JP2004267067A - アルコール分析方法 - Google Patents

Abstract

【課題】アルコールを定性的または定量的に分析できる新たなアルコールの分析方法を提供する。
【解決手段】検体中のアルコールをアルコールオキシダーゼにより酸化して過酸化水素を生成させ、酸化により発色する発色基質の存在下、前記過酸化水素をペルオキシダーゼにより還元して、前記発色基質を還元型から酸化型に変換し、還元型グルタチオンによって、前記発色基質を酸化型から還元型に再度変換する。このような方法によって発色基質の発色程度を調整すれば、その発色程度から検体中のアルコールを定性的もしくは定量的に分析できる。
【選択図】 図１

Description

【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、検体中のアルコールを定性分析もしくは定量分析する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来から、ドライバーの飲酒運転取締りのために、血中アルコール濃度の測定が行われている。このようなアルコール濃度の測定方法としては、例えば、風船等に呼気を採取し、一定量の呼気を、酸化剤を含有する支持体が充填されたカラムに通し、前記酸化剤の色変化により測定する方法がある。そして、この呼気中のアルコール濃度から血中のアルコール濃度を推定することができる。しかしながら、このような方法は手間やコストがかかるという問題があった。
【０００３】
前記問題に対して、多孔質材に、発色色素と酵素を含有させた試験紙が開発されている（例えば、特許文献１参照）。このような試験紙によれば、唾液を前記試験紙に点着するだけで、前記唾液中のアルコールと前記発色色素との反応により発色が観察されるため、非常に低コストであり、迅速かつ簡便にアルコール検出を行うことができる。そして、この唾液中のアルコール濃度から、血中アルコール濃度を推定することができる。しかしながら、発色基質として使用されているニトロブルーテトラゾリウムは、人体に有害であり、例えば、吸い込んだり、経皮吸収されることによって、呼吸器、皮膚、眼等が刺激されると言われている。したがって、前述のような試験紙にニトロブルーテトラゾリウムを含有させた場合、取り扱いに注意する必要があり安全性の面で問題がある。
【０００４】
【特許文献１】
特開平７−２３７９８号公報
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明の目的は、前記問題を解決可能な新たなアルコールの分析方法の提供である。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために、本発明の分析方法は、検体中のアルコールをアルコールオキシダーゼにより酸化して過酸化水素を生成させ、
酸化により発色する発色基質の存在下、前記過酸化水素をペルオキシダーゼで還元することによって、前記発色基質を還元型から酸化型に変換し、
前記発色基質の発色程度からアルコールを定性分析もしくは定量分析する方法であって、
還元型グルタチオン（以下、「ＧＳＨ」）により前記酸化型の発色基質を還元して、発色程度を調整することを特徴とする。
【０００８】
本発明者らは、前述のような従来使用されている安全性の低い発色基質に代えて、人体に無害の発色基質である２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）等を使用したアルコールの分析方法の確立を試みた。しかしながら、このような基質は、発色感度や発色強度が非常に高いため、低濃度（例えば、１ｍＭ以下）のアルコールであっても強い発色を示し、目視や吸光度測定等、色の濃淡でアルコール濃度を判断することは困難であった。このため、発色はするものの、検体中のアルコールが一定濃度以上であるのか、それ未満であるのか、また、実際にどの程度のアルコール濃度であるのかを判断すること出来なかった。特に、アルコールを摂取してから１時間後の血中アルコール濃度は、コップ１杯のビール（２５０ｍｌ程度）の場合３ｍＭ程度であり、１合の清酒の場合１０ｍＭである。しかし、前述のような飲酒運転の取締り等において、前記ＡＢＴＳを用いてアルコール検査を行うと、１０ｍＭ以上のアルコール濃度に対してはもちろんのこと、１ｍＭ程度の低濃度であっても同様に完全に発色してしまう。このため、前記ＡＢＴＳをアルコール検査に適用することが不可能であった。また、唾液検体の希釈等は、手間がかかり測定精度にも問題があった。そこで、本発明者らはさらに鋭意研究を重ねた結果、ＧＳＨを用いた酸化還元系を付加することによって、感度が極めて高く、人体に安全な発色基質を用いて、アルコールの定性分析もしくは定量分析が可能になることを見出した。
【０００９】
