎ−誘導化アミノ残基を有する化合物の分子内の
   炭素数が１〜１０であることを特徴とする、請求項３記
   載の試薬系キット。
10. 【請求項１０】 アミノ残基、Ｎ−誘導化アミノ残基ま
    たはＮ，Ｎ−誘導化アミノ残基を有する化合物の分子内
    の炭素数が１〜１０であることを特徴とする、請求項４
    〜７のいずれかに記載のバイオセンサ。
11. 【請求項１１】 アミノ残基、Ｎ−誘導化アミノ残基ま
    たはＮ，Ｎ−誘導化アミノ残基を有する化合物が、グリ
    シン、アンモニア、セミカルバジド、ヒドラジン、ヒド
    ロキシルアミン、グリシンのＮ−誘導体及びＮ，Ｎ−誘
    導体、アンモニアのＮ−誘導体及びＮ，Ｎ−誘導体、セ
    ミカルバジドのＮ−誘導体及びＮ，Ｎ−誘導体、ヒドラ
    ジンのＮ−誘導体及びＮ，Ｎ−誘導体、並びにヒドロキ
    シルアミンのＮ−誘導体及びＮ，Ｎ−誘導体からなる群
    から選択されることを特徴とする、請求項８記載のアル
    コール測定方法。
12. 【請求項１２】 アミノ残基、Ｎ−誘導化アミノ残基ま
    たはＮ，Ｎ−誘導化アミノ残基を有する化合物が、グリ
    シン、アンモニア、セミカルバジド、ヒドラジン、ヒド
    ロキシルアミン、グリシンのＮ−誘導体及びＮ，Ｎ−誘
    導体、アンモニアのＮ−誘導体及びＮ，Ｎ−誘導体、セ
    ミカルバジドのＮ−誘導体及びＮ，Ｎ−誘導体、ヒドラ
    ジンのＮ−誘導体及びＮ，Ｎ−誘導体、並びにヒドロキ
    シルアミンのＮ−誘導体及びＮ，Ｎ−誘導体からなる群
    から選択されることを特徴とする、請求項９記載の試薬
    系キット。
13. 【請求項１３】 アミノ残基、Ｎ−誘導化アミノ残基ま
    たはＮ，Ｎ−誘導化アミノ残基を有する化合物が、グリ
    シン、アンモニア、セミカルバジド、ヒドラジン、ヒド
    ロキシルアミン、グリシンのＮ−誘導体及びＮ，Ｎ−誘
    導体、アンモニアのＮ−誘導体及びＮ，Ｎ−誘導体、セ
    ミカルバジドのＮ−誘導体及びＮ，Ｎ−誘導体、ヒドラ
    ジンのＮ−誘導体及びＮ，Ｎ−誘導体、並びにヒドロキ
    シルアミンのＮ−誘導体及びＮ，Ｎ−誘導体からなる群
    から選択されることを特徴とする、請求項１０記載のバ
    イオセンサ。
14. 【請求項１４】 試薬系がｐＨ緩衝剤をさらに包含する
    ことを特徴とする、請求項１、２、８及び１１のいずれ
    かに記載のアルコール測定方法。
15. 【請求項１５】 試薬系がｐＨ緩衝剤をさらに包含する
    ことを特徴とする、請求項３、９及び１２のいずれかに
    記載の試薬系キット。
16. 【請求項１６】 試薬系がｐＨ緩衝剤をさらに包含する
    ことを特徴とする、請求項４〜７、１０及び１３のいず
    れかに記載のバイオセンサ。