JP3078966B2 - 乳酸センサ - Google Patents
乳酸センサInfo
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、試料中の乳酸成分につ
いて、迅速かつ高精度な定量を簡便に実施することので
きるバイオセンサに関する。
いて、迅速かつ高精度な定量を簡便に実施することので
きるバイオセンサに関する。
【０００２】
【従来の技術】酵素電極を用いた乳酸の定量方法として
は、酵素に乳酸オキシダーゼを用い、過酸化水素電極と
組み合わせた方式が開示されている（例えば、医器学、
５４巻６８ページ、１９８４年）。この方式による測定
機器について説明する。用いる酵素電極は、乳酸オキシ
ダーゼをアセチルセルロース膜上に固定化し、表面をポ
リカーボネート薄膜で被覆した固定化酵素膜と、白金と
銀からなる過酸化水素電極とから構成されている。そし
て、この測定機器はフローラインを有し、試料液は緩衝
液による混合希釈の後、酸素を含む空気が混入され、脱
泡器を経て前記酵素電極部分へと導入される。試料液中
の乳酸と固定化酵素膜中の乳酸オキシダーゼとが反応す
ると同時に過酸化水素が生成する。この過酸化水素の増
加量を、過酸化水素電極によって計ることで乳酸の定量
を行うものである。
は、酵素に乳酸オキシダーゼを用い、過酸化水素電極と
組み合わせた方式が開示されている（例えば、医器学、
５４巻６８ページ、１９８４年）。この方式による測定
機器について説明する。用いる酵素電極は、乳酸オキシ
ダーゼをアセチルセルロース膜上に固定化し、表面をポ
リカーボネート薄膜で被覆した固定化酵素膜と、白金と
銀からなる過酸化水素電極とから構成されている。そし
て、この測定機器はフローラインを有し、試料液は緩衝
液による混合希釈の後、酸素を含む空気が混入され、脱
泡器を経て前記酵素電極部分へと導入される。試料液中
の乳酸と固定化酵素膜中の乳酸オキシダーゼとが反応す
ると同時に過酸化水素が生成する。この過酸化水素の増
加量を、過酸化水素電極によって計ることで乳酸の定量
を行うものである。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】このような従来の測定
方法においては、酵素膜の交換の必要があり、さらにポ
ンプ、混合器、脱泡器などを備えた機器が必要である。
従って、フローラインの洗浄などのメンテナンスが要求
され、一定量の試料液を供給するなど、操作が複雑で、
かつ簡便性に欠けていた。また、従来方法で用いられて
いる酵素は、Ｌ−乳酸に対しては特異的な酸化能を有す
るが、Ｄ−乳酸を酸化させる能力は備えていない。例え
ばヨーグルトや乳酸菌飲料等の食品関連分野において
は、Ｌ体とＤ体両方を含めた乳酸の定量が必要である
が、従来の機器を用いた方法ではＤ−乳酸濃度を測定で
きない。Ｄ−乳酸濃度の定量については、自動分析装置
は開発されておらず、酵素反応と分光分析とを組み合わ
せた方法が一般的である。この方法には、多大な時間と
労力を要するとともに、人の手作業によるため人為的誤
差を生じ易い等の欠点を有していた。従って、本発明
は、簡易な操作でＬ体とＤ体を含めた乳酸を定量できる
乳酸センサを提供することを目的とする。
方法においては、酵素膜の交換の必要があり、さらにポ
ンプ、混合器、脱泡器などを備えた機器が必要である。
従って、フローラインの洗浄などのメンテナンスが要求
され、一定量の試料液を供給するなど、操作が複雑で、
かつ簡便性に欠けていた。また、従来方法で用いられて
いる酵素は、Ｌ−乳酸に対しては特異的な酸化能を有す
るが、Ｄ−乳酸を酸化させる能力は備えていない。例え
ばヨーグルトや乳酸菌飲料等の食品関連分野において
は、Ｌ体とＤ体両方を含めた乳酸の定量が必要である
が、従来の機器を用いた方法ではＤ−乳酸濃度を測定で
きない。Ｄ−乳酸濃度の定量については、自動分析装置
は開発されておらず、酵素反応と分光分析とを組み合わ
せた方法が一般的である。この方法には、多大な時間と
労力を要するとともに、人の手作業によるため人為的誤
差を生じ易い等の欠点を有していた。従って、本発明
は、簡易な操作でＬ体とＤ体を含めた乳酸を定量できる
乳酸センサを提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】上記の課題を解決するた
めに本発明は、乳酸を酸化する能力を有する酵素ととも
に、乳酸をラセミ化する能力を有する酵素を用い、乳酸