このように、ＧＳＨによれば、過酸化水素との酸化反応（発色反応）により発色した発色基質を、酸化型から還元型に再度変換できるため、前述のように発色強度や発色感度が高い基質であっても、その発色程度を調整することができる。つまり、このような方法で発色程度を調整することにより、従来であれば、強い発色が観察されたアルコール濃度においても、発色の抑制や、発色の消失を実現できるため、所望のアルコール濃度で発色させることが可能になるのである。このため、所望のアルコール濃度（例えば、２０ｍＭ以上）で発色するように調整すれば、例えば、前述のような飲酒運転取り締まりにおけるアルコール検査等にも適用でき、この他にも、例えば、生化学的実験や臨床検査等にも適用できる。なお、本発明の分析方法によれば、アルコールが一定濃度以上であるか否かだけでなく、どの程度のアルコール濃度であるかを定量分析することも可能である。
【００１０】
つぎに、本発明の分析試薬は、少なくとも、酸化により発色する発色基質、ＧＳＨ、アルコールオキシダーゼおよびペルオキシダーゼを含むことを特徴とし、このような分析試薬は、前記本発明の分析方法に使用することができる。また、この分析試薬を保持させた多孔質材は、分析用具として使用でき、迅速かつ簡便なアルコール分析が可能になるため、前述のような様々な分野におけるアルコールの定性分析もしくは定量分析に有用である。
【００１１】
【発明の実施の形態】
前述のように、本発明の分析方法は、検体中のアルコールをアルコールオキシダーゼにより酸化して過酸化水素を生成させ、
酸化により発色する発色基質の存在下、前記過酸化水素をペルオキシダーゼで還元することによって、前記発色基質を還元型から酸化型に変換し、
前記発色基質の発色程度からアルコールを定性分析もしくは定量分析する方法であって、
ＧＳＨにより前記酸化型の発色基質を還元して、発色程度を調整することを特徴とする。
【００１２】
本発明の分析方法においては、前述のように、ＧＳＨによって前記発色基質が酸化型から還元型に変換されるため、例えば、前記ＧＳＨの量を調整することによって発色程度を制御できる。
【００１３】
前記発色基質としては、可逆的に酸化型と還元型に変換されるものであれば特に制限されないが、例えば、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、３，３’−５，５’−テトラメチルベンジジン（３，３’−５，５’−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ：ＴＭＢ）、３，３’−ジアミノベンジジン（３，３’−Ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ：ＤＡＢ）、３−アミノ−９−エチルカルバゾール（３−Ａｍｉｎｏ−９− ｅｔｈｙｌｃａｒｂａｚｏｌｅ：ＡＥＣ）、ｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロリド（ｏ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｄｉａｍｉｎｅ ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ：ＯＰＤ）、グアイアコール（Ｇｕａｉａｃｏｌ）、ピロガロール（Ｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ）、これらの誘導体等の基質があげられ、この中でも好ましくは、ＡＢＴＳ、ＴＭＢ、ＤＡＢ、ＡＥＣ、ＯＰＤである。この中でも、特にＡＢＴＳは、酸化型で緑青色、還元型で無色であり、人体にも影響がなく発色感度に優れることから、発色程度を調整できる本発明の分析方法に適用することが好ましい。
【００１４】
本発明は、前述のようにＧＳＨを用いて発色程度を調整するだけでなく、例えば、さらに以下のような工程を併用することによって発色程度を抑制することもできる。つまり、酸化型の前記発色基質を還元することによって生成した酸化型グルタチオン（以下、「ＧＳＳＧ」という）を、還元型補酵素の存在下、グルタチオンレダクターゼにより還元し、そのＧＳＨで、残存する酸化型の発色基質をさらに還元することによって、発色程度を調整することが好ましい。
【００１５】
このような工程をさらに有していれば、前記発色基質を酸化型から還元型に変換することによって、ＧＳＨから変換されたＧＳＳＧを、還元型補酵素によって還元型に再度戻すことができる。このため、還元型に戻ったグルタチオン（ＧＳＨ）は、残存する酸化型の発色基質をさらに還元して、非発色の還元型に変換できるのである。そうすると、酸化型の発色基質の量をさらに低減させて、発色を抑制することが出来る。つまり、ＧＳＳＧとＧＳＨとの変換サイクルが構築されるため、前記サイクル数に応じて、より一層発色程度を低減できるのである。
【００１６】
このような方法は、例えば、前記還元型補酵素の量を調整することによって、前記発色程度を調整することができる。
【００１７】
前記還元型補酵素としては、例えば、ＮＡＤＰＨ（ＮＡＤＰＨ＋Ｈ^＋）やＮＡＤＨ等の補酵素があげられ、この中でも好ましくは、ＮＡＤＰＨである。
【００１８】
