JPS6188153A - 生体微量成分の定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、還元型補酵素又はスーパーオキシドアニオン
を定量することにより行なう、生体微量成分の定量法に
関する。

更に詳しくは、生体成分を定量するにあたり、一価又は
二価の銅イオン、ベルオキシダーゼ、及び■４−アミノ
アンチピリン、■３−メチルベンゾチアゾリノンヒドラ
ゾン、、３，７２．２’−アジノピス（３−エチルペン
ツチアゾリン−６−スルホン：Ａｊ　’、■トリフェニ
ルメタン系ロイコ色素、■フェノール系化合物１１、Φ
アニリン系化合物、（工・ナフｌ−−ル系化合物から成
る群より選ばれた一種又は二種以上の化合物を用いて、
共存するアスコルビン酸の影響を除いた後、還元・型補
酵素又はスーパーオキシドアニオンの定量を行なうこと
により行なう。

生体微量成分の定量法に関する。

アスコルビン酸は、ビタミンＣとして良く知られた還元
性物質であり、これが扱検試料、例えば体液成分中に共
存する場合は、還元反応を利用するそれら抜瑛試料中の
目的成分の定量の際、その還元性に起因して１通常、正
の誤差を与える原因となることが良く知られている。

これらアスコルビン酸の分解方法としては、アスコルビ
ン酸オキシダーゼを用いる方法（特公昭５６−３９１９
８号公報）、ヨウ素酸若しくはその塩を用論る方法、又
は過ヨウ素酸類若しくはこれらの塩を用いる方法（特開
昭５６−１０９５９５号公報。

特開昭５６−１５１３５８号公報、特開昭５６−１０７
１６１号公報）などが、臨床化学、製薬化学、生化学、
食品化学のような分野の課題を解決する技術として開示
されている。

しかしながら、アスコルビン酸オキシダーゼを用いる場
合は、そハが酵素であるが故の固有の問題点、即ち熱安
定性及び貯蔵安定性の問題があり。

ヨウ素酸若しくはその塩、又は過ヨウ素酸類若しくはそ
ハ、らの塩を用いる場合は、これらが強い酸化剤である
が故の問題点、即ち、還元反応を利用して行なう生体Ｓ
量成分の定量に於ては、　７１１１１定系内の還元性物
質と反応してこ力、の分解を生ぜしめたり、酵素反応を
阻害し斤すすることがしにしばあり、実施上困難なこと
が多かった。

一方１本発明者らは、光に、　Ｈ２Ｏ２の生成すしにア
スコルビン酸を分解させる新規なアスコルビン酸の分解
方法を貸出１特許出願１．ている（特Ｊ昭５９−１１８
６０１号）。即ち、それによね（−ｆ一価又は二価の銅
イオン、ベルオキシダーゼ、及ヒ：ｉ＞４−アミノアン
チピリン、■３−メチルベンゾチアゾリノンヒドラゾン
、■２，２′−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリ
ン−６−スルホン酸）、■トリフェニルメタン系ロイコ
色素、■フェノール系化合物、■アニリン系化合物、■
ナフトール系化合物から成る群より選ばれた一種又は二
種以上の化合物を用いることにより、Ｈ２０２の生成な
しにアスコルビン酸を分解させることがでさ、更に、こ
の方法を酵素反応により生成したＨ　２０□をｉｌ＋定
することにより行なう生体成分の定量法にコｊ用すると
、共存するアスコルビン酸やビリルビンのような還元性
物質の妨害を効果的に回避することができ、目的成分を
そのような妨害ｔこよる悪影響なしに正確に定量するこ
とができるというものである。

１−かじながら、このようなアスコルビン酸の分解方１
去が、還元型補酵素やスーパーオキシドアニオンのよう
な還元性物質を泪１１定することにより行なう生体微量
成分の定量法の系に於ても、他に何らの悪影響も与えず
に適用し得るか否かは全く予皿困難なことである６即ち
、上記アスコルビン酸の分解方法（こ於て用いらね、る
試薬組成物が、アスコルビン酸やビリルビンの還元性を
失なわせるだけです〈、還元型開酵素やスーパーオキシ
ドアニオンの還元力をも失なわせる可能性も十分考えら
れるので、むしろ、このような系に於て、アスコルビン
酸やビリルビンによる妨害のみが効果的に回避され、還
元型補酵素又はスーパーオキシドアニオンの還元力が正
確に測定できるということは。

