JPH08338824A - バイオセンサ、バイオセンサの製造方法および特定化合物の定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 酵素反応により生成する過酸化水素を電気化
学的に検知して特定化合物を定量する際、過酸化水素の
活性化過電圧が高いことに起因する易酸化性物質による
誤差を軽減する高性能なバイオセンサを提供することを
目的とする。 【解決手段】 絶縁性の基板上に形成された作用極と対
極を有する電極系、および少なくとも酸化還元酵素を含
む反応層を具備し、前記作用極が白金を含むバイオセン
サ。このセンサを用い、その酸化還元酵素と試料中の特
定化合物との反応により生成する過酸化水素、もしくは
過酸化水素と還元型電子受容体を、作用極と対極間に電
圧を印加した際に得られる酸化電流で検知し、特定化合
物を定量する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、試料中の特定化合物を
迅速、高精度、かつ簡便に定量するためのバイオセン
サ、そのバイオセンサを用いた特定化合物の定量法に関
する。

【０００２】

【従来の技術】特定化合物の定量法の一例としてグルコ
−スの定量法について説明する。電気化学的なグルコ−
スの定量法としては、グルコ−スオキシダ−ゼ（ＥＣ
１．１．３．４：以下ＧＯＤと略す）と酸素電極あるい
は過酸化水素電極とを組み合わせた方式が一般的に知ら
れている（例えば、鈴木周一編「バイオセンサ−」講談
社）。ＧＯＤは、酸素を電子受容体として基質であるβ
−Ｄ−グルコ−スをＤ−グルコノ−δ−ラクトンに選択
的に酸化する。この反応に伴い、酸素は過酸化水素に還
元される。この時の酸素消費量を酸素電極によって測定
するか、もしくは過酸化水素の生成量を過酸化水素電極
によって測定することでグルコ−スの定量が行われる。

【０００３】上記方法では、その反応過程からも推測で
きるように、測定結果は溶存酸素濃度の影響を大きく受
け、酸素のない条件下では測定が不可能となる場合があ
る。そこで、酸素を電子受容体として用いず、フェリシ
アン化カリウム、フェロセン誘導体、キノン誘導体等の
有機化合物や金属錯体を電子受容体として用いる新しい
タイプのグルコ−スセンサが開発されてきた。このタイ
プのセンサでは、酵素反応の結果生じた電子受容体の還
元体を電極で酸化することにより、その酸化電流からグ
ルコ−ス濃度が求められる。このような電子受容体を酸
素の代わりに用いることで、既知量のＧＯＤと電子受容
体を安定な状態で正確に電極上に乾燥担持させ、電極系
と反応層を乾燥状態に近い状態で一体化することができ
る。この技術に基づいた使い捨て型グルコ−スセンサ
は、近年多くの注目を集めており、測定器に挿入された
センサチップに検体試料を導入するだけで容易にグルコ
−ス濃度を測定することができる。このような手法は、
グルコ−スの定量評価だけに限らず他の特定化合物の定
量評価にも応用可能であり、現在多くの研究対象となっ
ている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】上述したように、酸素
を電子受容体として酵素反応が進行する際は、生成した
過酸化水素を電気化学的に酸化し、その酸化電流に基づ
いてグルコ−ス濃度を測定することができる。しかしな
がら、汎用される炭素電極等においては、過酸化水素の
活性化過電圧が高いために、その酸化電位をより正側へ
設定する必要がある。例えば、作用極と対極間に印加す
る電圧を６００〜７００ｍＶ程度にする必要があった。
その場合、アスコルビン酸や尿酸等の共存する易酸化性
妨害物質が正の誤差を与える場合があった。