本発明は、前述のようにＧＳＨおよび還元型補酵素による発色程度の調整に加えて、例えば、ＧＳＨへの変換によって生成した酸化型補酵素を、電子供与体の存在下、酸化還元酵素により還元する工程を併用することによって、発色程度をさらに減少させることもできる。この場合、例えば、前記電子供与体の量を調整することによって前記発色程度を調整できる。
【００１９】
さらにこのような工程を有していれば、ＧＳＳＧをＧＳＨに変換することによって生成した酸化型補酵素を、前記電子供与体によって還元型に再度戻すことができる。このため、還元型に戻った補酵素は、残存するＧＳＳＧをさらに還元して、ＧＳＨを生成する。そうすると、このＧＳＨによって、前述と同様に酸化型の発色基質の還元反応が生じるのである。つまり、酸化型補酵素と還元型補酵素の変換サイクル、およびＧＳＳＧとＧＳＨの変換サイクルがそれぞれ構築され、これらの一連の連鎖反応によって、より一層発色程度を低減できるのである。
【００２０】
前記電子供与体としては、例えば、グルコース６リン酸（Ｇ６Ｐ）、イソクエン酸、リンゴ酸、６−ホスホグルコン酸、Ｌ−キシリトール、Ｌ−グロン酸、Ｌ−グロノ−γ−ラクトン、アルジトールおよびグリセロール等があげられ、この中でも好ましくはＧ６Ｐ、イソクエン酸、リンゴ酸であり、より好ましくはＧ６Ｐである。
【００２１】
前記酸化還元酵素としては、例えば、Ｇ６Ｐ脱水素酵素、イソクエン酸脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素、Ｌ−キシロース還元酵素、グルクロン酸還元酵素、グルクロノラクトン還元酵素、アルドース還元酵素およびグリセロール脱水素酵素からなる群から選択された少なくとも一つの酵素が好ましく、より好ましくはＧ６Ｐ脱水素酵素、イソクエン酸脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素であり、特に好ましくはＧ６Ｐ脱水素酵素である。
【００２２】
このような分析方法を適用する検体としては、特に制限されないが、例えば、唾液、血液、尿、アルコール溶液等の液状検体があげられる。また、気体中のアルコールを分析する場合には、例えば、適当な溶媒に前記気体を溶存させて、その溶液を検体とすることが好ましく、固体中のアルコールを分析する場合には、適当な溶媒に前記固体を浸漬してアルコールを抽出した抽出液を検体とすることが好ましい。この中でも、唾液や尿、アルコール溶液を検体とすることが好ましい。このような方法によれば、簡便かつ迅速にアルコールを定性的または定量的に分析できるため、例えば、飲酒運転の取締り等におけるアルコール分析に有用である。
【００２３】
本発明の分析方法は、例えば、各種酵素の安定性や至適ｐＨ等の点から、ｐＨ６．０〜８．０の範囲で行うことが好ましく、より好ましくは６．５〜７．６であり、特に好ましくは７．０〜７．５である。また、反応温度は、例えば、１５〜３５℃の範囲が好ましく、より好ましくは２０〜３５℃であり、特に好ましくは２５〜３０℃である。
【００２４】
次に、本発明の分析方法における反応メカニズムの一例を、図１に具体的に示し、同図を用いて説明する。
【００２５】
まず、酸素存在下、検体中のアルコールをアルコールオキシダーゼにより酸化して、過酸化水素およびアルデヒドを生成させる。そして、発色基質ＡＢＴＳの存在下、前記過酸化水素をペルオキシダーゼで還元することによって、前記発色基質ＡＢＴＳを、無色の還元型（ＡＢＴＳ_ＲＥＤ）から緑青色の酸化型（ＡＢＴＳ_ＯＸ）に変換する。さらに、この酸化型ＡＢＴＳは、ＧＳＨによって、非酵素的に還元型ＡＢＴＳに変換され無色に戻り、一方、前記ＧＳＨはＧＳＳＧに変換される。まず、この段階において、前記ＧＳＨによって前記酸化型ＡＢＴＳが減少し、第１段階の発色制御が行われる。
【００２６】
つぎに、前記ＧＳＳＨを、還元型補酵素ＮＡＤＰＨ＋Ｈ^＋の存在下、グルタチオンレダクターゼにより還元する。この反応によって、ＧＳＳＧはＧＳＨに再度変換され、前記ＮＡＤＰＨは、酸化型のＮＡＤＰ^＋となる。このため、再度の変換により生成したＧＳＨは、前記第１段階の発色制御、すなわち、酸化型ＡＢＴＳの還元に使用されるため、さらに第２段階の発色制御が行われる。
【００２７】
さらに、前記ＮＡＤＰ^＋を、電子供与体Ｇ６Ｐの存在下、Ｇ６Ｐ脱水素酵素により還元する。この反応によって、ＮＡＤＰ^＋はＮＡＤＰＨに再度変換され、前記Ｇ６Ｐは、酸化型の６−ホスホグルコン酸となる。このため、再度生成された還元型ＮＡＤＰＨは、前記第２段階の発色制御、すなわち、ＧＳＳＧの還元に使用され、これによって第１段階における酸化型ＡＢＴＳの還元が促進されるため、さらに第３段階目の発色制御が行われることとなる。このような発色の制御によって、ある一定のアルコール濃度に満たない場合は、発色しないように調整することが可能である。
【００２８】
本発明の分析方法において、前記発色程度の制御は、例えば、前記第１段階の発色制御を行うのみでもよいし、前記第１および第２段階の発色制御を行うのみでもよい。制御の程度は、例えば、検出したいアルコール濃度や、検体量等に応じて適宜決定することができる。
【００２９】