極めて考え難いことであった。

力）力）る状況下に於て１本発明者らは、敢てこのアス
コルビン酸の分解方法を、還元型Ｍｕ酵素又はスーパー
オキシドアニオンを定量することにょシ行なう生体微量
成分の定量法に試みたところ、全（意外なことｌこ、上
記アスコルビン酸分解用試薬組成物即ち、一価又は二価
の銅イオン、ベルオキシダーゼ、及び前記ｔｉ）〜■か
ら成る群より選ばれた一種又は二種以上の化合物から成
る試薬組成物が、定量すべき還元型補酵素やスーパーオ
ルンドアニオン、或いは還元型補酵素又はスーパーオキ
ノドアニオンを定量する際の反応並びにその際ｊこ用い
る試薬や酵素等に何ら悪影響を与えることなく、ｍ元型
匍酵素又はスーパーオキシドアニオンを正確に定量でさ
ることを見出し、アスコルビン酸の影響を回避した本発
明の生体微量成分の定量法に到達した。

即ち、本発明は、還元型補酵素又はスーパーオキシドア
ニオンを定量することにより行なう生体微量成分の定量
法に於て、一価又は二価の銅イオン、ベルオキシダーゼ
、及び下記■〜（Ｄから成る群より選ばれた一種又は二
種ν）上の化合物を用いて、共存するアスコルビン酸の
影響を除いた後、還元型補酵素又はスーパーオキシドア
ニオンヲ定量することを特徴とする、生体微量成分の定
４１’Ａである。

■４−アミノアンチピリン ■３−メチルベンゾチアゾリノンヒドラゾン（＄２．２
′−アジノピス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−ス
ルホン酸） ■トリフェニルメタン系コイコ色素 ■フェノール系化合物 ■アニリン系化合物 （のナフトール系化合物 本発明の定量法に於て、Ｈ２０□の生成なしにアスコル
ビン酸を分解させるに必要な銅イオンは。

−価の銅イオンであっても、二価の銅イオンであっても
よく、併用する上記■〜■の試薬の還元力の強さにより
、−価のイオンの状態で存在することも、二価のイオン
の状態で存在することもあシ得る。

本発明の定量法に於て、アスコルビン酸の分解反応に用
因られるトリフェニルメタン系ロイコ色素の具体例とし
ては、従来から公知のロイコマラカイトグリーン、ロイ
コクリスタルヴアイオレ・ノド等の他、最近開発された
。ビス（ｐ−ジエチルアミノフェニル）−２−スルホフ
ェニルメタン、ヒス（ｐ−ジエチルアミノフェニル）−
４〜スルポプロポキシフエニルメタンナトリウム塩、ビ
ス（ｐ−ジェチルアミノフェニル’ｌ−３，４−ジスル
ホプロポギシフェニルメタンジナトＩＪウム塩（以下Ｂ
Ｓｄｉｐｒｏ　Ｐ　Ｍと略称する。）等が挙げられるわ
また、フェノール誘ｉ　体の具体例としては、フェノー
ル、ｐ−クロロフェノール、２．４−ジクロロフェノー
ル、ｐ−ブロモフェノール、０−クロロフェノール、ｍ
−クロロフェノールなどが挙ケられ、アニリン誘導体と
しては、アニリン、　＝”Ｊ、、Ｎ−ジメチルアニリン
、　Ｎ、Ｎ−ジエチルアニリン。

Ｎ、Ｎ−ジエ千ルーｍ−）ルイジン、３−メチル−Ｎ＝
エチル−Ｎ−（β−ヒドロキシエチル）−アニリン、Ｎ
−エチル−Ｎ−（２−ヒドロギン−３−スルホブａピル
）−ｍ−）ルイジン、３．５−ジメチル−Ｎ−エチル−
Ｎ−（２−ヒドロギノー３−スルホブａピル）アニリン
、３．５−ジメｌ−ｍシーＮ〜エチル−Ｎ−（２−ヒド
ロキシ−３−スルホプロピル）アニリンなどが挙げられ
る。

更に、ナフトール誘導体としてＩ／ｉ１〜ナフト−ル％
　１−ナフトール−２−スルホン酸、１−ナフトール−
２−カルボン醍、１−ナフトールー８−スルホ７を育、
　　１−　ｆフトール−３−スルホン酸。

