CN106885803B

CN106885803B - 一种抗干扰能力强且准确度高的酶法乙醇检测试剂

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Publication number: CN106885803B
Application number: CN201510943589.3A
Authority: CN
Inventors: 罗维晓; 甘宜梧; 包兴艳; 肖慧
Original assignee: Biobase Biodustry Shandong Co Ltd
Current assignee: Biobase Biodustry Shandong Co Ltd
Priority date: 2015-12-16
Filing date: 2015-12-16
Publication date: 2019-06-28
Anticipated expiration: 2035-12-16
Also published as: CN106885803A

Abstract

本发明涉及血清乙醇检测技术领域，特别涉及一种抗干扰能力强且准确度高的酶法乙醇（ALC）检测试剂，试剂R1主要包含缓冲液、草酸铵、盐酸肼、亚硝酸铁氰化钾、离子平衡剂、抗坏血酸氧化酶、保护剂、表面活性剂、NAD、防腐剂、试剂R2中主要有缓冲液、保护剂、重金属离子螯合剂、乙醇脱氢酶、防腐剂。在试剂R1中添加了草酸铵和盐酸肼能够有效地去除乳酸脱氢酶和羟丁酸脱氢酶的干扰，加入少量的亚硝酸铁氰化钾则有效地去除胆红素等还原性物质的干扰，从而大大提高试剂的抗干扰能力，加入抗坏血酸氧化酶，则可以有效地去除抗血酸的干扰；重金属离子螯合剂氨基三乙酸的加入则非常好的去除重金属离子尤其是钙离子对脱氢酶活性的干扰，从而提高乙醇脱氢酶的活性，使试剂成为一种抗干扰能力强且准确度高的检测试剂。

Description

一种抗干扰能力强且准确度高的酶法乙醇检测试剂

技术领域

本发明涉及一种抗干扰能力强且准确度高的血清酶法乙醇（ALC）检测试剂，属于临床体外检测技术领域。

背景技术

血液中的乙醇一般是饮酒摄入，被胃肠道吸收后进入血液，由肝脏以恒定速率代谢清除。在代谢过程中产生乙醛，其可与蛋白结合，形成乙醛-蛋白结合物可直接作为细胞毒物质直接引起细胞损伤，也可作为具有抗原性的刺激物，产生抗体。乙醇对身体也有直接毒性作用，长期过量饮酒容易形成脂肪肝、酒精性肝炎、肝硬化、酒精性胰腺炎以及酒依赖性精神障碍等疾病。怀孕妇女饮酒可导致胎儿精神与运动器官发育不良以及胎儿酒精综合症。酒依赖者一次性饮酒过量可引起急性中毒，其中毒症状与血中乙醇浓度有一定相关性，血乙醇浓度越高，中毒症状越深。因此，根据临床症状和血中乙醇浓度可以判断中毒程度。

目前检测血液酒精的方法较多，常见的有早期的蒸馏氧化法、渗透压法，化学比色法，酶法，均相酶免测定法，气相色谱法等检测方法，其中血液中酒精浓度测定早期用蒸馏氧化法和渗透压法，准确性和特异性均较差，均相酶免测定法，气相色谱分析法，虽然准确性高，但仪器价格昂贵，一般医院难以推广，随着乙醇脱氢酶提取技术的不断优化，酶法试剂检测血液乙醇的检测方法逐渐推广而来，并且酶法检测血清乙醇具有操作简单，价格低廉，能够较好的配合全自动生化分析仪器的使用，但是随着逐步的使用发现试剂非常容易受到血液中乳酸脱氢酶，羟丁酸脱氢酶等酶类的影响，容易时检测结果偏高，造成假阳性升高，而对于尿素、抗坏血酸等物质则容易产生负干扰，使检测结果偏低，甚至出现负值，这给临床使用带来较大的问题。

为了能够很好的去除血液乙醇在检测中各种不同物质的干扰，提高检测的准确度，增强抗干扰能力，特发明了一种抗干扰能力强检测结果准确的酶法检测血液乙醇的检测试剂。

发明内容

本发明涉及一种抗干扰能力强且准确度高的酶法乙醇（ALC）检测试剂，以及检测方法。

检测原理：

在乙醇脱氢酶（ADH）的存在下，乙醇被氧化型辅酶（NAD）氧化成乙醛，并生成还原型辅酶NADH，在波长340nm处检测吸光度变化率，其变化程度与样本中的乙醇的含量成正比。