以上のように、各段階において発色を制御する場合、例えば、検出したいアルコール濃度に応じて、各成分の割合を決定することが好ましい。割合を変化させる成分としては、例えば、ＧＳＨ、還元型補酵素、電子供与体があげられ、この中でも、最終段階の電子供与体の割合を変化させることが好ましい。このように各成分の量を変化させれば、例えば、発色により検出できるアルコールの最低濃度を設定することができる。つまり、所定のアルコール濃度の場合に、はじめて発色が見られるようにすることが可能となり、このため、一定のアルコール濃度であるか否かを容易に判断することが可能になる。
【００３０】
このような方法によって、例えば、５〜５０ｍＭのアルコール濃度を定性的または定量的に検出することが可能になる。
【００３１】
本発明の分析方法は、例えば、液系の分析系、ドライ系の分析系のいずれで行ってもよい。前記液系の分析系の場合は、例えば、後述する本発明の分析試薬を溶解した液体と、唾液等の検体とを混合し、その発色を目視で観察したり、吸光度を測定すること等によって、アルコール濃度を判定できる。また、前記ドライ系の分析系の場合は、例えば、多孔質材に前記分析試薬を保持させ、これに液体の検体を添加し、前記液系と同様に目視や吸光度測定によって濃度を判定できる。ドライ系の場合には、例えば、後述する本発明の分析用具等が使用できる。これらの方法については、具体的に、以下の分析試薬や分析用具において説明する。
【００３２】
つぎに、本発明の分析方法に使用する分析試薬は、前述のように、少なくとも、酸化により発色する発色基質、ＧＳＨ、アルコールオキシダーゼおよびペルオキシダーゼを含む。この分析試薬は、例えば、各構成成分が全て混合された試薬でもよいし、反応時に混合する試薬であってもよい。また、液体試薬であってもよいし、粉末状試薬であってもよい。液体試薬の場合は、例えば、これに検体を添加し、発色を確認することでアルコールの分析を行うことができる。また、粉末状試薬の場合は、例えば、使用時に適当な溶媒に溶解してから、検体を添加することもできるし、直接、液状検体を添加してもよい。なお、前記発色基質としては、前述と同様のものが使用できる。
【００３３】
また、本発明の分析試薬は、さらに、還元型補酵素およびグルタチオンレダクターゼを含むことが好ましく、前記還元型補酵素としては、前述と同様のものがあげられる。
【００３４】
また、本発明の分析試薬は、さらに、電子供与体、および前記電子供与体を酸化して、前記酸化型補酵素を還元する酵素（前記「酸化還元酵素」と同じ）を含むことが好ましく、前記電子供与体としては、前述と同様のものがあげられる。また、前記酸化還元酵素としては、前述と同様にＧ６Ｐ脱水素酵素等が使用できる。
【００３５】
前記分析試薬が液状の場合、例えば、前記各構成成分を適当な溶媒に溶解していることが好ましい。前記溶媒としては、例えば、緩衝液、水等があげられるが、酵素の安定性や至適ｐＨ等の点から、緩衝液であることが好ましい。前記緩衝液としては、例えば、ナトリウム−リン酸緩衝液、カリウム−リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、トリスヒドロキシメチルアミノメタン緩衝液等があげられ、この中でも好ましくはナトリウム−リン酸緩衝液、カリウム−リン酸緩衝液等である。また、前記緩衝液のｐＨは、例えば、６．５〜８．０の範囲が好ましく、より好ましくは６．５〜７．６であり、特に好ましくは７．０〜７．５である。
【００３６】
また、本発明の分析試薬が粉末状の場合は、例えば、前記構成成分を前述のような溶媒に溶解した後、この溶解液を凍結乾燥すること等によって調製できる。
【００３７】
つぎに、本発明の分析用具は、多孔質材に、前記本発明の分析試薬が保持されている。このような分析用具は、例えば、前記本発明の分析試薬を、後述するような適当な溶媒に溶解・分散し、その試薬液に前記多孔質材を浸漬した後、これを乾燥することによって作製できる。
【００３８】
前記多孔質材としては、例えば、検体が展開・保持されるものであればよい。具体的には、ろ紙や、樹脂製シート等があげられ、前記樹脂としては、例えば、例えば、ポリエステル、ポリスルホン、ポリカーボネート、セルロースアセテート等、従来公知の材料があげられる。また、その大きさも特に制限されず、使用目的に応じて適宜決定できる。
【００３９】
前記分析用具において、前記分析試薬の含有量は、例えば、使用する多孔質材の種類、検出したいアルコール濃度等に応じて適宜決定できる。具体的には、前記アルコール濃度が２０ｍＭの場合（つまり、前記２０ｍＭ以上の場合のみ発色）、前記多孔質材１ｃｍ^３あたり、前記発色基質０．２〜３．０μｍｏｌ、ＧＳＨ０．２〜１．５μｍｏｌ、アルコールオキシダーゼ３０〜２５０Ｕ、およびＰＯＤ５０〜３００Ｕの範囲であることが好ましく、前記発色基質０．３〜１．８μｍｏｌ、ＧＳＨ０．４〜１．２μｍｏｌ、アルコールオキシダーゼ８０〜２５０Ｕ、およびＰＯＤ１００〜３００Ｕの範囲であり、特に好ましくは前記発色基質０．６〜１．０μｍｏｌ、ＧＳＨ０．４〜０．６μｍｏｌ、アルコールオキシダーゼ１２５〜２５０Ｕ、およびＰＯＤ２００〜３００Ｕの範囲である。なお、前述のような他の酵素についても同様である。