の酸化反応にともなう物質濃度変化を電気化学的に検出
するための電極を具備する乳酸センサを提供するもので
ある。さらに具体的には、本発明の乳酸センサは、絶縁
性の基板上に形成した作用極と対極を含む電極系と前記
電極系上に位置する反応層を具備し、前記反応層が、少
なくとも親水性高分子、乳酸を酸化する能力を有する酵
素および乳酸をラセミ化する能力を有する酵素を含むこ
とを特徴とする。
めに本発明は、乳酸を酸化する能力を有する酵素ととも
に、乳酸をラセミ化する能力を有する酵素を用い、乳酸
の酸化反応にともなう物質濃度変化を電気化学的に検出
するための電極を具備する乳酸センサを提供するもので
ある。さらに具体的には、本発明の乳酸センサは、絶縁
性の基板上に形成した作用極と対極を含む電極系と前記
電極系上に位置する反応層を具備し、前記反応層が、少
なくとも親水性高分子、乳酸を酸化する能力を有する酵
素および乳酸をラセミ化する能力を有する酵素を含むこ
とを特徴とする。
【０００５】また、本発明の乳酸センサは、絶縁性の基
板上に形成した作用極と対極を含む電極系と、前記電極
系上に位置する反応層と、前記電極系近傍に位置する補
助反応層を具備し、前記反応層が少なくとも親水性高分
子と乳酸を酸化する能力を有する酵素を含み、前記補助
反応層が少なくとも乳酸をラセミ化する能力を有する酵
素を含むこと特徴とする。ここにおいて、反応層がさら
に電子受容体を含む構成、あるいは乳酸を酸化する能力
を有する酵素が、Ｌ−乳酸を酸化する能力を有する酵素
と、Ｄ−乳酸を酸化する能力を有する酵素の組合せから
なり、さらに反応層中に補酵素を含む構成をとることが
できる。
板上に形成した作用極と対極を含む電極系と、前記電極
系上に位置する反応層と、前記電極系近傍に位置する補
助反応層を具備し、前記反応層が少なくとも親水性高分
子と乳酸を酸化する能力を有する酵素を含み、前記補助
反応層が少なくとも乳酸をラセミ化する能力を有する酵
素を含むこと特徴とする。ここにおいて、反応層がさら
に電子受容体を含む構成、あるいは乳酸を酸化する能力
を有する酵素が、Ｌ−乳酸を酸化する能力を有する酵素
と、Ｄ−乳酸を酸化する能力を有する酵素の組合せから
なり、さらに反応層中に補酵素を含む構成をとることが
できる。
【０００６】
【作用】本発明によれば、乳酸を酸化する能力を有する
１つの酵素は、Ｌ体またはＤ体の一方のみを酸化させる
が、乳酸をセラミ化する能力を有する酵素によって、前
記酵素により酸化されないＤ体またはＬ体を前記酵素に
より酸化されるＬ体またはＤ体に転換することになる。
従って、本発明により、簡易な操作で試料中のＬ−乳酸
とＤ−乳酸とを同時に定量することができる乳酸センサ
を得ることができる。
１つの酵素は、Ｌ体またはＤ体の一方のみを酸化させる
が、乳酸をセラミ化する能力を有する酵素によって、前
記酵素により酸化されないＤ体またはＬ体を前記酵素に
より酸化されるＬ体またはＤ体に転換することになる。
従って、本発明により、簡易な操作で試料中のＬ−乳酸
とＤ−乳酸とを同時に定量することができる乳酸センサ
を得ることができる。
【０００７】
【実施例】以下、本発明を実施例により説明する。 ［実施例１］図１は本発明の一実施例として作製した乳
酸センサのうち反応層を除いた斜視図、図２は同乳酸セ
ンサの模式断面図である。以下に乳酸センサの作製方法
について説明する。ポリエチレンテレフタレートからな
る絶縁性の基板１上に、スクリーン印刷により銀ペ−ス
トを印刷してリ−ド２、３を形成する。つぎに、樹脂バ
インダーを含む導電性カーボンペーストを用いて電極系
のうち作用極４を、つづいて絶縁性ペーストからなる絶
縁層６を順次印刷により形成する。絶縁層６は作用極４
の露出部分の面積を一定とし、かつリ−ド２、３を部分
的に覆っている。最後に樹脂バインダーを含む導電性カ
ーボンペーストを用いて電極系のうち対極５を印刷形成
する。なお、電極４および５はそれぞれリード２および
３に接続されている。
酸センサのうち反応層を除いた斜視図、図２は同乳酸セ
ンサの模式断面図である。以下に乳酸センサの作製方法
について説明する。ポリエチレンテレフタレートからな
る絶縁性の基板１上に、スクリーン印刷により銀ペ−ス
トを印刷してリ−ド２、３を形成する。つぎに、樹脂バ
インダーを含む導電性カーボンペーストを用いて電極系
のうち作用極４を、つづいて絶縁性ペーストからなる絶
縁層６を順次印刷により形成する。絶縁層６は作用極４
