JPS63201567A - 生体試料中の還元物質の除去法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は生体試料成分の光学的測定において、妨害とな
る還元物質を除去し、測定を正確に行う方法に関する。

（従来技術） 生体試料成分の分析は臨床検査診断の分野において重要
であり、血液、尿、唾液、涙液等が検査試料となる。し
かし乍ら、これら生体試料には代謝物としての還元物質
が多く含まれ、酸化及び還元反応を利用した光学的測定
法において、酸化反応の抑制、もしくは過−Ｊな還元反
応として、測定を妨げる場合がある。典型的な例は、ア
スコルビン酸であるが、アスコルビン酸オキシダーゼに
より酸化する方法が有利である。ｔｅビリルビンについ
てはとり〃ビンオキシダーゼを用いて消去するなどの工
夫がなされている。しかし乍ら、血清中の還元物質につ
いて・は比較的よく研究されているが、尿については、
還元物質の実体も不明であり、ましてその消去法につい
て十分に検討されていない。測定対象成分が二電子還元
をうける受容体により酸化される場合にも、生体成分中
に存在する−電子還元性成分が、妨害を与え、特異性の
高い酵素を使用しても、酸化発色の抑制もしくは過剰な
還元反応が出現する。しかも、これらの還元成分は検体
により組成・濃度が異なり、検体ブランクを用いて補正
する必要がある。しかし、あまりに大きい妨害発色の場
合に補正は困難であり。

逆に酸化発色の抑制については検体ブランクによる補正
そのものが不可能となる。

（発明の目的） 生体成分中の還元物質の影響を除去し、測定を精度よく
行う方法に関する発明であって、二電子還元成分と一電
子還元成分を分離することにより測定することを特徴と
する。

（発明の詳細な説明） 本性は生体試料中の成分を測定する反応を二電子還元系
を用いて行い１反応を妨害する還元物質を一電子還元系
を共存させて除去する方法である。

生体試料として血液や尿を対象とするが、測定対象成分
が試料中に少ない場合、多量の試料を反応系に加えて測
定するために生じる還元成分による影響の回避法が主題
である。未同定の還元成分の多い試料として尿があるの
で主要に尿について説明する。尿中のアスコルビン酸を
アスコルビン酸オキＶダーゼによシ消去することは公知
であるが。

他の成分については、同じ反応組成液により消去系を組
み、主反応をあとから行う方法がとられている。しかし
乍ら、尿の還元取分は、この方法でも消去するのに時間
がかかりすぎる場合がある。

例、ｔ　ハ、フエナジンメトサルフエー）（ＰＭＳ）。

１−メトキシ−ＰＭＳ、ＦＭＮ、ＦＡＤ　などを前処理
剤として加えて還元物質を酸素との反応により過酸化水
素に転換して消去する方法が考えられる。

この場合はカタラーゼの添加が反応を促進するが。

尿を対象とした場合、消去に時間を要し、実用性がある
とはいえない方法である。上記方法も一電子還元系質を
除去する方法であるが１反応系に共存させると、かえっ
て還元発色もしくは酸化の抑制を促進する・主反応にお
ける酵素反応においては更に妨害となる還元成分が生成
することがある。

理由は反応に必要な酵素が非特異的な九めである。

測定系の主反応が二電子還元系であるものとして代表例
はＮ　Ａ　Ｄ　（Ｐ）依存性脱水素酵素、フラビン（Ｆ
ＭＮ、ＦＡＤ、！Ｊボフラビン）依存性脱水素酵素があ
る。

しかし、後者は本来二電子還元型であるが、酸素が共存
スると、フラビンセミキノンのまま酸素に電子伝達して
スーパーオキサイド（ＯＮ）を生成する場合がある。ラ
ジカμスキャベンジャ−を共存させると、反応が阻害さ
れ、セミキノンの生成が認められるフラビン依存性脱水
素酵素がある。

また、尿中ではＮＡＤ　　又はＮＡＤＰ　　を添加する
ことにより、ホルマザン系色素を還元発色させる成分が
存在し、ホルマザン系色素を用いる測定を妨害する。こ
れはＮＡＤ（Ｐ）　　が−電子還元されたまま、ホルマ
ザン系色素を還元する場合で、３４０ｎｍの吸収は増加
せず％ＮＡＤ（Ｐ）Ｈが生成していないことが′＃４Ｊ
る。従って１本発明ではこの一電子還元成分の受容体を
添加し、二電子還元性の酵素反応、とりわけＮＡＤ（Ｐ
）Ｈ生成の脱水素反応を行い、二電子還元性の発色反応
１例えばジプフオヲーゼを用いることにより１選択的に
生体内成分の測定が可能となった。

一電子還元系の受容体として、ベンゾイックアシッド又
はその誘導体あるいはフェノール類を用いることが極め
て有効であり、この受容体は、−電子還元反応の受容体
となり、ホルマザン系色素を還元しない。ホルマザン系
色素は二電子還元により発色するが、−電子キャリヤー
２分子によっても発色する。従って、ベンゾイックアシ
ッドなどは一電子還元系の受容体であって、ホルマザン
系色素を更に還元しない。更にベンゾイックアシッドの
還元は無発色であり、ａ元発色を妨害しない。ベンゾイ
ックアシッド誘導体としてパラヒドロキシ安息香酸、バ
ラアミノ安息香酸などがある。