１−ナフト−ル−５−スルホン（ａｆ８ニドが挙ケられ
る。

本発明に係る。アスコルビン酸の分解反応は、通常は、
溶液中で実ｂ１ｑされる。

そのような俗イ鐘中のＣｕ＋又けＣｕ２＋イオン濃度と
してば、通常、　　０．０　（１１〜１ｍｍｏｌ／Ａ’
　であり、ｐ　ｌ−（は１例えば、６．０〜８．５が選
ばれ、そのようなｐＨに溶液を維持するための緩衝液と
しては。

例えは、リン酸イ麦価液、トリス（ヒドロキシメチル）
アミノメタン塩緩衝液、グツド緩衝液など。

汎用さ力、ているものが使用されるが、その好捷しくバ
ー例を皐げろと、０．００１〜２　Ｍ　ＩＪン酸緩画液
が挙げらね、る。

そのような浴液中に於て、Ｃｕ＋又はＣｕ２＋イオンを
与える化合物としては１例えば、硫酸鋼、塩化第二銅、
塙化第−銅、硝酸銅、臭化第二銅、臭化第−銅、リン酸
第二銅などの水溶性無機銅塩、酒石酸銅、クエン酸銅、
酢酸銅などの水溶性有磯銅塩、などの水溶性銅化合物、
が挙げら力、る。

本発明に於て、アスコルビン酸の分解に用いるベルオキ
シダーゼの濃度は、通常２０〜５０００Ｕ／ｄ７！であ
り、好ましくは、５０〜２０００Ｕ／ｄｌである。

また、４−アミノアンチピリン（４−ＡＡＰ）の濃度は
１通常、Ｏ，ｆｌｎ１〜００５係であり、好ましくは、
０．００３〜Ｏ，０３係である、３−メチルベンゾチア
ゾリノンヒドラゾンにνＩＢＴＨ）のａ度は１通常、Ｏ
，ＯＯＯ５−０，２％　ｆあり、好ましくは、０．００
１〜０．０５係である。

２．２／−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−
６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）の！度ｉ。

通常、０．００２〜０４％であり、好ましぐば。

０．０２〜０．２係である。

トリフェニルメタン系ロイコ化合物のｍ　ｆｊｆ−Ｈ４
、通常、０．００５−０．５ｍｍｏｌ／ｌであり、好テ
しぐけ、０．０３〜０．３ｍｍｏｌ／ｌである。

’ｉ＃、フェノール系化合系化合物リアニリン系化合物
フトール系化合物の濃度は１通常、０．０１〜０５壬で
あり、好ましくは、０．０３〜０．３　％である。

本発明の定量法は、また、すべての試薬が吸収性担体中
に又はフィルム中に乾燥した形で存在する試験厭にも応
用し得る。

本発明は１例えば、補酵素の存在下、基質に脱水素酵素
を作用させ、定：敬的に生成する還元型補酵素を定量す
ることにより行なう自体公知の生体成分の定−・１１法
に利用するこ♂ができる。則ち１例えば、基質である生
体成分がコレステロール、胆汁酸、グリセリン、グリセ
リン−３−リン酸、グルコース−６−リン酸、ホルムア
ルデヒド又ハアセトアルデヒドであり、補酵素がＮＡＤ
（＃化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）又＆
−ｔＮＡＤＰ（ｎ化型ニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチドリン酸）であって、補酵素の存在下、基質に作用
させる脱水素酵素が、各々コレステロール脱水素１１学
素、３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、グ
リセリン脱水素酵素、グリセリン−３−リン酸脱水素酵
素、ホルムアルデヒド脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵
素であるような、自体公知の生体成分の定量法に利用す
ることができる。

また、生体成分が脱水素酵素、例えば乳酸脱水素酵素（
ＬＤＨ）又はα−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素〔α−ｆ（
ＢＤ　：］であり、補酵素がＮ　Ａ　Ｄ又けＮＡＤＰで
あって、補酵素の存在下、該脱水素酵素により作用を受
ける基質が、各々乳酸又はα−ヒドロキシ酪酸であるよ
うな、自体公知の生体数分の定量法にも利用することが
できる。