【００４０】
そして、前記アルコール濃度を２０ｍＭより高く設定する場合には、例えば、ＧＳＨの含有量を増加すればよい。前記２０ｍＭより高く、例えば、３０ｍＭに設定する場合、前記条件のままでは２０ｍＭの検体についても発色が生じてしまう。しかし、前記ＧＳＨ含有量を増加させれば、前記発色基質を酸化型からさらに還元型に変換できるため、２０ｍＭのアルコール濃度であっても発色がみられないようになり、それより高い３０ｍＭのアルコール濃度の場合に発色が生じるようになる。一方、検出するアルコール濃度を２０ｍＭより低く、例えば、１０ｍＭに設定する場合には、前記ＧＳＨ含有量を減少させればよい。これによって、前記発色基質の酸化型から還元型への変換を抑制できるため、より低い濃度でも発色がみられるようになる。
【００４１】
分析用具に供給する検体量は、特に制限されないが、例えば、分析用具１ｃｍ^３あたり０．５〜１．０ｍｌの範囲が好ましく、より好ましくは０．６〜０．８ｍｌであり、特に好ましくは０．６ｍｌである。
【００４２】
また、前記分析用具は、さらに、還元型補酵素およびグルタチオンレダクターゼを含有してもよい。これらを含有することによって、例えば、生成したＧＳＳＧが再度還元型に変換されるため、さらに効率よく発色基質の発色を制御することができる。
【００４３】
検出したいアルコール濃度が２０ｍＭの場合（つまり、前記２０ｍＭ以上の場合のみ発色）、多孔質材１ｃｍ^３あたり、前記還元型補酵素１０〜２０μｍｏｌ、グルタチオンレダクターゼ３０〜２５０Ｕであることが好ましく、前記還元型補酵素１２〜１８μｍｏｌ、グルタチオンレダクターゼ８０〜２５０Ｕであり、特に好ましくは前記還元型補酵素１２〜１４μｍｏｌ、グルタチオンレダクターゼ１２０〜２５０Ｕの範囲である。
【００４４】
また、さらに電子供与体およびＧ６Ｐ脱水素酵素等の酵素を含有してもよい。これらを含有することによって、例えば、生成した酸化型補酵素が再度還元型に変換されるため、さらに効率よく発色基質の発色を制御できる。
【００４５】
検出したいアルコール濃度が２０ｍＭの場合（つまり、前記２０ｍＭ以上の場合のみ発色）、多孔質材１ｃｍ^３あたり、前記電子供与体１２〜１８μｍｏｌ、Ｇ６Ｐ脱水素酵素４０〜２００Ｕであることが好ましく、前記電子供与体１２〜１６μｍｏｌ、Ｇ６Ｐ脱水素酵素６０〜２００Ｕであり、特に好ましくは前記電子供与体１２〜１４μｍｏｌ、Ｇ６Ｐ脱水素酵素８０〜２００Ｕの範囲である。なお、前述のような他の酵素についても同様である。また、アルコール濃度が３０ｍＭの場合、多孔質材１ｃｍ^３あたり、前記電子供与体は１８〜２７μｍｏｌであることが好ましく、より好ましくは前記電子供与体１８〜２２μｍｏｌであり、特に好ましくは前記電子供与体１８〜２０μｍｏｌの範囲である。アルコール濃度が４０ｍＭの場合、多孔質材１ｃｍ^３あたり、前記電子供与体は２４〜３６μｍｏｌであることが好ましく、より好ましくは前記電子供与体２４〜２８μｍｏｌであり、特に好ましくは前記電子供与体２４〜２６μｍｏｌの範囲である。
【００４６】
この分析用具は、前述のように、例えば、前記本発明の分析試薬を、前述のような適当な溶媒に溶解し、その試薬溶液に前記多孔質材を浸漬した後、これを乾燥することによって作製できる。前記試薬溶液における前記分析試薬の濃度は、特に制限されないが、例えば、前記発色基質１〜５ｍｍｏｌ／Ｌ、ＧＳＨ０．５〜５０ｍｍｏｌ／Ｌ、アルコールオキシダーゼ５０〜２００Ｕ／ｍＬ、およびＰＯＤ８０〜３５０Ｕ／ｍＬの範囲であり、特に好ましくは前記発色基質１〜２ｍｍｏｌ／Ｌ、ＧＳＨ０．５〜３０ｍｍｏｌ／Ｌ、アルコールオキシダーゼ１００〜２００Ｕ／ｍＬ、およびＰＯＤ１７０〜３５０Ｕ／ｍＬの範囲である。また、前記溶媒としては、前述のような緩衝液が好ましく、その濃度は、例えば、１０〜２００ｍＭの範囲であり、好ましくは２０〜２００ｍＭであり、特に好ましくは５０〜１００ｍＭである。
【００４７】
また、さらに前記還元型補酵素およびグルタチオンレダクターゼを含有する場合は、前記試薬溶液における濃度は、前記還元型補酵素０．５〜５０ｍｍｏｌ／Ｌ、グルタチオンレダクターゼ２０〜２００Ｕ／ｍＬであることが好ましく、前記還元型補酵素０．５〜４０ｍｍｏｌ／Ｌ、グルタチオンレダクターゼ４０〜２００Ｕ／ｍＬであり、特に好ましくは前記還元型補酵素０．５〜３０ｍｍｏｌ／Ｌ、グルタチオンレダクターゼ５０〜２００Ｕ／ｍＬの範囲である。
【００４８】
また、さらに前記電子供与体および前記Ｇ６Ｐ脱水素酵素を含有する場合、前記試薬溶液における濃度は、前記電子供与体０．５〜５０ｍｏｌ／Ｌ、Ｇ６Ｐ脱水素酵素４０〜２５０Ｕ／Ｌであることが好ましく、前記電子供与体０．５〜４０ｍｏｌ／Ｌ、Ｇ６Ｐ脱水素酵素４２〜２５０Ｕ／Ｌであり、特に好ましくは前記電子供与体０．５〜３０ｍｏｌ／Ｌ、Ｇ６Ｐ脱水素酵素４０〜２５０Ｕ／Ｌの範囲である。なお、前述のような他の酵素についても同様である。
【００４９】