の露出部分の面積を一定とし、かつリ−ド２、３を部分
的に覆っている。最後に樹脂バインダーを含む導電性カ
ーボンペーストを用いて電極系のうち対極５を印刷形成
する。なお、電極４および５はそれぞれリード２および
３に接続されている。
【０００８】次に、前記電極系上に親水性高分子として
カルボキシメチルセルロ−ス（以下ＣＭＣと略す）の
０．５wt％水溶液を展開し、乾燥させてＣＭＣ層を形成
する。つづいて、前記ＣＭＣ層上に乳酸を酸化する能力
を有する酵素として乳酸オキシダーゼ（ＥＣ１．１．
３．２；以下ＬＯＤと略す）と、乳酸をラセミ化する能
力を有する酵素として乳酸ラセマーゼ（ＥＣ５．１．
２．１）をリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解させた溶
液を展開し、温風乾燥器中で乾燥させて反応層１１を形
成する。上記の反応層形成工程において、酵素の混合水
溶液を滴下するとＣＭＣ層は一度溶解し、その後の乾燥
過程で酵素と混合された形で反応層１１を形成する。し
かし、攪拌等をともなわないため完全な混合状態とはな
らず、電極系表面はＣＭＣのみによって被覆された状態
となる。すなわち、酵素および後記実施例で加える電子
受容体などが電極系表面に接触し難いために、高精度な
センサ応答を有する乳酸センサを得ることができる。
カルボキシメチルセルロ−ス（以下ＣＭＣと略す）の
０．５wt％水溶液を展開し、乾燥させてＣＭＣ層を形成
する。つづいて、前記ＣＭＣ層上に乳酸を酸化する能力
を有する酵素として乳酸オキシダーゼ（ＥＣ１．１．
３．２；以下ＬＯＤと略す）と、乳酸をラセミ化する能
力を有する酵素として乳酸ラセマーゼ（ＥＣ５．１．
２．１）をリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解させた溶
液を展開し、温風乾燥器中で乾燥させて反応層１１を形
成する。上記の反応層形成工程において、酵素の混合水
溶液を滴下するとＣＭＣ層は一度溶解し、その後の乾燥
過程で酵素と混合された形で反応層１１を形成する。し
かし、攪拌等をともなわないため完全な混合状態とはな
らず、電極系表面はＣＭＣのみによって被覆された状態
となる。すなわち、酵素および後記実施例で加える電子
受容体などが電極系表面に接触し難いために、高精度な
センサ応答を有する乳酸センサを得ることができる。
【０００９】上記のように作製した乳酸センサに、試料
液として乳酸水溶液１０μｌを反応層１１上へ滴下し、
５分後に電極系の対極５を基準にして作用極４にアノー
ド方向へ＋１．０Ｖのパルス電圧を印加し、５秒後の電
流値を測定したところ、試料液中の乳酸濃度に比例した
応答電流値が得られた。反応層１１が試料液に溶解する
と、試料液中のＤ−乳酸は乳酸ラセマーゼによってラセ
ミ化されてＬ−乳酸が生成する。あらかじめ試料液中に
存在したＬ−乳酸と、前記ラセミ化により生成したＬ−
乳酸は共にＬＯＤによって酸化され、同時に溶液中の酸
素が還元され過酸化水素が生成する。次に、前記の電圧
印加により、生成した過酸化水素の酸化電流が得られ、
この電流値は基質である乳酸の濃度に対応する。
液として乳酸水溶液１０μｌを反応層１１上へ滴下し、
５分後に電極系の対極５を基準にして作用極４にアノー
ド方向へ＋１．０Ｖのパルス電圧を印加し、５秒後の電
流値を測定したところ、試料液中の乳酸濃度に比例した
応答電流値が得られた。反応層１１が試料液に溶解する
と、試料液中のＤ−乳酸は乳酸ラセマーゼによってラセ
ミ化されてＬ−乳酸が生成する。あらかじめ試料液中に
存在したＬ−乳酸と、前記ラセミ化により生成したＬ−
乳酸は共にＬＯＤによって酸化され、同時に溶液中の酸
素が還元され過酸化水素が生成する。次に、前記の電圧
印加により、生成した過酸化水素の酸化電流が得られ、
この電流値は基質である乳酸の濃度に対応する。
【００１０】［実施例２］図３は本発明の一実施例とし
て作製した乳酸センサのうち反応層および補助反応層を
除いた分解斜視図、図４は同乳酸センサの分解斜視図、
図５は同乳酸センサのカバーおよびスペーサーを除いた
模式断面図である。以下に乳酸センサの作製方法につい
て説明する。実施例１と同様にして、絶縁性の基板１上
に、スクリーン印刷により図３に示すリ−ド２、３、作
用極４および対極５からなる電極系、絶縁層６を形成す
る。次に、前記電極系上に親水性高分子としてＣＭＣの
０．５wt％水溶液を展開し、乾燥させてＣＭＣ層を形成
する。つづいて、前記ＣＭＣ層上に酵素としてＬＯＤと