まｔ、これら還元型補酵素の生成系の他に、スーパーオ
キシドアニオンの生成系にも１本発明の方法は効果的に
適用し得る。そのような、Ｈ１１定系としては、例えば
、キサンチンを基質おして、キサンチンオキシダーゼを
作用させてスーパーオシンドアニオンを生成させ、これ
の還元力を」ＩＩ定することにより生体成分の定量を行
なう系や、オギ７ダーゼ、ベルオキシダーゼ、アミン類
又はフェノール類（ナフトールを含む）とＳ　Ｈ基をも
つｆヒ合物とをオキシダーゼの基質に作用させてスーパ
ーオキシドアニオンを生成させ、これを測定することに
より生体成分の定量を行なう系などが挙げられる（特開
昭５９−２０３（１０号公報、特開昭５９−１４０８９
９号公報）。

また、還元型補酵素を定量する系としては１例え：ハ、
電子伝達体あるいはジアホラーゼの存在下、テトラゾリ
ウム塩を還元してホルマザンとする系が代表的なものと
して挙げられ、スーパーオキシドアニオンを定量する系
としては１通常電子伝達体あるいはジアホラーゼを用い
ずに、テトラゾリウム塩を還元してホルマザンとする系
が挙げられる。

ユπ元型ｆｌｌｉ　Ｎ７　禦又汀スーパーオキシドアニ
オンのＷ　、ｉｌｉ　ｉこ用いらノＬるデＩ・ラゾリウ
ム地としては１例えば、汎用さね、ている３、３’　−
（３，３’−ジメトキシ−４，４’−ビフェニレン）−
ビス（２−（ｐ−ニトロフェニル）−５−フェニル−２
Ｈｆト−ｙゾリウム　クロリド（Ｎ１ｔｒＯ−Ｔ　Ｂ　
：）は勿論のこと。

３−（ｐ−ヨードフェニル）−２−（ｐ−二トロフェニ
ル）−５−フェニル２Ｈテトラソリウムクロリド［ＩＮ
Ｔ″１％　ａ　−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル
）−２，５−ジフェニル−２Ｈテトラゾリウム　プロミ
ド（Ｍ　Ｔ　Ｔ　］　、　　３，３／　−（４，４’−
ビフエニレン）−ビス（２，５−ジフェニル−２Ｈテト
ラゾリウム　クロリド）　（Ｎｅｏ　−Ｔ　Ｂ　〕。

３．３’　−（３，３’−ジメトキシ−４，４′−ビフ
ェニレン）−ビス（２，５−ジフェニル−２Ｈテトラゾ
リウム　クロリド）〔ＴＢ〕、３．３′−（３，３′−
ジメトキシ−４，４′−ビフエニレン）−ビス［２，５
−ビス（ｐ−ニトロフェニル）−２Ｈテトラゾリウム　
クロリド］Ｉ：ＴＮＴＢ］や、また、最近開発された水
溶性テトラゾリウム塩例えば、２−（２−ベンゾチアゾ
リル）−３−（２−カルボキシフェニル）−５−（：４
−（ヒドロキシポリ（オキシ−１゜２−エタンジイル）
）フェニル〕−１２１１テトラゾリウム　クロリド（特
願昭５８−１８２４９７号公報）等が挙げられる。

また、水浴性テトラゾリウム塩を用いる場合は、得られ
る水溶性ホルマザンと１反応系に溶存する金、殖イオン
、例えば、　ｃｕ十、　Ｚｎ”　、又はＮ１３十等とで
有色のキレート化合物を作らせ、その呈色を演ｊ１定し
てもよ−。

マた。還元型補酵素からテトラゾリウム塩への電子伝達
には、ジアホラーゼを用いる方法あるいは電子伝達体を
用いる方法が一般的である。

この電子伝達体さしては１例えばフェナジンメトサルフ
ェート［ＰＭＳ：］、］１−メトキシー５−メチルフェ
ナジニウムメチルサルフェート〔１−メトキシ　？ＭＳ
”Ｊ、９−ジメチルアミノベンゾ−α−フェナゾキソニ
ウムクロリド〔メルトラブル−〕等が挙げられる。

本発明の方法を行なうには１通常試料に銅イオン、ベル
オキシダーゼ及び前記■〜■の化合物から成る群より選
ばれた一種又は二種以上の化合物を含む溶を夜を加え、
３７℃で３〜５分間加温する。

