JPH10282037A - 生体成分中の基質の定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 生体成分中に共存する基質以外の成分による
影響のない基質の定量法を提供する。 【解決手段】 電気絶縁性の基板上に作用極と対極から
なる電極系を形成し、電極系上に親水性高分子と酵素と
電子受容体を含む反応層を形成したバイオセンサを用
い、作用極と対極の間に電圧を印加する時間を１秒以上
５秒以下の一定時間にすることにより、 生体成分中に
共存する基質以外の成分の影響をなくす。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、生体試料中の特定
成分について、バイオセンサを用いて定量するための定
量法に関する。

【０００２】

【従来の技術】基質の定量法の一例として、グルコース
の定量法について説明する。電気化学的にグルコースを
定量する方法としては、グルコースオキシダーゼ（ＥＣ
１．１．３．４）と酸素電極あるいは過酸化水素電極と
を組み合わせた方式が一般的に知られている（例えば、
鈴木周一編「バイオセンサー」講談社）。グルコースオ
キシダーゼは、酸素を電子受容体として、基質であるβ
−Ｄ−グルコースをＤ−グルコノ−δ−ラクトンに選択
的に酸化する。この反応に伴い、酸素は過酸化水素に還
元される。このときの酸素消費量を酸素電極によって測
定するか、もしくは過酸化水素の生成量を過酸化水素電
極によって測定することによって、グルコースを定量す
ることができる。

【０００３】上記の方法によるとその反応過程からも推
測できるように、測定結果は試料溶液中に溶存している
酸素濃度の影響を大きく受ける。また、酸素のない条件
下では測定が不可能となる。

【０００４】そこで、酸素を電子受容体として用いず、
フェリシアン化カリウム、フェロセン誘導体、キノン誘
導体などの有機化合物や金属錯体を電子受容体として用
いる新しいタイプのグルコースセンサが開発されてき
た。このタイプのセンサは、酵素反応の結果生じた電子
受容体の還元体を、電極で酸化することにより、その酸
化電流からグルコース濃度を求めるものである。

【０００５】さらに、このような電子受容体を酸素の代
わりに用いると、既知量のグルコースオキシダーゼと電
子受容体を安定な状態で、性格に電極上に担持させるこ
とが可能となる。その場合、電極系と反応層を乾燥状態
に近い状態で一体化することができる。この技術に基づ
いた使い捨て型グルコースセンサは、測定器に挿入され
たセンサチップに検体試料を導入するだけで容易にグル
コースの濃度を測定することができることから、近年多
くの注目を集めている。このような手法は、グルコース
の定量に限らず、他の特定の化合物にも応用可能であ
る。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】上記のような電子受容
体を用い、さらに電極系と反応層を一体化する技術によ
り、基質の簡便な電気化学的定量評価が可能となった。

【０００７】特に血糖測定用バイオセンサは、上記のよ
うな技術の発展により同様のタイプのセンサが多数開発
され、市場競争は激化する一方である。また、センサの
主使用者である糖尿病患者も、上昇の一途をたどってい
る。

【０００８】しかしながら、このような構成のバイオセ
ンサにおいて、血液中の基質濃度が同じ場合でも、男女
間差や個人差のある赤血球量が異なることによってセン
サの応答特性に差が生じるという課題を有していた。

【０００９】

【課題を解決するための手段】上記の課題を解決するた
めに本発明は、電気絶縁性の基板上に形成された作用極
および対極からなる電極系と、少なくとも酸化還元酵素
および電子受容体を含む反応層とを具備するバイオセン
サを用いて、試料中の基質と前記酸化還元酵素および電
子受容体との反応に際しての物質濃度変化を、前記作用
極と対極との間に電圧を印加することで得られる電流応
答に基づいて検知する定量法において、電流応答を得る
ための電圧を印加する時間を1秒以上5秒未満とし、一定
時間経過後の電流応答を検知することを特徴とする生体
成分中の基質の定量法である。

【００１０】

【発明の実施の形態】本発明を実施例によりさらに詳し
く説明する。

【００１１】（実施例１）定量法の一例として、グルコ
ースの定量について説明する。まず実施例に用いたグル
コースセンサについて説明する。図１は本発明のバイオ
センサの、カバーおよびスペーサーを除いた断面模式図
である。１はポリエチレンテレフタレートからなる電気
絶縁性の基板を示す。この基板１上にスクリーン印刷に
より銀ペーストを印刷してリード２、３を形成してあ
る。基板１上には、さらに、同様の印刷法により、樹脂
バインダーを含む導電性カーボンペーストからなる作用
極４と対極５を含む電極系及び電気絶縁性ペーストから
なる電気絶縁層６を形成してある。電気絶縁層６は作用
極４及び、対極６の露出部分の面積を一定とし、かつリ
ードを部分的に覆っている。