【０００５】また、炭素電極等を用い、酸素以外の物質
を電子受容体としてグルコ−ス濃度を測定する際には、
酸素／酵素間の反応速度定数が他の電子受容体／酸素間
のそれに比べて大きいために、試料液中の微量溶存酸素
と酵素間の電子移動反応が先行する。その結果、前記溶
存酸素が測定結果に負の誤差を与える場合があった。さ
らに、白金等を電極材料として電極系を絶縁性基板上に
構築した場合、それらの電極が高抵抗を示し、測定結果
に影響を与える場合があった。また、白金が高価である
ために、大量生産する際等においてはコスト面で問題が
生じる。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明のバイオセンサ
は、絶縁性基板上に形成された作用極と対極を有する電
極系、および少なくとも酸化還元酵素を含む反応層を具
備し、前記作用極が少なくとも白金を含むことを特徴と
する。

【０００７】本発明の特定化合物の定量法は、絶縁性基
板上に形成された対極と白金を含む作用極とを有する電
極系および酸化還元酵素を含む反応層を具備するバイオ
センサを用い、前記酸化還元酵素と試料中の酸素および
特定化合物との反応により生成する過酸化水素を前記作
用極と対極間に電圧を印加した際に得られる酸化電流で
検知し、この酸化電流から前記特定化合物を定量するも
のである。また、本発明の特定化合物の定量法は、絶縁
性基板上に形成された対極と白金を含む作用極とを有す
る電極系および酸化還元酵素と電子受容体を含む反応層
を具備するバイオセンサを用い、前記酸化還元酵素、電
子受容体、試料中の酸素および特定化合物の反応により
生成する過酸化水素および前記電子受容体の還元体を前
記作用極と対極間に電圧を印加した際に得られる酸化電
流で検知し、この酸化電流から前記特定化合物を定量す
るものである。

【０００８】

【発明の実施の形態】本発明は、上記のように絶縁性基
板上に形成された電極系の作用極に白金を含有させるも
のである。作用極に白金を導入する方法としては、白金
材料を含むペースト材料を用いた印刷法により導入する
方法、および白金材料を含む溶液を電解液とした電気化
学的手法により導入する方法がある。後者の溶液は、さ
らに親水性高分子を含むことが好ましい。白金は、過酸
化水素の活性化過電圧を下げる効果を有する。故に、上
記の様に作用極に白金を含有させることによって、その
酸化電位を抑制することができる。すなわち、本発明に
よれば、作用極と対極間に印加する電圧を６００ｍＶ未
満、通常５００ｍＶ程度に下げることができる。そのた
め、易酸化性物質などの妨害物質による正の誤差を軽減
することができる。また、作用極に白金を含有させるこ
とによって、過酸化水素と還元型電子受容体を同時に酸
化することが可能となる。その結果、溶存酸素による負
の誤差を軽減することができる。

【０００９】電極系のリードには、銀を用いるのが好ま
しい。リ−ドを導入し導電性を向上させることで、電極
内部での電位勾配が除去され、より正確に電極電位を制
御することができる。また、白金と共にカ−ボンの様な
導電性物質を含有させることで、製造コストを引き下げ
ることができる。

【００１０】

【実施例】以下、本発明を実施例により説明する。 《実施例１》定量法の一例として、グルコ−スの定量に
ついて説明する。まず、定量に用いたグルコ−スセンサ
の作製方法について説明する。図１は、反応層を除いた
グルコ−スセンサの分解斜視図を示す。ポリエチレンテ
レフタレ−トからなる絶縁性の基板１上に、スクリ−ン
印刷により、銀ペーストからなるリード２、３を形成
し、次に、白金とカ−ボンの混合ペ−ストをスクリーン
印刷し、１２０℃で加熱乾燥することでそれぞれリード
２および３と導通した作用極４および対極５を形成し
た。白金とカーボンを混合することで、白金含有電極の
低温での形成を可能にした。次に、絶縁性ペ−ストから
なる絶縁層６を形成した。絶縁層６は、作用極４の外周
部を覆っており、これによって作用極４の露出部分の面
積を一定に保っている。さらに、絶縁層６は、リ−ド
２、３を部分的に覆っている。