また、本発明の分析用具においては、前述のように多孔質材に保持された酵素をより一層安定に維持できることから、例えば、さらに、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）＃３００、ＰＥＧ＃４００、ＰＥＧ＃６００、ＰＥＧ＃１０００、ＰＥＧ＃１５００、ＰＥＧ＃２０００、ＰＥＧ＃４０００、ＰＥＧ＃６０００、ＰＥＧ＃２００００等のＰＥＧを安定化剤として保持させることが好ましく、より好ましくはＰＥＧ＃４０００、ＰＥＧ＃６０００であり、特に好ましくはＰＥＧ＃６０００である。このように安定化剤を保持させる場合、前記多孔質材１ｃｍ^３あたり、安定化剤６〜９０ｍｇであることが好ましく、より好ましくは前記安定化剤１２〜７２ｍｇであり、特に好ましくは前記安定化剤２０〜４５ｍｇの範囲である。また、前記多孔質材を浸漬する前記試薬溶液における前記安定化剤の量は、例えば、１〜１０％（ｗ／ｖ）であることが好ましく、より好ましくは２〜８％（ｗ／ｖ）であり、特に好ましくは２〜５％（ｗ／ｖ）の範囲である。
【００５０】
前述のような安定化剤の中でも、例えば、ＰＥＧ＃６０００（平均分子量７３００−９０００）を２重量％〜５重量％含有する試薬溶液に、ろ紙を浸した後、真空下で乾燥（２時間）して分析用具を作製した場合、全く酵素活性の低下は認められなかった。また、さらに４℃で２日間保存した後においても、酵素活性の低下は認められなかった。
【００５１】
前記分析試薬の構成成分については、溶解順序は限定されない。また、前記乾燥の方法は、例えば、酵素活性等が失活しなければ特に制限されず、例えば、自然乾燥、加熱乾燥、凍結乾燥、真空下での乾燥、窒素気流下での乾燥等の方法があげられる。
【００５２】
このような分析用具は、例えば、以下のようにして使用できる。前記分析用具に、前述のような検体を滴下して、前記検体中のアルコールと、保持させた前記本発明の分析試薬とを反応させる。そして、前記発色基質による発色を目視で確認することによって、アルコールを分析できる。また、前記発色基質の発色について吸光度や反射率等を測定すること等によっても、アルコールを分析できる。具体的には、例えば、発色するアルコール濃度を２０ｍＭ以上に設定している場合、発色が見られれば、前記検体はアルコール濃度が２０ｍＭ以上であると判定できる。また、発色するアルコール濃度を、例えば、３０ｍＭ、４０ｍＭ等に設定した分析用具をさらに準備しておけば、同じ検体を各分析用具に供することによって、濃度が２０ｍＭ以上であることだけでなく、３０ｍＭまたは４０ｍＭ以上であるか否かも判定することができる。つまり、分析濃度を２０ｍＭ以上に設定している分析用具において発色がみられず、３０ｍＭ以上に設定した分析用具において発色が見られた場合は、検体のアルコール濃度は３０ｍＭ程度であると判断できる。このように、本発明によれば、各種濃度に設定した分析用具を準備することによってアルコール濃度を定量的に分析すること可能になる。
【００５３】
なお、本発明の分析方法は、例えば、このように全ての試薬を保持する分析用具を使用することによって行うことができるが、例えば、反応初期に必要なアルコールオキシダーゼ以外を保持させた多孔質材に、別途、検体とアルコールオキシダーゼとを添加することによって、反応を開始してもよい。
【００５４】
【実施例】
（実施例１）
ＧＳＨレダクターゼ（２５０Ｕ）、アルコールオキシダーゼ（５００Ｕ）、ＰＯＤ（５．０ｍｇ：８００Ｕ）およびＧ６Ｐデヒドロゲナーゼ（５００Ｕ）を、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ＫＰＢ：ｐＨ７．４）１ｍｌに溶解して、酵素溶液を調製した。なお、前記各種酵素としては、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ 由来アルコールオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ 社製）、ＧＳＨレダクターゼ（Ｓｉｇｍａ 社製）、ｈｏｒｓｅ ｒａｄｉｓｈ由来ＰＯＤ（Ｒｏｃｈｅ 社製）およびｂａｃｋｅｒ’ｓ ｙｅａｓｔ 由来Ｇ６Ｐデヒドロゲナーゼ（Ｒｏｃｈｅ 社製）を使用した（以下、同じ）。
【００５５】
蒸留水に１０ｍＭとなるようにＮＡＤＰを溶解し、さらに１０ｍＭとなるようにＧＳＨを溶解して、ＮＡＤＰ／ＧＳＨ溶液を調製した（以下、同じ）。また、ＡＢＴＳ（和光純薬社製）を蒸留水に１００ｍＭとなるように溶解してＡＢＴＳ溶液を調製した。
【００５６】
つぎに、下記組成となるように、２５０ｍＭ Ｇ６Ｐ溶液、水、前記酵素溶液、ＮＡＤＰ／ＧＳＨ溶液、およびＡＢＴＳ溶液を混合して、５種類の浸漬溶液（Ｎｏ．１〜５）を調製した。なお、前記浸漬溶液におけるＧ６Ｐの終濃度を併せて示す。
【００５７】

【００５８】
そして、前記各種浸漬溶液１５０μｌに１．０ｃｍ×１０．０ｃｍのろ紙をそれぞれ浸漬し、２時間真空下で乾燥を行い、これをアルコール分析用具（Ｎｏ．１〜５）とした。前記分析用具を１．０ｃｍ×１．０ｃｍの大きさに切断し、これらの切片に、所定濃度（０、１０、２０、３０、４０ｍＭ）のエタノール溶液１５μｌを添加し、その発色を確認した。これらの結果を図２に示す。なお、Ｎｏ．１が比較例の分析用具であって、Ｎｏ．２〜Ｎｏ．５が実施例の分析用具である。