【００１２】このようにして電極部分を形成した後に、
反応層を作製する。親水性高分子としてカルボキシメチ
ルセルロース（以下、ＣＭＣと略す。）の水溶液を電極
系表面に滴下し、５０℃の温風乾燥機中で１０分間乾燥
させてＣＭＣ層７を形成する。前記ＣＭＣ層７の上に、
酵素と電子受容体を水に溶解した混合水溶液を滴下し、
５０℃の温風乾燥機中で１０分間乾燥させて、酵素及び
電子受容体を含む層８を形成する。以上ＣＭＣ層７と酵
素及び電子受容体を含む層８を併せて反応層と称する。

【００１３】次に反応層の上への試料液の供給を一層円
滑にするために、レシチンの有機溶媒溶液、例えばトル
エン溶液を試料供給部（センサ先端部）から反応層上に
わたって広げ、乾燥させることによりレシチン層が形成
される。最後にカバーおよびスペーサーを図２中、一点
鎖線で示すような位置関係を持って接着する。こうして
グルコースセンサが作製される。図２はそのグルコース
センサの縦断面図である。

【００１４】図２に示す構成のバイオセンサに試料液と
して、血液を用意した。血液中の赤血球容積比（ヘマト
クリット値）が２５％、３８％。５０％のものを調製
し、さらに血漿も試料として用いた。試料液３μｌを試
料供給孔より供給したところ、試料液は空気孔部分まで
達し、電極系上の反応層が溶解した。試料供給から５５
秒経過後、電極系の対極５と作用極４の間に＋０．５Ｖ
の電圧を印加し、３秒後の電流値を測定したところ、血
液のヘマトクリット値に関わらず一定の電流応答値が得
られた。

【００１５】上記構成のバイオセンサにおいては、反応
層が試料液に溶解し、電極表面近傍でグルコースの酸化
が起こり、電子受容体の還元体がグルコースの量に比例
して生成する。この還元体を酸化するための電圧を作用
極と対極の間に印加し、酸化電流を計測する。上記実施
例のように血液を試料として用いた場合の酸化電流値
は、電圧印加からある一定時間までにおいては、粒子成
分量すなわちヘマトクリット値の増加に伴い増加する傾
向を示す。しかしながら、前記一定時間経過から電圧印
加解除までの時間範囲においてはその挙動が逆転し、ヘ
マトクリット値の増加に伴い電流値が減少する傾向を示
す。ヘマトクリット値に関わらず電流値が一定となる時
間を見いだすことができ、その時間での電流値を計測す
ることでセンサ応答のヘマトクリット値依存性を大幅に
軽減することができる。上記結果は、電極近傍における
溶存種の濃度と、電圧印加時の拡散層の成長に主に起因
するものと思われる。

【００１６】（比較例１）実施例１と同じ構成のセンサ
を作製した。試料液として、血液を用意した。血液中の
赤血球容積比（ヘマトクリット値）が２５％、３８％。
５０％のものを調製し、さらに血漿も試料として用い
た。試料液３μｌを試料供給孔より供給したところ、試
料液は空気孔部分まで達し、電極系上の反応層が溶解し
た。試料供給から５５秒経過後、電極系の対極５と作用
極４の間に＋０．５Ｖの電圧を印加し、電圧を印加して
から６秒後の電流値を測定したところ血液のヘマトクリ
ット値の増加に伴い電流値が減少した。その値は、ヘマ
トクリット値が２５％の場合は、血漿の場合の９０％の
電流値であった。また、ヘマトクリット値が３８％の場
合には、血漿の場合の８５％の電流値、ヘマトクリット
値が５０％の場合は、血漿の場合の８５％の電流値であ
った。電圧の印加時間が増加するに伴い、血球量の影響
が大きく現れたものと考えられる。

【００１７】（実施例２）実施例１と同じ構成のセンサ
を作製した。試料液として、血液を用意した。血液中の
赤血球容積比（ヘマトクリット値）が２５％、３８％。
５０％のものを調製し、さらに血漿も試料として用い
た。試料液３μｌを試料供給孔より供給したところ、試
料液は空気孔部分まで達し、電極系上の反応層が溶解し
た。試料供給から５５秒経過後、電極系の対極５と作用
極４の間に＋０．５Ｖの電圧を印加し、２秒後の電流値
を測定したところ、血液のヘマトクリット値に関わらず
一定の電流応答値が得られた。