【００１１】次に、前記電極系（作用極４、対極５）上
に、酵素としてＧＯＤ、および電子受容体としてフェリ
シアン化カリウムを含有する水溶液を滴下し、乾燥させ
ることで反応層を形成した。さらに、この反応層上に、
試料液の供給をより一層円滑にするために、レシチンの
有機溶媒溶液、例えばトルエン溶液を試料供給部（セン
サ先端部）から反応層上にわたって広げ、乾燥させるこ
とでレシチン層を形成し、スペ−サ−７およびカバ−８
を図１中、一点鎖線で示すような位置関係をもって接着
してグルコ−スセンサを作製した。

【００１２】このセンサに、試料液としてグルコ−ス水
溶液３μｌを試料供給孔となる切欠９より供給した。試
料液は空気孔１０部分まで達し、電極系上の反応層が溶
解した。試料液中のグルコ−ス、酸素、およびＧＯＤが
反応し、グルコ−スがグルコノラクトンに酸化され、酸
素が過酸化水素に還元される。一方、電子受容体として
含まれるフェリシアン化イオン、グルコ−ス、およびＧ
ＯＤが反応し、グルコ−スがグルコノラクトンに酸化さ
れ、フェリシアン化イオンがフェロシアン化イオンに還
元される。試料供給から所定時間経過後、作用極４と対
極５間に所定の電圧を印加することで、前記の過酸化水
素とフェロシアン化イオンを電解酸化し、電圧印加後５
秒後の電流値を測定した。その結果、試料液中のグルコ
−ス濃度に依存した電流応答が得られ、その電流応答
は、試料液中の酸素濃度に対して非依存性を示した。

【００１３】作用極に炭素電極を用いていた従来法、お
よび白金を電析した炭素電極を作用極に用いる方法に比
べ、グルコース濃度に対するセンサ応答のプロットにお
ける低濃度域（グルコ−ス濃度０〜３０ｍｇ／ｄｌ）で
の直線応答性が改良され、直線の傾きが、広い濃度範囲
（グルコース濃度〜５００ｍｇ／ｄｌ）にわたって大幅
に向上する結果が再現性良く得られた。この結果から推
測されるように、試料液中の酸素とフェリシアン化イオ
ンの双方が電子受容体として機能するため、酸素濃度の
変化をフェリシアン化イオンが補正することができる。
すなわち、消費されるグルコ−スの量が同じであれば、
消費される電子受容体の量は同じであり、酸素濃度が変
化するような試料液においても、その電流応答は酸素濃
度に依存しない。さらに、白金ペーストのみを用いて作
用極および対極を作製した以外は、全て上記と同じバイ
オセンサに比べて、その製造コストを大幅に削減するこ
とができた。

【００１４】《実施例２》ポリエチレンテレフタレ−ト
からなる絶縁性の基板１上に、スクリ−ン印刷により白
金ペ−ストからなるリード２、３、作用極４、および対
極５を形成するとともに、絶縁性ペ−ストからなる絶縁
層６を形成した。次に、前記電極系（作用極４、対極
５）上に、酵素としてＧＯＤを含有する水溶液を滴下
し、乾燥させることで反応層を形成した。次いで、実施
例１と同様に、レシチン層の形成、スペ−サ−７および
カバ−８の接着を順次行い、グルコ−スセンサを作製し
た。

【００１５】このセンサに、試料液としてグルコ−ス水
溶液３μｌを試料供給孔より供給すると、試料液は空気
孔１０部分まで達し、電極系上の反応層が溶解した。反
応層の溶解と同時に酵素反応が進行する。試料液中のグ
ルコ−ス、ＧＯＤおよび酸素が反応し、グルコ−スがグ
ルコノラクトンに酸化され、酸素が過酸化水素に還元さ
れる。試料供給から任意時間経過後、作用極４と対極５
間に所定の電圧を印加することでこの過酸化水素を電解
酸化し、電圧印加後５秒後の電流値を測定した。その結
果、試料液中のグルコ−ス濃度に依存した電流応答が得
られた。