【００５９】
図示のように、Ｇ６Ｐ無添加のＮｏ．１の分析用具（比較例）によると、全てのアルコール濃度において発色がみられ、一定以上のアルコール濃度であるか否かが判断できなかった。これに対して、Ｎｏ．２〜Ｎｏ．５の実施例の分析用具については、保持させるＧ６Ｐ濃度を変化させることによって、ＡＢＴＳの発色程度を制御することができた。具体的には、Ｇ６Ｐ濃度が１５ｍＭの場合、１０ｍＭエタノールについての発色が見られず、Ｇ６Ｐ濃度が２５ｍＭの場合、１０ｍＭおよび２０ｍＭエタノールについての発色が見られず、Ｇ６Ｐ濃度が３５ｍＭの場合、１０ｍＭ、２０ｍＭおよび３０ｍＭエタノールについての発色が見られなかった。このため、Ｇ６Ｐ濃度１５ｍＭの分析用具により、エタノール濃度２０ｍＭ以上の検体を検出することができ、Ｇ６Ｐ濃度２５ｍＭの分析用具からは３０ｍＭ以上、Ｇ６Ｐ濃度３５ｍＭの分析用具からは４０ｍＭ以上の検体を検出することができた。以上の結果から、このようにＧ６Ｐ濃度を変化させれば、検体中に一定量以上のアルコールが存在するか否か、また、どの程度のアルコール濃度であるかを定量的に判断できることがわかる。なお、Ｎｏ．１の分析用具（比較例）の場合、アルコール濃度が０ｍＭであっても発色がみられているが、これは前記ＡＢＴＳ溶液が空気酸化により薄い青色を呈することが原因であり、Ｇ６Ｐ非存在であることからもそのまま発色しているためと考えられる。しかし、本発明の分析用具については、図１の結果からもわかるように、このようなＡＢＴＳの空気酸化による測定への影響はないと解される。
【００６０】
【発明の効果】
このように、本発明のアルコール分析方法によれば、ＧＳＨの存在下で反応を行うことによって、発色基質の発色程度を調整できるため、例えば、従来では、発色が強く色の濃淡によってアルコール濃度を判断できない検体であっても、十分にアルコール濃度の判断が可能になる。このような方法は、例えば、一定以上のアルコール濃度であるか否かの判断を必要とする、飲酒運転の取締りにおけるアルコール分析に有用である。
【００６１】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の分析方法の一実施形態を示す概略図である。
【図２】本発明の一実施例において、Ｇ６Ｐ濃度とエタノール濃度を変化させた場合の発色変化の結果を示す写真である。

Claims (22)

1. 検体中のアルコールをアルコールオキシダーゼにより酸化して過酸化水素を生成させ、
   酸化により発色する発色基質の存在下、前記過酸化水素をペルオキシダーゼで還元することによって、前記発色基質を還元型から酸化型に変換し、
   前記発色基質の発色程度からアルコールを定性分析もしくは定量分析する方法であって、
   還元型グルタチオンにより前記酸化型の発色基質を還元して、発色程度を調整する分析方法。
2. 前記還元型グルタチオンの量を調整することによって、前記発色程度を調整する請求項１記載の方法。
3. 発色基質が、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン）−６−スルホン酸（ＡＢＴＳ）、３，３’−５，５’−テトラメチルベンジジン（３，３’−５，５’−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ：ＴＭＢ）、３，３’−ジアミノベンジジン（３，３’−Ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ：ＤＡＢ）、３−アミノ−９−エチルカルバゾール（３−Ａｍｉｎｏ−９− ｅｔｈｙｌｃａｒｂａｚｏｌｅ：ＡＥＣ）、ｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロリド（ｏ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｄｉａｍｉｎｅ ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ：ＯＰＤ）、グアイアコール（Ｇｕａｉａｃｏｌ）、ピロガロール（Ｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ）およびこれらの誘導体からなる群から選択された少なくとも一つの基質である請求項１または２記載の方法。
4. 発色基質が、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン）−６−スルホン酸（ＡＢＴＳ）である請求項３記載の方法。
5. 酸化型の前記発色基質を還元することによって生成した酸化型グルタチオンを、還元型補酵素の存在下、グルタチオンレダクターゼにより還元し、前記還元型グルタチオンで、残存する酸化型の発色基質をさらに還元することによって、発色程度を調整する請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記還元型補酵素の量を調整することによって、前記発色程度を調整する請求項５記載の方法。