乳酸ラセマーゼの混合水溶液を展開し、温風乾燥器中で
乾燥させて反応層１１を形成する。つぎに、乳酸ラセマ
ーゼをリン酸緩衝液に溶解させた溶液を絶縁層６上へ展
開し、乾燥させて補助反応層１２を形成する。前記のよ
うにして反応層１１および補助反応層１２を形成した
後、カバー２２およびスペーサー２１を図３または図４
中、一点鎖線で示すような位置関係をもって接着する。
て作製した乳酸センサのうち反応層および補助反応層を
除いた分解斜視図、図４は同乳酸センサの分解斜視図、
図５は同乳酸センサのカバーおよびスペーサーを除いた
模式断面図である。以下に乳酸センサの作製方法につい
て説明する。実施例１と同様にして、絶縁性の基板１上
に、スクリーン印刷により図３に示すリ−ド２、３、作
用極４および対極５からなる電極系、絶縁層６を形成す
る。次に、前記電極系上に親水性高分子としてＣＭＣの
０．５wt％水溶液を展開し、乾燥させてＣＭＣ層を形成
する。つづいて、前記ＣＭＣ層上に酵素としてＬＯＤと
乳酸ラセマーゼの混合水溶液を展開し、温風乾燥器中で
乾燥させて反応層１１を形成する。つぎに、乳酸ラセマ
ーゼをリン酸緩衝液に溶解させた溶液を絶縁層６上へ展
開し、乾燥させて補助反応層１２を形成する。前記のよ
うにして反応層１１および補助反応層１２を形成した
後、カバー２２およびスペーサー２１を図３または図４
中、一点鎖線で示すような位置関係をもって接着する。
【００１１】カバーを装着すると、カバーとスペーサー
によって生じる空間部の毛細管現象によって、試料液は
センサ先端の試料供給孔１０に接触させるだけの簡易操
作で容易に反応層部分へ導入される。なお、試料液の供
給をより一層円滑にするためには、さらに必要に応じて
レシチンの有機溶媒溶液を試料供給部から反応層１１上
にかけて展開し乾燥するとよい。さらに、前記レシチン
による処理を実施した場合には、前記カバーとスペーサ
ーによって生じる空間部が毛細管現象を発現し得ない程
度の大きさとなる場合においても、試料液の供給が可能
となる。試料液の供給量はカバーとスペーサーによって
生じる空間容積に依存するため、あらかじめ定量する必
要がない。さらに、測定中の試料液の蒸発を最小限に抑
えることができ、精度の高い測定が可能となる。
によって生じる空間部の毛細管現象によって、試料液は
センサ先端の試料供給孔１０に接触させるだけの簡易操
作で容易に反応層部分へ導入される。なお、試料液の供
給をより一層円滑にするためには、さらに必要に応じて
レシチンの有機溶媒溶液を試料供給部から反応層１１上
にかけて展開し乾燥するとよい。さらに、前記レシチン
による処理を実施した場合には、前記カバーとスペーサ
ーによって生じる空間部が毛細管現象を発現し得ない程
度の大きさとなる場合においても、試料液の供給が可能
となる。試料液の供給量はカバーとスペーサーによって
生じる空間容積に依存するため、あらかじめ定量する必
要がない。さらに、測定中の試料液の蒸発を最小限に抑
えることができ、精度の高い測定が可能となる。
【００１２】上記のように作製した乳酸センサに、試料
液として乳酸水溶液３μｌを試料供給孔２３より供給す
ると、試料液は速やかに空気孔２４部分まで達し、補助
反応層１２および反応層１１が順次溶解する。実施例１
と同様にして、試料液を供給してから４分後に電極系の
対極５を基準にして作用極４にアノード方向へ＋１．０
Ｖのパルス電圧を印加し、５秒後の電流値を測定したと
ころ、試料液中の乳酸濃度に比例した応答電流値が得ら
れた。試料液中のＤ−乳酸濃度が高い場合には、反応層
１１中の乳酸ラセマーゼの作用のみでは一定時間内に十
分なラセミ化が起こらない。乳酸ラセマーゼを含んだ補
助反応層１２を設けることによって、短時間で乳酸濃度
の定量が可能となる。また、反応層１１中に乳酸ラセマ
ーゼを含まず、補助反応層１２中にのみ乳酸ラセマーゼ
を含ませて乳酸センサを作製したところ、センサの保存
信頼性が向上する効果が得られた。これは反応層１１中
に複数の酵素を含ませることによって生じた酵素活性の
低下を避けることができたことによる。
液として乳酸水溶液３μｌを試料供給孔２３より供給す
ると、試料液は速やかに空気孔２４部分まで達し、補助
反応層１２および反応層１１が順次溶解する。実施例１
と同様にして、試料液を供給してから４分後に電極系の
対極５を基準にして作用極４にアノード方向へ＋１．０
Ｖのパルス電圧を印加し、５秒後の電流値を測定したと