こａｉこより、試Ｆ中のアスコルビンａｈ完全に分解す
るので、その後、自体公知の方法で還元型補酵素又はス
ーパーオキシドアニオンを定量すワ、ハよい。例えば、
血清中の乳酸Ｊ脱水素酵素（ＬＤＨ’）の活性度を測定
する場合は、上記方法によりアスコルビン酸を分解した
血ａ０．０５　ｍｌに、　１）Ｌ−乳酸リチウム０．１
ｍｏＡ’／１．　ＮＡＤ　　０．２壬、ジアホラーゼ　
２，０００　Ｕ／　ｌ−Ｎ１ｔｒｏ　−Ｔ　Ｂｏ、０２
憾を含む０．１　Ｍ　トリス−塩酸緩衝′ｇ！１（ｐＨ
−８３）０、５　ｍｌを加え、３７℃恒温槽中正確に１
０分間加温反応させる。次いで、０３係ラウリル硫酸ナ
トリウム水溶液　５ｍεを加えて混和し、試薬盲検を対
照として５６０　ｎｍに於ける吸光度を泗１定し。

別Ｚこ標進血清（ＬＤＨ活性既知）を用すて同一操作を
行なって得た検量線と対比して、血清中のＬＤＨ活性値
を求める。

氏上述べた如く１本発明は、還元型補酵素又はスーパー
オキシドアニオンを定量することにより行なう生体倣量
成分の定量法（こ於て、共存するアスコルビン酸の影響
を全く受けずに実施し得る、新規で且つ効果的な方法を
提供するものであり、斯業に貢献する所極めて大である
。

以下に実施例を挙げて不発明を更に詳維に説明するが１
本発明はこれらにより限定されるものでけない。

実が６例１．　血ｍ中の乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）活性
の測定 〔測定試薬〕 ■第１試液 各々、硫酸鋼ＣＩ［）五水和物　０．　ＯＯａ係、ベル
オキシターゼ　５０ｎＯＵ／ｎ％　４−アミノアンチピ
リン　０，０１％の９度になるように、これらを０．１
八−ｉ　トリス塩酸緩衝液（ｐＨ＝８．０）に溶解した
。

■第２試液 各々、乳酸　０．１ｍｏ７／ｌ、ＮＡＤ　　１０００ｍ
９／　７３　、　ジアホラーゼ　２０００　Ｕ　／　１
％Ｎ１ｔｒ。

−ＴＢ　　４００ｒｔｑ／１．ＥＤＴＡ−２Ｎａ　　０
．１％の濃度になるように、これらを０．ＩＭＦリス塩
酸嶽衝眩（ｐＨ＝８．４’）に溶解した。

〔ホ１１定方法〕 試料＠敵として、コントロール血清１００ｍＬに。

アスコルビン酸２各々０．１０，２０，３０゜４　ｎ　
、　５０ｍ９／ｄｌ添加したものを用いる。

試料溶液を５０μｇとり、第１試液　０．５　ｍｌを加
え、３７℃恒温槽中５分間加温後、第２試液０、５　ｍ
ｌを加え、３７℃で１０分間加温した。こ力に０．　Ｉ
　Ｎ塩酸　５ｍｌを加えに後、試薬ブランクを対叩とし
て、波長５６０　ｎｍに於ける吸光度（０１つ）を測定
した。測定結果を表１に示す。

比較ＬＩ／１１１゜ 〔イロ１１定試薬〕 ■第１試液 ０、１　Ｍ　）リス塩酸緩衝液（ｐＨ＝８．０’）。

■第２試液 実施例１．に１台１じ。

〔唄１１定方法〕 実施例１．と同じ試料溶液を用い、実施例１の（割定操
作に従い、波長５６０　ｎｍに於ける吸光度（ＯＤ）を
測定した。測定結果を表１に示す。

淋千＃臼 −・１ 表　　１ 表１カ）ら明ら力）なように、実施例１．ではアヌコル
ビンＭの添加ｌこよる吸光度の変化は測定誤差のね曲内
であるが、比較例１．ではアスコルビン酸の添加量−と
比較して吸光度が増加しており、アスコルビン酸による
正誤差が太きｂｏ ＄施例２゜ 〔測定試薬〕 ■第１試液 実施例１．に１耐じ。