また、フェノール類としてジブロモフェノールなど測定
波長に影響しないものを選ぶが、−電子受容体であって
ホルマザン系色素を還元発色させない物質であればこれ
を用いることができる。

一方で酸化発色の場合は更に簡単で、Ｈ２Ｏ２生成反応
を用いてペルオキシダーゼによる色原体の酸化発色を行
う。この場合−電子還元性成分をＨ２Ｏ２を発生しない
形で消去すればよい。ＰＭＳやフラビンを用いることは
Ｈ２Ｏ２を発生させるので、少くとも０２′″″のまま
べρオキシダーゼのカタラーゼ作用により消去する必要
がある。Ｎ　Ａ　Ｄ　（Ｐ）ＨをＨ２Ｏ２に転換する場
合は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ活性を有するジアフ
オヲーゼ又は旧黄色酵素により直接Ｈ２Ｏ２を生成させ
る。Ｈ２０，の生成を助けるために不均化剤を添加する
ことがよい。

いづれにしても０２に対する二電子還元が行われれば、
−電子還元系はベンゾイックアシッドの添加により消去
される。

上記の方法は吸光性以外に、レサズリンーレゾルフイン
系の螢光法において、ＮＡＤＨ−ジアフオツーゼ系にお
いて成立する。場合によってはＨ２Ｏ２発生系をカタラ
ーゼとメタノールを用いてホルムアルデヒドに転換した
あとホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼによりＮＡＤＨ
に転換してジアフオラーゼ発色あるいは全螢光させるこ
とができる。

発光反応の場合はフラビンレダクターゼによυＮＡＤ（
Ｐ）ＨはＦＭＮＨ２に転換され、小さいＫｍ値をもつル
シフェラーゼに結合され発光するが、還元物質は１発光
における酸化反応を妨害する場合がある。この妨害はや
はりベンゾイックアシッドなどの一電子受容体によりト
ラップすることで消去される。Ｈ２Ｏ２の化学発光につ
いても同様の方法で妨害が回避される。

本法の適用例として、尿中ポリアミンの測定の場合を挙
げることができる。既に説明し友ように。

尿中には、ホルマザン系発色を生じる成分があるが、１
〜１００ｍＭのベンゾイックアシッドを加えると、パッ
クグラウンド発色は消失する。更にデアセチラーゼによ
り抱合型ポリアミンを遊離型に変換する際、デアセチラ
ーゼが他の抱合体を水解して生成する成分にＮＡＤ　　
と反応するものがあり、−電子還元型でホルマザン発色
させる。このものはベンゾイックアシッドにより大幅に
消失させることが出来、ホルマザン発色はきわめて低い
一定比率で還元されるようになる。この結果、パックグ
ラウンドの増加はきわめて少なく、プトレシンオキシダ
ーゼの添加では、ポリアミン量の測定が可能になる。

この測定系では、ポリアミンオキシダーゼが生成するア
ミノブチルアルデヒドをアミノブチルアルデヒド脱水素
酵素によりＮＡＤＨに転換しているがｓ　Ｈ２Ｏ２を測
定する場合も本法が有効である。

生成し九ＮＡＤＨはＮＡＤＨオキシダーゼ活性のないジ
アフオラーゼにより二電子還元型でホルマザン発色を行
う。

なお先述し友ように、デアセチラーゼが尿に作用した時
、アミノブチルアルデヒドと反応する成分が出現し、こ
のものは二電子還元型でＮＡＤＨを生成するが測定感度
を保証する試料量においては。

パックグラウンドとなるＮＡＤＨの生成はごくわづかで
あり、一定のレートで増加する。

よって、尿中ポリアミンは自動分析機により測一定の可
能な時間内に反応を終結し、簡便な測定法が実現した。

以下に、尿中ポリアミンの測定例を示し、−電子受容体
を加えない場合と加えた場合について各々比較例と実施
例を示す。

比較例 試液１ リン酸バッフ７　　＊　ｐＨ７，０（含０．１％）！Ｊ
　）ンＸＸ−１００）１００ｆｆ１ アシルポリアミンアミドヒドロラーゼ　　　　　　２５
Ｕ／ｇ／アスコルビン酸オキシダーゼ　　　　　　　　
　　　４Ｕ／ｍ１ＮＡＤ”　　　　　　　　　　　　　
　　　　１ｍＭアミノブチμアルデヒドデヒドロゲナー
ゼ　　　　０．５Ｕ／ｇ／ジアフオラーゼ　　　　　　
　　　　　　　　　　　ＩＵ／層ｊ’ＭＴＴ　　　　　
　　　　　　　　　　０．０３％試液２ リン酸ｉ＜”／　７７−ｅ　ｐ　Ｈ７，０１００ＷｉＭ
プトレシンオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　　５
Ｕ／ｍｌ試液１２．７ゴに０．２ｇ／の尿検体を加え、
３７℃５分間ｂ５６５ｎｍの吸光度を測定しなあと。