【００１６】《実施例３》リード２、３、作用極４、お
よび対極５を、白金とカ−ボンの混合物のペ−ストを用
いて形成した他は、実施例１と同様にしてグルコ−スセ
ンサを作製した。実施例１と同様の測定を行なった結
果、試料液中のグルコ−ス濃度に依存した電流応答が得
られた。電極材料にカ−ボンを混合させることにより、
その製造コストを大幅に削減することができた。

【００１７】《実施例４》スクリ−ン印刷により銀ペ−
ストからなるリ−ド２および３、白金ペ−ストからなる
作用極４および対極５を形成した他は、実施例１と同様
にしてグルコ−スセンサを作製した。リードとして銀を
用いたので、電極系のシート抵抗が減少した。実施例１
と同様の測定を行なった結果、試料液中のグルコ−ス濃
度に依存し、酸素濃度に依存しない電流応答が得られ
た。

【００１８】《実施例５》実施例１と同様にして、絶縁
基板上に電極系を形成し、その電極系（作用極４、対極
５）上に、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）水溶
液を滴下し、乾燥させることでＣＭＣ層を形成した。次
に、前記ＣＭＣ層上に、酵素としてＧＯＤ、および電子
受容体としてフェリシアン化カリウムを含有する水溶液
を滴下し、乾燥させることで反応層を形成した。前記酵
素および電子受容体を含む水溶液を滴下すると、親水性
高分子であるＣＭＣの層は一度溶解し、その後の乾燥過
程で酵素などと混合された形で反応層を形成する。しか
し、攪拌等を伴わないため完全な混合状態とはならず、
電極系表面はＣＭＣのみによって被覆された状態とな
る。すなわち、酵素および電子受容体などが電極系表面
に接触しないために、電極系表面へのタンパク質の吸着
などを防ぐことができる。次に、実施例１と同様に、レ
シチン層を形成し、スペ−サ−、カバ−を接着すること
でグルコ−スセンサを作製した。実施例１と同様の測定
を行なった結果、実施例４と同様の結果が得られた。

【００１９】《実施例６》カーボンペ−ストを用いて作
用極４および対極５を作製した以外は、実施例１と同様
にして絶縁基板上に電極系を作製した。次に、ヘキサク
ロロ白金酸および酢酸鉛を含む水溶液を電解液として、
前記作用極上に白金を電析した。次に、実施例５と同様
に、前記電極系上にＣＭＣ層および反応層を形成した。
さらに実施例１と同様に、レシチン層を形成し、スペ−
サ−、カバ−を接着することでグルコ−スセンサを作製
した。実施例１と同様の測定を行なった結果、実施例４
と同様の結果が得られた。

【００２０】《実施例７》実施例６と同様にして絶縁基
板上にカーボンからなる電極系を作製した。次に、ヘキ
サクロロ白金酸および酢酸鉛を含むＣＭＣ水溶液を電解
液として、前記作用極上に白金を電析した。さらに、実
施例５と同様に、前記電極系上にＣＭＣ層および反応層
を形成した。電析された白金マトリックス中にＣＭＣが
含まれるため、微細構造に基づく高い疎水性を有する白
金表面が、弱い親水性に変化する。故に、ＣＭＣ層およ
び反応層をより均一に形成することができた。さらに、
実施例１と同様に、レシチン層を形成し、スペ−サ−、
カバ−を接着することでグルコ−スセンサを作製した。
実施例１と同様の測定を行なった結果、実施例４と同様
の結果が得られた。