■第２試液 実施例１に同じ。

〔測定方法〕

試料浴液として、ＬＤＨ活性既知の標準血清を段階希釈
したものを用い、実施例１．の測定操作に従い、波長５
６０　ｎｍに於ける吸光度Ｃ０Ｄ）を泪１１定し、検量
線を作成した。

各ＬＤＨ活性値（Ｗｒ５ｂｌｅｗｓｋｉ単位）に対シテ
プロ・ントした吸光度を結ぶ検量線は、第１図１に示さ
れるように原点を通る直線となり、検量線は良好な定量
性を示している。

実施例３ 〔測定試薬〕 ■第１試液 実施例１．に同じ、 ■第２試液 実施例１．に向じ。

〔額１１定方法〕 試料浴液として人血清（含有アスコルビン葭３−１度が
Ｉ　Ｗ／／　ｄｉ月下のもの）を周込、実施例１．の測
定＋ｉ作に従Ｉへ、波長５６０　ｎｍに於ける吸光度を
測定した。

別に作成した検量線′！１）ら試料中のＬＤＨ活性値を
算出した。街１１定結果を表２に示す。

参考例１゜ 〔測定試薬〕 ■第　１　試を夜 比較例１に同じ。

Ｃ，第２試赦 実施例１．↓こ同じ。

〔演！１定方法〕 実施例３．と同じ試料溶液を用い、実施例１．の測定方
法に従い、ＬＤＨ活性値を求めた。

引１１定結果を表２に示す。

表　　２ Ｙ＝０．９９９Ｘ＋３　（γ＝０．９９９１）表２カ）
ら明らかなように、実り例３、と参考例１゜の邸１定結
果は良好な相関を示しており１本発明の方法が、酵素活
性に悪影響を及ぼしていないことがわかる。

実Ｍ　例４．　　血清中のスーパーオキシドジスムター
ゼ（ＳＯＤ　’）活性の測定 〔ン１１１１定６久＝薬　〕 （１）第　１ｔｉｒ？夜 各々、硫酸銅ＣＩｌ五水和物　０１００３％、ベルオキ
シダーゼ　５ｎｎｎＵ／１．４−アミノアソチピリン　
Ｏ，Ｏａ％の態度になるように、これらを０．０５　Ｍ
　）リス塩酸緩衝液（ｐＨ＝８．（ｌに浴解しｆ。

■第２試液 各々、キサンチン０．６ｍｍｏ、ｇ／Ａ’、　ＥＤＴＡ
−２ＮａＯ，（１１％、）リド：／Ｘ−１０００，１５
係、β−シクロデキストリン　０．２　ｅｌｊ、　　Ｎ
１ｔｒｏ　−ＴＢ　　０．３６ｓｍｍｏｌ／１１．Ｌ−
ヒスーｙ−ジン１５ｍｍｏｌ／　１．ゼラチン　０．３
　％の濃度になるように、これらを０．１　Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ＝８．０）をこ溶解した。

■第３試液 各々、キサンチンオキシダーゼ　２５０Ｕ／１％Ｅ　Ｄ
　Ｔ　Ａ　−２Ｎａ　　０８００５％の濃度になるよう
に、とハらを０．１　Ｍ　リン酸緩衝液（ｐＨ＝８．０
）に溶解した。

■第４試液（反応停止液） ラウリル硫酸ナトリウム　０．５％及びゼラチン０．３
係を含む水溶′Ｍを調製した、 〔測定方法〕 試料溶液として、コントロール血清１００＋＋＋ｊ！に
。

アスコルビン酸を各々、０，１０．２（１゜３０゜４０
　、５　（１ｍ９７ｄｌ添加したものを用いた。

試料溶液を１００μ！とり、第１試液０．５　ｍｌを加
え、３７℃恒温槽中５分間加温後、第２試液ｌ　ｍｌを
加え、３７℃で３分間加温した、次いで第３試ｌ夜　１
ｍｌを加え％３７°Ｃで２０分間加温した。

第４試液　３　ｍｉを加えて混和し、試薬盲倹を対照と
して波長５６０　ｎｍの吸光度を測定した（Ｅｓ）。

但し、試薬盲検はイオン交換水　Ｑ、　ｌ　ｍｅをとり
、第１試Ｑ　　Ｑ、５ｍｌ、ｇ２試’Ｑ　　１ｍｌを加
え、３７℃恒温槽中２０分間加温後、第４試液　３　ｍ
Ｊを加え１次に第３試液　０．１　ｍｌを加えたものと
した。