０．１ｍ？の試液２を加え、更に５分間測定する。最初
の反応で出現する吸光度増加及び後段の反応の吸光度増
加を図１に示す。明らかに非特異的なＭＴＴの還元反応
が出現し試液２を加えると、更に非特異的なＭＴＴの還
元反応が増加し、ポリアミン濃度が正確に求められない
・しかも検体によりとの非特異的な還元反応の程度が異
っていることが他の実験から示されている。

実施例１ 尿中ポリアミンの測定において、ベンゾイックアシッド
を一電子受容体として添加した場合を実施例として示す
。

試液１ リン酸バッファー、ｐＨ７，０（含０．１％トリトンＸ
−１００）１００２１Ｍ アシルポリアミンアミドヒドロラーゼ　　　　　　２５
Ｕ／＋ｗ／アスコルビン酸オキシダーゼ　　　　　　　
　　　４Ｕ／ｇ／ベンゾイックアシッド　　　　　　　
　　　　　　　６０ｍＭＮＡＤ　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　１ｍＭアミノプチルアルデヒ
ドデヒドログナーゼ　　　　０．５Ｕ／ｇ／ジアフォヲ
ーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　　　ＩＵ／襲ｊ
ＭＴＴ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０
．０３％試液２ リン酸バ”／　７１−＊　　ｐ　８７．０　　　　　　
　　　１００　ｍＭシ プトレシンオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　５Ｕ
／ｍｅ試液１　２．７　ｍｌ　Ｋ　Ｏ，２ｍｌの尿検体
を加え、３７℃５分間ｓ５６５ｎｍの吸光度を測定し九
あと。

０．１ｇ／の試液２を加え、更に５分間測定する。最初
の反応で出現する吸光度増加を図１のように外挿し、後
段の反応との吸光度差を求めれば、液比補正後尿中ポリ
アミン濃度が求められる。

実施例２ 尿中の還元物質の影響を回避してポリアミンの測定をペ
ルオキシダーゼの酸化発色系について行り九〇 試液１ リン酸パ’／　７７−１　　ｐ　Ｈ７，０１００ＷＩＮ
アシルポリアミンアミドヒドロラーゼ　　　　　２５Ｕ
／ｇｌアスコ〃ビン酸オキシダーゼ　　　　　　　　　
４Ｕ／ｍｌベンゾイックアシッド　　　　　　　　　　
　　　６０ｍＭ４−アミノアンチピリン　　　　　　　
　　　０．０４％べ〃オキシダーゼ　　　　　　　　　
　　　　　　３Ｕ／ｘｌ（ＮＡＤ”　　　　　　　　　
　　　　　　　　　１ｍＭ　　）（アミノブチルアルデ
ヒドデヒドロゲナーゼ　　　０．５０／＃／　）（ジア
フオラーゼ（ＮＡＤＨオキンダーゼ）　　　　　ＩＵ／
ｇ／）試液２ リン酸パ”／ｙｌ−、ｐＨ７，０１０１００ｊｙプトレ
シンオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　５Ｕ／＊／
Ｅ　ＨＳ　Ｐ　Ｔ　　　　　　　　　　　　　　　　　
Ｏ，０２チ試液１よりＮＡＤ”、アミノブチルアルデヒ
ドデヒドロゲナーゼ、ジアフオラーゼを除いた場合。

１１ｉ応はプトレシンオキシダーゼ作用により生成する
Ｈ２Ｏ２を測定し、試液１の組成では、テミノプチ〃ア
ルデヒドもＨ！０２に転換されて２分子のＨ２Ｏ２が測
定される。反応は３７℃ｂ５５３ｎｍの吸光度を測定し
た。図３に１反応の時間経過を示す。試液１２．７ｗｌ
に０．２ｇ／の尿検体を加え、５分間反応後０．１ｓｔ
の試液２を加える。反応後の発色は極めて安定であり、
Ａはアミノブチ〜ア〃デヒドをＨ２Ｏ２として測定した
場合、Ｂはプトレシンオキシダーゼにより生成するＨ２
Ｏ２を測定した図１＝尿中ポリアミンのホルマザン系発
色の時間経過 図２：尿へのプトレシン添加による希釈直線性（ホルマ
ザン発色系） 図３＝尿中ポリアミンのべμオキシダーゼによる酸化発
色の時間経過

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）生体試料中の成分を光学的に測定する場合に、反
   応を妨害する還元物質を一電子受容体を用いて除去する
   ことを特徴とする生体試料中の還元物質の除去法
2. （２）生体試料中の成分の測定を二電子受容体を用いて
   行うことを特徴とする特許請求の範囲第一項記載の方法
3. （３）測定系に妨害を与えない一電子受容体を共存させ
   て、二電子受容体の還元を測定することを特徴とする特
   許請求の範囲第一項記載の方法
4. （４）光学的な測定が吸光光度法、螢光法及び発光法の
   うちから選ばれることを特徴とする特許請求の範囲第一
   項記載の方法。