ころ、試料液中の乳酸濃度に比例した応答電流値が得ら
れた。試料液中のＤ−乳酸濃度が高い場合には、反応層
１１中の乳酸ラセマーゼの作用のみでは一定時間内に十
分なラセミ化が起こらない。乳酸ラセマーゼを含んだ補
助反応層１２を設けることによって、短時間で乳酸濃度
の定量が可能となる。また、反応層１１中に乳酸ラセマ
ーゼを含まず、補助反応層１２中にのみ乳酸ラセマーゼ
を含ませて乳酸センサを作製したところ、センサの保存
信頼性が向上する効果が得られた。これは反応層１１中
に複数の酵素を含ませることによって生じた酵素活性の
低下を避けることができたことによる。
【００１３】［実施例３］実施例１と同様にして、絶縁
性の基板１上に、スクリーン印刷により図１に示すリ−
ド２、３、作用極４および対極５からなる電極系、絶縁
層６を形成する。次に、前記電極系上に親水性高分子と
してＣＭＣの０．５wt％水溶液を展開し、乾燥させてＣ
ＭＣ層を形成する。つづいて、前記ＣＭＣ層上に酵素と
してＬＯＤと乳酸ラセマーゼ、さらに電子受容体として
フェリシアン化カリウムの混合水溶液を展開し、温風乾
燥器中で乾燥させて反応層１１を形成する。上記のよう
に作製した乳酸センサに、試料液として乳酸水溶液１０
μｌを反応層１１上へ滴下し、５分後に電極系の対極５
を基準にして作用極４にアノード方向へ＋０．５Ｖのパ
ルス電圧を印加し、５秒後の電流値を測定したところ、
試料液中の乳酸濃度に比例した応答電流値が得られた。
性の基板１上に、スクリーン印刷により図１に示すリ−
ド２、３、作用極４および対極５からなる電極系、絶縁
層６を形成する。次に、前記電極系上に親水性高分子と
してＣＭＣの０．５wt％水溶液を展開し、乾燥させてＣ
ＭＣ層を形成する。つづいて、前記ＣＭＣ層上に酵素と
してＬＯＤと乳酸ラセマーゼ、さらに電子受容体として
フェリシアン化カリウムの混合水溶液を展開し、温風乾
燥器中で乾燥させて反応層１１を形成する。上記のよう
に作製した乳酸センサに、試料液として乳酸水溶液１０
μｌを反応層１１上へ滴下し、５分後に電極系の対極５
を基準にして作用極４にアノード方向へ＋０．５Ｖのパ
ルス電圧を印加し、５秒後の電流値を測定したところ、
試料液中の乳酸濃度に比例した応答電流値が得られた。
【００１４】反応層１１が試料液に溶解すると、試料液
中のＤ−乳酸は乳酸ラセマーゼによってラセミ化されＬ
−乳酸が生成する。このＬ−乳酸とあらかじめ試料液中
に存在していたＬ−乳酸はともにＬＯＤによって酸化さ
れ、同時にフェリシアン化カリウムがフェロシアン化カ
リウムに還元される。次に、前記のパルス電圧の印加に
より、生成したフェロシアン化カリウムの酸化電流が得
られ、この電流値は基質である乳酸の濃度に対応する。
電子受容体を反応層中に含ませることにより、より高濃
度の乳酸濃度定量が可能となった。さらに、実施例２に
示したように、乳酸ラセマーゼを含む補助反応層を絶縁
層上に作製すると、より高濃度の乳酸を短時間で測定可
能な乳酸センサが実現できる。
中のＤ−乳酸は乳酸ラセマーゼによってラセミ化されＬ
−乳酸が生成する。このＬ−乳酸とあらかじめ試料液中
に存在していたＬ−乳酸はともにＬＯＤによって酸化さ
れ、同時にフェリシアン化カリウムがフェロシアン化カ
リウムに還元される。次に、前記のパルス電圧の印加に
より、生成したフェロシアン化カリウムの酸化電流が得
られ、この電流値は基質である乳酸の濃度に対応する。
電子受容体を反応層中に含ませることにより、より高濃
度の乳酸濃度定量が可能となった。さらに、実施例２に
示したように、乳酸ラセマーゼを含む補助反応層を絶縁
層上に作製すると、より高濃度の乳酸を短時間で測定可
能な乳酸センサが実現できる。
【００１５】［実施例４］実施例１と同様にして、絶縁
性の基板１上に、スクリーン印刷により図１に示すリ−
ド２、３、作用極４および対極５からなる電極系、絶縁
層６を形成する。次に、前記電極系上に親水性高分子と
してＣＭＣの０．５wt％水溶液を展開し、乾燥させてＣ
ＭＣ層を形成する。つづいて、前記ＣＭＣ層上に酵素と
してＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．２
８；以下、Ｄ−ＬＤＨと略す）とＬＯＤと乳酸ラセマー
ゼ、電子受容体としてフェリシアン化カリウム、さらに
補酵素としてニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
（以下、ＮＡＤと略す）の混合水溶液を展開し、温風乾