試料溶液の代わりにイオン交換水　１００μｌをとシ、
試料溶液と同一操作を行なって、波長５６０　ｎｍの吸
光度を測定した（ＥＢ）。

阻害率は次式に従い算出すればより０ ＥＢ　　＝−Ｅｓ 阻害率（％）−、Ｘｌ０（１・・曲（ＩＩ）（ＥＢ−Ｅ
ｓ）の値を表３に示す。

比較例２６ 〔測定試薬〕 ■第１試液 各々、キサンチン　０．４　ｍｍｏｌ／　ｌ！、　ＥＤ
ＴＡ−２ＮａＯ，（１０５タロ　、　　ト　リ　ト　ン
　Ｘ−１０００，１係、β−ンクロデキストリン　０．
２係、Ｎ１ｔｒｏ　−ＴＢ　　０．２４５ｍｍｏｌ／１
．Ｌ−ヒスチジン１０ｍｍｏｌ！／　１３、ゼラチン　
０３係のき度になるように、これらを０．１　Ｍリン酸
緩衝液（ｐ）ｉ＝８．０）に溶解した。

■第２試液 各々、キサンチンオキシダーゼ　１５０Ｕ／ｌ。

Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　−２Ｎａ　０．００５％の濃度になる
ように、０、１　Ｍ　ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ＝８．１１
）に溶解した。

■第３試Ｓｆ　（反応停止液） ラウリル硫酸す）　ＩＩウム　０．５４　）Ｊ　ヒーＹ
→千７０．３係を含む水浴液を調製し、た。

〔泪１１定方法〕 試料溶液は、実施例４と同じものを周込た。

試料溶液をＩｎｎμｌとり、第１試液ｌ　ｍｉを加え、
３７℃恒温槽中３分間加温後、第２試准　０１ｍ１を加
え、３７°Ｃで２０分間加温した。第３試液３　ｍｌを
加えて混和し、試薬冒検を対期として波長５６　ｎ　ｎ
ｍの吸光度を測定した（Ｅｓ）。イ旦し。

試薬盲検はイオン交換水　Ｑ、　ｌ　ｍｅをとり、第１
試液　１　ｍｌを加え、３７℃恒温槽中２０分間加温後
、第３試液　３　ｍｌを加え１次に第２試Ｗ０．１ｍｌ
を加えたものとした。

試料溶解の代わりにイオン交換水　１００μｌをとり、
試料溶液と同一操作を行なって、波長５６０　ｎｍの吸
光度を測定した（ＥＢ）、。

阻害率は実施例４に記載の式ＣＤに従す算出すハばよい
。

（ＥＢ−Ｅｓ）の値を表３に示す。

表　　３ 比較例２．では、アスコルビン酸によりＮ１ｔｒｏ　−
ＴＢが還元発色し、試料中にアスコルビン酸が１０／ｎ
９／ｄｔ存在する場合、　ＥＢがＥＢよシ大となり。

負の誤差を生じた。しかし１本発明に係る実施例４、で
は、アスコルビン酸が５０ｍ！／７ｄｌ存在しても。

約１０係の正誤差でし、かな力）った。

尚１本実施例に用いたフントロール血清は、阻害率１４
係のものである。

実施例１５゜ 〔測定試薬〕 ■第１試液 実施し１１４に同じ。

■第２試液 実Ｍ５例４に同じ。

■第３試液 実施例４．に同じ。

■第４試液Ｃ反応停止液） 実施例４．に同じ。

〔測定方法〕

試料溶液として人血清（含有アスコルビン酸濃度が１　
ｍ！７／　ｄｉ以下のもの）を用い、実施例、４の、佃
定操作に従−１波長５６０　ｎｍに於ける吸光１支を測
定した。