乙醇脱氢酶

乙醇+NAD乙醛+NADH

一种抗干扰能力强且准确度高的酶法乙醇（ALC）检测试剂试剂组成成分如下：

本发明是通过以下步骤得到的：

试剂 R1：

缓冲液 100mmol/L

草酸铵 2mmol/L-5mmol/L

盐酸肼 1mmol/L-3mmol/L

亚硝酸铁氰化钾 20umol/L-50umol/L

离子平衡剂 10g/L-30g/L

抗坏血酸氧化酶 500U/L-2KU/L

保护剂 5g/L-10g/L

表面活性剂 1ml/L-5ml/L

NAD 3mmol/L-5mmol/L

防腐剂 0.1g/L-1g/L

试剂 R2：

缓冲液 50mmol/L

保护剂 5g/L-10g/L

重金属离子螯合剂 10mmol/L-20mmol/L

乙醇脱氢酶 450U/L-600U/L

防腐剂 0.1g/L-1g/L

所述的一种抗干扰能力强且准确度高的乙醇（ALC）检测试剂，试剂R1中缓冲液为25℃，PH=9.5浓度为100mmol/L的硼砂缓冲液；

所述的一种抗干扰能力强且准确度高的乙醇（ALC）检测试剂，试剂R2中缓冲液为25℃，PH=6.5浓度为50mmol/L的PIPES缓冲液；

所述的一种抗干扰能力强且准确度高的乙醇（ALC）检测试剂，试剂R1中所述离子平衡剂为氯化钠；

所述的一种抗干扰能力强且准确度高的乙醇（ALC）检测试剂，试剂R1所述防腐剂为硫酸庆大霉素；

所述的一种抗干扰能力强且准确度高的乙醇（ALC）检测试剂，试剂R1所述保护剂为壳聚糖；

所述的一种抗干扰能力强且准确度高的乙醇（ALC）检测试剂，试剂R1所述表面活性剂为十二烷基二甲基甜菜碱；

所述的一种抗干扰能力强且准确度高的乙醇（ALC）检测试剂，试剂R2所述的保护剂为NADH2；

所述的一种抗干扰能力强且准确度高的乙醇（ALC）检测试剂，试剂R2所述的重金属离子螯合剂为氨基三乙酸；

所述的一种抗干扰能力强且准确度高的乙醇（ALC）检测试剂，试剂R2中所述的防腐剂为硫酸庆大霉素；

所述的一种抗干扰能力强且准确度高的乙醇（ALC）检测试剂，使用全自动生化分析仪利用终点法进行测定，检测主波长为340nm。

所述的试剂为液态双试剂，试剂比例为4:1。

本发明的创新之处：

1）通过优化反应体系，在试剂R1中优先选择了硼砂缓冲液，能够有效地提供较好的偏中强碱性环境，在试剂R2中优先选择了PIPES生物缓冲体系，对乙醇脱氢酶具有较好的保护作用；

2）在试剂R1中添加了草酸铵和盐酸肼能够有效地去除乳酸脱氢酶和羟丁酸脱氢酶的干扰，加入少量的亚硝酸铁氰化钾则有效地去除胆红素等还原性物质的干扰，从而大大提高试剂的抗干扰能力，加入抗坏血酸氧化酶，则可以有效地去除抗血酸的干扰；

3）试剂R1中壳聚糖的加入则能够有效地保护NAD(氧化型辅酶I)，试剂R2中的保护剂NADH2的加入则能够非常好的提高乙醇脱氢酶的稳定性尤其是热稳定性，从而保证检测结果的持久稳定准确；