燥器中で乾燥させて反応層１１を形成する。上記のよう
に作製した乳酸センサに、試料液として乳酸水溶液１０
μｌを反応層１１上へ滴下し、３分後に電極系の対極５
を基準にして作用極４にアノード方向へ＋０．５Ｖのパ
ルス電圧を印加し、５秒後の電流値を測定したところ、
試料液中の乳酸濃度に比例した応答電流値が得られた。
性の基板１上に、スクリーン印刷により図１に示すリ−
ド２、３、作用極４および対極５からなる電極系、絶縁
層６を形成する。次に、前記電極系上に親水性高分子と
してＣＭＣの０．５wt％水溶液を展開し、乾燥させてＣ
ＭＣ層を形成する。つづいて、前記ＣＭＣ層上に酵素と
してＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．２
８；以下、Ｄ−ＬＤＨと略す）とＬＯＤと乳酸ラセマー
ゼ、電子受容体としてフェリシアン化カリウム、さらに
補酵素としてニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
（以下、ＮＡＤと略す）の混合水溶液を展開し、温風乾
燥器中で乾燥させて反応層１１を形成する。上記のよう
に作製した乳酸センサに、試料液として乳酸水溶液１０
μｌを反応層１１上へ滴下し、３分後に電極系の対極５
を基準にして作用極４にアノード方向へ＋０．５Ｖのパ
ルス電圧を印加し、５秒後の電流値を測定したところ、
試料液中の乳酸濃度に比例した応答電流値が得られた。
【００１６】反応層１１が試料液に溶解すると、試料液
中のＤ−乳酸は乳酸ラセマーゼによってラセミ化されＬ
−乳酸が生成する。このＬ−乳酸とあらかじめ試料液中
に存在していたＬ−乳酸はともにＬＯＤによって酸化さ
れ、同時にフェリシアン化カリウムがフェロシアン化カ
リウムに還元される。さらに、Ｄ−乳酸はＤ−ＬＤＨに
よる酸化作用も受け、補酵素であるＮＡＤが還元されて
ＮＡＤＨが生成するが、このＮＡＤＨはフェリシアン化
カリウムと反応し、その結果フェロシアン化カリウムが
生成する。次に、前記のパルス電圧の印加により、上記
２つの反応経路により生成したフェロシアン化カリウム
の酸化電流が得られ、この電流値は基質である乳酸の濃
度に対応する。ＬＯＤと乳酸ラセマーゼの反応系とＤ−
ＬＤＨとＮＡＤの反応系を組み合わせて用いることによ
って、より短時間で乳酸濃度測定が可能となる。一方、
ＮＡＤの還元によって生成したＮＡＤＨは、必ずしも電
子受容体と共役させる必要はなく、直接電極系で酸化さ
せることにより定量することも可能である。
中のＤ−乳酸は乳酸ラセマーゼによってラセミ化されＬ
−乳酸が生成する。このＬ−乳酸とあらかじめ試料液中
に存在していたＬ−乳酸はともにＬＯＤによって酸化さ
れ、同時にフェリシアン化カリウムがフェロシアン化カ
リウムに還元される。さらに、Ｄ−乳酸はＤ−ＬＤＨに
よる酸化作用も受け、補酵素であるＮＡＤが還元されて
ＮＡＤＨが生成するが、このＮＡＤＨはフェリシアン化
カリウムと反応し、その結果フェロシアン化カリウムが
生成する。次に、前記のパルス電圧の印加により、上記
２つの反応経路により生成したフェロシアン化カリウム
の酸化電流が得られ、この電流値は基質である乳酸の濃
度に対応する。ＬＯＤと乳酸ラセマーゼの反応系とＤ−
ＬＤＨとＮＡＤの反応系を組み合わせて用いることによ
って、より短時間で乳酸濃度測定が可能となる。一方、
ＮＡＤの還元によって生成したＮＡＤＨは、必ずしも電
子受容体と共役させる必要はなく、直接電極系で酸化さ
せることにより定量することも可能である。
【００１７】上記実施例１から４では親水性高分子とし
てＣＭＣを用いたが、これに限定されることはなく、他
のセルロース誘導体、具体的には、ヒドロキシエチルセ
ルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセル
ロース、エチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセ
ルロース、カルボキシメチルエチルセルロースを用いて
もよく、さらには、ポリビニルピロリドン、ポリビニル
アルコール、ゼラチンおよびその誘導体、アクリル酸お
よびその塩、メタアクリル酸およびその塩、スターチお
よびその誘導体、無水マレイン酸およびその塩を用いて
も同様の効果が得られる。
てＣＭＣを用いたが、これに限定されることはなく、他
のセルロース誘導体、具体的には、ヒドロキシエチルセ
ルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセル
ロース、エチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセ
ルロース、カルボキシメチルエチルセルロースを用いて
もよく、さらには、ポリビニルピロリドン、ポリビニル
アルコール、ゼラチンおよびその誘導体、アクリル酸お
よびその塩、メタアクリル酸およびその塩、スターチお
よびその誘導体、無水マレイン酸およびその塩を用いて
も同様の効果が得られる。
【００１８】一方、電子受容体としては、上記実施例に
示したフェリシアン化カリウム以外に、ｐ−ベンゾキノ
ン、メルドラブルー、フェナジンメトサルフェート、メ
チレンブルー、フェロセンおよびその誘導体など、用い
る酸化還元酵素と共役するものであれば自由に使用する
ことができる。また、上記実施例において、酵素および
電子受容体については試料液に溶解する方式について示
したが、これに制限されることはなく、固定化によって
試料液に不溶化させた場合にも適用することができる。
さらに、上記実施例では作用極と対極からなる２電極系
について述べたが、参照電極を加えた３電極系にする
と、より精度の高い測定が可能である。
示したフェリシアン化カリウム以外に、ｐ−ベンゾキノ
ン、メルドラブルー、フェナジンメトサルフェート、メ
チレンブルー、フェロセンおよびその誘導体など、用い
る酸化還元酵素と共役するものであれば自由に使用する
ことができる。また、上記実施例において、酵素および
電子受容体については試料液に溶解する方式について示
したが、これに制限されることはなく、固定化によって
試料液に不溶化させた場合にも適用することができる。
さらに、上記実施例では作用極と対極からなる２電極系
について述べたが、参照電極を加えた３電極系にする
と、より精度の高い測定が可能である。
【００１９】
【発明の効果】以上のように本発明によると、簡易な操
作で応答性に優れた乳酸センサを得ることができる。
作で応答性に優れた乳酸センサを得ることができる。
【図１】本発明の一実施例として作製した乳酸センサの
反応層を除いた斜視図である。
反応層を除いた斜視図である。
【図２】同乳酸センサの模式断面図である。
【図３】本発明の別の実施例として作製した乳酸センサ
の反応層および補助反応層を除いた分解斜視図である。
の反応層および補助反応層を除いた分解斜視図である。
【図４】同乳酸センサの分解斜視図である。
【図５】同乳酸センサのカバーおよびスペーサーを除い
た模式断面図である。
た模式断面図である。
１ 絶縁性の基板 ２、３ リード ４ 作用極 ５ 対極 ６ 絶縁層 １１ 反応層 １２ 補助反応層 ２１ スペーサー ２２ カバー ２３ 試料供給孔 ２４ 空気孔
フロントページの続き (56)参考文献 特開 平６−109698（ＪＰ，Ａ) 特開 平６−94672（ＪＰ，Ａ) 特開 平６−169798（ＪＰ，Ａ) 特開 平６−138080（ＪＰ，Ａ) 特開 平７−83871（ＪＰ，Ａ) 特開 平５−196596（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−191051（ＪＰ，Ａ) 特開 昭57−86040（ＪＰ，Ａ) 特開 昭57−86041（ＪＰ，Ａ) 特開 昭57−86751（ＪＰ，Ａ) 特開 昭57−86752（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−193452（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−216948（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−157646（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−157645（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−310457（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−165249（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−202764（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−287064（ＪＰ，Ａ) 特開 昭56−35051（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 27/416 G01N 27/327 ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)