7. 前記還元型補酵素が、ＮＡＤＰＨおよびＮＡＤＨの少なくとも一方の補酵素である請求項５または６記載の方法。
8. 還元グルタチオンへの変換によって生成した酸化型補酵素を、電子供与体の存在下、酸化還元酵素により還元する請求項５〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記電子供与体の量を調整することによって、前記発色程度を調整する請求項８記載の方法。
10. 前記電子供与体が、グルコース６リン酸、イソクエン酸、リンゴ酸、６−ホスホグルコン酸、Ｌ−キシリトール、Ｌ−グロン酸、Ｌ−グロノ−γ−ラクトン、アルジトールおよびグリセロールからなる群から選択された少なくとも一つの物質である請求項８または９記載の方法。
11. 前記酸化還元酵素が、グルコース６リン酸脱水素酵素、イソクエン酸脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素、Ｌ−キシロース還元酵素、グルクロン酸還元酵素、グルクロノラクトン還元酵素、アルドース還元酵素およびグリセロール脱水素酵素からなる群から選択された少なくとも一つの酵素である請求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 検体が、唾液である請求項１〜１１のいずれか一項に記載の記載の方法。
13. 請求項１〜１２のいずれか一項に記載のアルコールを定性分析もしくは定量分析する方法に使用する試薬であって、
    少なくとも、酸化により発色する発色基質、還元型グルタチオン、アルコールオキシダーおよびペルオキシダーゼを含む分析試薬。
14. 発色基質が、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン）−６−スルホン酸（ＡＢＴＳ）、３，３’−５，５’−テトラメチルベンジジン（３，３’−５，５’−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ：ＴＭＢ）、３，３’−ジアミノベンジジン（３，３’−Ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ：ＤＡＢ）、３−アミノ−９−エチルカルバゾール（３−Ａｍｉｎｏ−９− ｅｔｈｙｌｃａｒｂａｚｏｌｅ：ＡＥＣ）、ｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロリド（ｏ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｄｉａｍｉｎｅ ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ：ＯＰＤ）、グアイアコール（Ｇｕａｉａｃｏｌ）、ピロガロール（Ｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ）およびこれらの誘導体からなる群から選択された少なくとも一つの基質である請求項１３記載の分析試薬。
15. 発色基質が、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン）−６−スルホン酸（ＡＢＴＳ）である請求項１４記載の分析試薬。
16. さらに、還元型補酵素およびグルタチオンレダクターゼを含む請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の分析試薬。
17. 前記還元型補酵素が、ＮＡＤＰＨおよびＮＡＤＨの少なくとも一方の補酵素である請求項１６記載の分析試薬。
18. さらに、電子供与体、および前記電子供与体を酸化して、前記酸化型補酵素を還元する酸化還元酵素を含む請求項１６または１７記載の分析試薬。
19. 前記電子供与体が、グルコース６リン酸、６−ホスホグルコン酸、Ｌ−キシリトール、Ｌ−グロン酸、Ｌ−グロノ−γ−ラクトン、アルジトールおよびグリセロールからなる群から選択された少なくとも一つの物質である請求項１８記載の分析試薬。
20. 前記酸化還元酵素が、グルコース６リン酸脱水素酵素、イソクエン酸脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素、Ｌ−キシロース還元酵素、グルクロン酸還元酵素、グルクロノラクトン還元酵素、アルドース還元酵素およびグリセロール脱水素酵素からなる群から選択された少なくとも一つの酵素である請求項１８または１９記載の分析試薬。
21. さらにポリエチレングリコールを含む請求項１３〜２０のいずれか一項に記載の分析試薬。
22. 請求項１〜１２のいずれか一項に記載のアルコールを定性分析もしくは定量分析する方法に使用する分析用具であって、多孔質材に、請求項１３〜２１のいずれか一項に記載のアルコール分析試薬が保持されている分析用具。

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