4）重金属离子螯合剂氨基三乙酸的加入则非常好的去除重金属离子尤其是钙离子对脱氢酶活性的干扰，从而提高乙醇脱氢酶的活性；

5）本发明还优先选择了硫酸庆大霉素作为防腐抑菌剂，既起到了良好的防腐抑菌的作用，还起到了不破坏乙醇脱氢酶的活性。

附图说明

图1实施例2与对照的相关性曲线图，

图2实施例3与对照的相关性曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明：

实施例1

一种市场现有的血液乙醇检测试剂组成成分：

试剂 R1：

TRIS缓冲液 100mmol/L

曲拉通-100 1ml/L-5ml/L

NAD 3mmol/L-5mmol/L

试剂 R2：

磷酸盐缓冲液 50mmol/L

乙醇脱氢酶 450U/L-600U/L。

实施例2

一种抗干扰能力强且准确度高的乙醇（ALC）检测试剂试剂，组成成分：

试剂 R1：

硼酸缓冲液 100mmol/L

草酸铵 2mmol/

盐酸肼 1mmol/

亚硝酸铁氰化钾 20umol/

氯化钠 10g/

抗坏血酸氧化酶 500U/L

壳聚糖 5g/L

十二烷基二甲基甜菜碱 1ml/L

NAD 3mmol/L

硫酸庆大霉素 0.1g/L

试剂 R2：

PIPES 50mmol/L

NADH2 5g/L

氨基三乙酸 10mmol/L

乙醇脱氢酶 450U/L

硫酸庆大霉素 0.1g/L。

实施例3

一种抗干扰能力强且准确度高的乙醇（ALC）检测试剂，试剂组成成分增加的方案：

1）试剂R1：

硼酸缓冲液 100mmol/L

草酸铵 5mmol/L

盐酸肼 3mmol/L

亚硝酸铁氰化钾 50umol/L

氯化钠 30g/L

抗坏血酸氧化酶 2KU/L

壳聚糖 10g/L

十二烷基二甲基甜菜碱 5ml/L

NAD 5mmol/L

硫酸庆大霉素 1g/L；

2）试剂 R2：

PIPES 50mmol/L

NADH2 10g/L

氨基三乙酸 20mmol/L

乙醇脱氢酶 600U/L

硫酸庆大霉素 1g/L；

3）本实施例试剂的使用方法：

本实施例描述的血清乙醇检测试剂，在使用时采用具有双试剂功能的全自动生化分析仪，如日立7180全自动分析仪等，利用速率法进行测定；将R1和R2按照4:1的比例放置到对应的试剂位上，在样品盘的对应位置放置好蒸馏水、标准品和样本，操作如表1：

表1 实施例1、实施例2和实施例3试剂检测方法

计算：乙醇含量（mmol/L）＝（∆A测定÷∆A标准）×C标准

4）干扰性试验：取新鲜混合血清，分成2等份，然后将每等份再分成5等份，加入不同的干扰物质，使其在血清中的浓度达到表2的要求。然后分别用实施例1所得试剂，与市场现有的的血清乙醇试剂同时对比测定血清中乙醇的含量，对照组测定结果与加入不同干扰物质后各组的测定结果见表2。相对偏差(%)=(干扰样本的测定均值－对照样本的测定均值)/对照样本的测定均值×100%。

由表2可以看出，实施例2和实施例3试剂在抗坏血酸≤50mg/dL、胆红素≤40mg/dL、尿酸≤40mg/dL乳酸脱氢酶≤2000U/L、氢丁酸脱氢酶≤2400U/L对测试结果没有明显干扰。而对照组试剂在上述浓度干扰物质存在时，受到明显干扰，这说明通过优化反应缓冲体系，增加抗干扰物质之后，实施例2和实施例3中的试剂的抗干扰性能显著提高，远远优于实施例1中的对比试剂。

表2实施例试剂抗干扰性能比较

5)相关性实验：利用实施例2和实施例3配方配制试剂，与均相免疫测定法检测血清乙醇进行对照检测，同时检测了20个临床血清样本，检测结果如表3所示。并获得了两种试剂的相关性曲线（如图1所示），通过检测结果显示，两个试剂盒的相关系数为0.9997，说明了两者有极大的相关性。

表3 实施例2和实施例3试剂与均相免疫测定法检测血清乙醇对比检测结果

Claims

1.一种抗干扰能力强且准确度高的酶法乙醇(ALC)检测试剂，试剂组成成分如下：

试剂R1：

试剂R2：

所述试剂R1中缓冲液为25℃，pH为9.0的硼砂缓冲液，所述试剂R2中缓冲液为25℃，pH为6.5的PIPES缓冲液，所述试剂R1和试剂R2中的保护剂分别为壳聚糖和NADH2。

2.根据权利要求1所述的一种抗干扰能力强且准确度高的酶法乙醇(ALC)检测试剂，其特征在于试剂R1中加入了去干扰剂草酸铵、盐酸肼、亚硝酸铁氰化钾和抗坏血酸氧化酶。

3.根据权利要求1所述的一种抗干扰能力强且准确度高的酶法乙醇(ALC)检测试剂，其特征在于所述表面活性剂为十二烷基二甲基甜菜碱。

4.根据权利要求1所述的一种抗干扰能力强且准确度高的酶法乙醇(ALC)检测试剂，其特征在于试剂R1和试剂R2所述防腐剂为硫酸庆大霉素。

5.根据权利要求1所述的一种抗干扰能力强且准确度高的酶法乙醇(ALC)检测试剂，其特征在于试剂R2所述重金属离子螯合剂为氨基三乙酸。