Claims (6)
- 【請求項１】 乳酸を酸化する能力を有する酵素、乳酸
をラセミ化する能力を有する酵素および乳酸の酸化反応
にともなう物質濃度変化を電気化学的に検出するための
電極を具備することを特徴とする乳酸センサ。 - 【請求項２】 絶縁性の基板上に形成した作用極と対極
を含む電極系と前記電極系上に位置する反応層を具備
し、前記反応層が、少なくとも親水性高分子、乳酸を酸
化する能力を有する酵素および乳酸をラセミ化する能力
を有する酵素を含むことを特徴とする乳酸センサ。 - 【請求項３】 絶縁性の基板上に形成した作用極と対極
を含む電極系と、前記電極系上に位置する反応層と、前
記電極系近傍に位置する補助反応層を具備し、前記反応
層が少なくとも親水性高分子と乳酸を酸化する能力を有
する酵素を含み、前記補助反応層が少なくとも乳酸をラ
セミ化する能力を有する酵素を含むこと特徴とする乳酸
センサ。 - 【請求項４】 反応層がさらに乳酸をラセミ化する能力
を有する酵素を含む請求項３記載の乳酸センサ。 - 【請求項５】 反応層がさらに電子受容体を含む請求項
２または３記載の乳酸センサ。 - 【請求項６】 乳酸を酸化する能力を有する酵素が、Ｌ
−乳酸を酸化する能力を有する酵素と、Ｄ−乳酸を酸化
する能力を有する酵素の組合せからなり、さらに反応層
中に補酵素を含む請求項２または３記載の乳酸センサ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP05238178A JP3078966B2 (ja) | 1993-09-24 | 1993-09-24 | 乳酸センサ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP05238178A JP3078966B2 (ja) | 1993-09-24 | 1993-09-24 | 乳酸センサ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0792138A JPH0792138A (ja) | 1995-04-07 |
| JP3078966B2 true JP3078966B2 (ja) | 2000-08-21 |
Family
ID=17026340
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP05238178A Expired - Fee Related JP3078966B2 (ja) | 1993-09-24 | 1993-09-24 | 乳酸センサ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3078966B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IT1279043B1 (it) * | 1995-05-24 | 1997-12-04 | Co Ri Al Scpa | Metodo per la determinazione di acido lattico in materiali organici di interesse alimentare e biosensore per l'esecuzione di tale metodo |
| JP3713849B2 (ja) * | 1996-11-21 | 2005-11-09 | 日産自動車株式会社 | スロットル開度検出装置 |
| JP4522528B2 (ja) * | 2000-03-02 | 2010-08-11 | 文代 楠 | 潰瘍性大腸疾患測定電極、潰瘍性大腸疾患測定装置及び潰瘍性大腸疾患判定方法 |
-
1993
- 1993-09-24 JP JP05238178A patent/JP3078966B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0792138A (ja) | 1995-04-07 |
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