【００１８】（実施例３）実施例１と同じ構成のセンサ
を作製した。試料液として、血液を用意した。血液中の
赤血球容積比（ヘマトクリット値）が２５％、３８％。
５０％のものを調製し、さらに血漿も試料として用い
た。試料液３μｌを試料供給孔より供給したところ、試
料液は空気孔部分まで達し、電極系上の反応層が溶解し
た。試料供給から５５秒経過後、電極系の対極５と作用
極４の間に＋０．５Ｖの電圧を印加し、４秒後の電流値
を測定したところ、血液のヘマトクリット値に関わらず
一定の電流応答値が得られた。

【００１９】（比較例２）実施例１と同じ構成のセンサ
を作製した。試料液として、血液を用意した。血液中の
赤血球容積比（ヘマトクリット値）が２５％、３８％。
５０％のものを調製し、さらに血漿も試料として用い
た。試料液３μｌを試料供給孔より供給したところ、試
料液は空気孔部分まで達し、電極系上の反応層が溶解し
た。試料供給から５５秒経過後、電極系の対極５と作用
極４の間に＋０．５Ｖの電圧を印加し、電圧を印加して
から０．５秒後の電流値を測定したところ血液のヘマト
クリット値の増加に伴って電流値が増加した。その値
は、ヘマトクリット値が２５％の場合は、血漿の場合の
１２０％の電流値であった。また、ヘマトクリット値が
３８％の場合には、血漿の場合の１６０％の電流値、ヘ
マトクリット値が５０％の場合は、血漿の場合の２００
％の電流値であった。

【００２０】なお、上記の実施例ではグルコースセンサ
について示したが、本発明はアルコールセンサ、スクロ
ースセンサ、コレステロールセンサ、乳酸センサやフル
クトースセンサなどの酸化還元酵素の関与する反応系に
広く用いることができる。

【００２１】酸化還元酵素としては、グルコースオキシ
ダーゼに限定されることはなく、グルコースデヒドロゲ
ナーゼ、アルコールオキシダーゼ、アルコールデヒドロ
ゲナーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、コレステロール
オキシダーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、乳酸
オキシダーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、フルクトースデ
ヒドロゲナーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、ビリル
ビンオキシダーゼなども用いることができる。

【００２２】また、反応層に含有させる電子受容体とし
てはフェリシアン化カリウム、ｐ−ベンゾキノン、フェ
ナジンメトサルフェート、インドフェノール及びその誘
導体、β−ナフトキノン−４−スルホン酸カリウム、メ
チレンブルー、フェロセン及びその誘導体から選ばれる
1種類以上が用いられる。

【００２３】さらに、反応層に親水性高分子を含有させ
ることができ、親水性高分子としてはカルボキシメチル
セルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシ
プロピルセルロース、カルボキシエチルメチルセルロー
ス、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ゼ
ラチン及びその誘導体、アクリル酸及びその塩やメタク
リル酸及びその塩の重合体、でんぷんおよびその誘導
体、無水マレイン酸及びその塩の重合体から選ばれる一
種類以上が用いられる。

【００２４】これらの親水性高分子及び、酵素と電子受
容体を溶解する溶媒として、上記実施例では水を用いた
が、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリ
ス塩酸緩衝液などの各種緩衝液を用いることもできる。

【００２５】また、上記実施例では、親水性高分子含む
反応層について示したが、親水性高分子を含有しない場
合にも同様の結果が得られた。

【００２６】また、上記実施例では、作用極と対極のみ
の二極電極系について述べたが、参照極を加えた三電極
方式にすれば、より正確な測定が可能である。

【００２７】

【発明の効果】以上のように本発明によると、生体成分
中に共存する基質以外の成分の影響を受けることのない
バイオセンサにおける基質の定量法を提供することがで
きる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明で用いるバイオセンサのカバーおよびス
ペーサーを除いた断面模式図

【図２】本発明で用いるバイオセンサの反応層、を除い
た縦断面図

【符号の説明】

１ 電気絶縁性の基板 ２ リード ３ リード ４ 作用極 ５ 対極 ６ 電気絶縁層 ７ ＣＭＣ層 ８ 酵素及び電子受容体を含む層 １１ スペーサー １２ カバー １３ 試料供給孔 １４ 空気孔

フロントページの続き (72)発明者 南海 史朗 大阪府門真市大字門真1006番地 松下電器 産業株式会社内

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 電気絶縁性の基板上に形成された作用極
   および対極からなる電極系と、少なくとも酸化還元酵素
   および電子受容体を含む反応層とを具備するバイオセン
   サを用いて、生体成分中の基質と前記酸化還元酵素およ
   び電子受容体との反応に際しての物質濃度変化を、前記
   作用極と対極との間に電圧を印加することで得られる電
   流応答に基づいて検知する定量法であって、電圧印加か
   ら一定時間経過後の電流応答を検知し、前記一定時間が
   １秒以上５秒未満であることを特徴とする生体成分中の
   基質の定量法。