【００２１】親水性高分子としては、上記実施例に示し
た以外に、ポリリジン等のポリアミノ酸、ポリビニルア
ルコール、ポリスチレンスルホン酸なども使用できる。
また、酵素としては、上記実施例に示したグルコースオ
キシダーゼ以外に、乳酸オキシダーゼ、コレステロール
オキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼなども使用でき
る。一方、電子受容体としては、上記実施例に示したフ
ェリシアン化カリウム以外に、ｐ−ベンゾキノン、フェ
ナジンメトサルフェート、メチレンブルー、フェロセン
誘導体なども使用できる。また、白金と混合する導電性
物質としては、上記実施例に示したカ−ボン以外にパラ
ジウム、金、ルテニウムなども使用できる。上記実施例
において酵素および電子受容体については試料液に溶解
する方式について示したが、これに制限されることはな
く、固定化によって試料液に不溶化させた場合にも適用
することができる。上記実施例では、作用極と対極のみ
の二極電極系について述べたが、参照極を加えた三電極
方式にすれば、より正確な測定が可能である。

【００２２】

【発明の効果】以上のように本発明によると、高性能を
有するバイオセンサを提供することができ、高い信頼性
を有する特定化合物の定量を行なうことができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の一実施例に用いたグルコ−スセンサの
反応層を除いた分解斜視図である。

【符号の説明】

１ 絶縁性の基板 ２、３ リ−ド ４ 作用極 ５ 対極 ６ 絶縁層 ７ スペ−サ− ８ カバ− ９ 試料供給孔を形成する切欠 １０ 空気孔

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 絶縁性基板上に形成された作用極と対極
   を有する電極系、および少なくとも酸化還元酵素を含む
   反応層を具備し、前記作用極が少なくとも白金を含むこ
   とを特徴とするバイオセンサ。
2. 【請求項２】 反応層が、さらに電子受容体を含む請求
   項１に記載のバイオセンサ。
3. 【請求項３】 反応層が、さらに親水性高分子を含む請
   求項１または２に記載のバイオセンサ。
4. 【請求項４】 作用極が、さらに導電性物質を含む請求
   項１〜３のいずれかに記載のバイオセンサ。
5. 【請求項５】 銀リ−ドを有する請求項１〜４のいずれ
   かに記載のバイオセンサ。
6. 【請求項６】 絶縁性基板上に形成された対極と白金を
   含む作用極とを有する電極系および酸化還元酵素を含む
   反応層を具備するバイオセンサの製造方法であって、前
   記作用極の白金を、白金材料を含むペースト材料を用い
   た印刷法により導入するバイオセンサの製造方法。
7. 【請求項７】 絶縁性基板上に形成された対極と白金を
   含む作用極とを有する電極系および酸化還元酵素を含む
   反応層を具備するバイオセンサの製造方法であって、前
   記作用極の白金を、白金材料を含む溶液を電解液とした
   電気化学的手法により導入するバイオセンサの製造方法
8. 【請求項８】 前記溶液が、さらに親水性高分子を含む
   請求項７に記載のバイオセンサの製造方法。
9. 【請求項９】 絶縁性基板上に形成された対極と白金を
   含む作用極とを有する電極系および酸化還元酵素を含む
   反応層を具備するバイオセンサを用い、前記酸化還元酵
   素と試料中の酸素および特定化合物との反応により生成
   する過酸化水素を前記作用極と対極間に電圧を印加した
   際に得られる酸化電流で検知し、この酸化電流から前記
   特定化合物を定量することを特徴とする特定化合物の定
   量法。
10. 【請求項１０】 絶縁性基板上に形成された対極と白金
    を含む作用極とを有する電極系および酸化還元酵素と電
    子受容体を含む反応層を具備するバイオセンサを用い、
    前記酸化還元酵素、電子受容体、試料中の酸素および特
    定化合物の反応により生成する過酸化水素および前記電
    子受容体の還元体を前記作用極と対極間に電圧を印加し
    た際に得られる酸化電流で検知し、この酸化電流から前
    記特定化合物を定量することを特徴とする特定化合物の
    定量法。