別に作成した検量線又は実施５１１４に記載の式ＩＪ）
に従い、阻害率を算出した。

結果を表４に示す。

参考例２ 〔測定試薬〕 ■巣ｌ試液 比較例２．に同じ。

■第２試液 比較例２．に同じ。

■第３試液 比較例２．に同じ。

〔測定方法〕

実殉例５と同じ試料ｌ容撤を用−１比￥Ｃ例２．の測定
方法に従カ、阻害率を求めた。結果を表４に示す。

双下町や 表　　４ Ｙ　＝　１．０１　Ｘ　−０，０４（ｒ　＝　０．９９
２８　）表４から明らかなように、実施例５．と参考例
２゜の辿１定結果は良好な相関を示しており１本発明の
方法が、酵素活性に悪影響そ及Ｉｒシてｂないことがわ
かる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例２に於て得られた検量線を表わし、横
軸の乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ’）活性値（Ｗｒ♂ｂｌｅ
ｗｓｋｉ単位）について得らｈだ吸光度（ＯＤ）を縦軸
に沿ってプロットした点を結んだものである。 特許出願人　　和光純薬工業株式会社 第り図 乳酸、脱水＄酵ふ（Ｌ［）Ｈ）括性伍　（Ｗｉｇト１８
す５し１承（→手続補正書 ｌ　事件の表示 昭和５９年特許顎第１９２３４４号 ２　発明の名称 生体微量成分の定量法 ３　補正をする者 事件との関係　　特許出願人 Ｍ絡装置　ｏ３−２７ｏ−ｇｓ７＋ ４　補正命令の日付　　　　　　　　　　　　、−一５
、補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄。 ６　補正の内容 明細書１８頁１行目から同頁２行目にか、けて記載の「
上記方法によりアスコルビン酸を分解した血清ｏ、ｏ５
ｍｅに、」を「血清０．０５　ｍｌをとり上記方法によ
ジアスコルビン酸を分解したのち、」と１正する。 以　　上

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）還元型補酵素又はスーパーオキシドアニオンを定
   量することにより行なう生体微量成分の定量法に於て、
   一価又は二価の銅イオン、ベルオキシダーゼ、及び下記
   １〜７から成る群より選ばれた一種又は二種以上の化合
   物を用いて、共存するアスコルビン酸の影響を除いた後
   、還元型補酵素又はスーパーオキシドアニオンを定量す
   ることを特徴とする、生体微量成分の定量法。 ［１］４−アミノアンチピリン ［２］３−メチルベンゾチアゾリノンヒドラゾン ［３］２，２′−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾ
   リン−６−スルホン酸） ［４］トリフェニルメタン系ロイコ色素 ［５］フェノール系化合物 ［６］アニリン系化合物 ［７］ナフトール系化合物
2. （２）還元型補酵素又はスーパーオキシドアニオンを定
   量する系が、テトラゾリウム塩を還元してホルマザンと
   する系である、特許請求の範囲第１項記載の定量方法。
3. （３）還元型補酵素が、補酵素の存在下、基質に脱水素
   酵素を作用させ生成する還元型袖酵素である、特許請求
   の範囲第１項又は第２項記載の定量方法。
4. （４）還元型補酵素が、ＮＡＤＨ（還元型ニコチンアミ
   ドアデニンジヌクレオチド）又はＮＡＤＰＨ（還元型ニ
   コチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）である、
   特許請求の範囲第１項〜第３項のいずれかに記載の定量
   方法。
5. （５）基質がコレステロール、胆汁酸、グリセリン、グ
   リセリン−３−リン酸、グルコース−６−リン酸、ホル
   ムアルデヒド又はアセトアルデヒドであり、補酵素がＮ
   ＡＤ（酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）
   又はＮＡＤＰ（酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレ
   オチドリン酸）であって、補酵素の存在下、基質に作用
   させる脱水素酵素が各々コレステロール脱水素酵素、３
   α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、グリセリ
   ン脱水素酵素、グリセリン−３−リン酸脱水素酵素、グ
   ルコース−６−リン酸脱水素酵素、ホルムアルデヒド脱
   水素酵素又はアルデヒド脱水素酵素である、特許請求の
   範囲第３項記載の定量方法。
6. （６）脱水素酵素が乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、又はα
   −ヒドロキシ酪酸脱水素酵素（α−ＨＢＤ）であり、補
   酵素がＮＡＤ（酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレ
   オチド）又はＮＡＤＰ（酸化型ニコチンアミドアデニン
   ジヌクレオチドリン酸）であって、補酵素の存在下、脱
   水素酵素の作用を受ける基質が各々乳酸又はα−ヒドロ
   キシ酪酸である、特許請求の範囲第３項記載の定量方法
   。
7. （７）スーパーオキシドアニオンが、キサンチンにキサ
   ンチンオキシダーゼを作用させて生成するスーパーオキ
   シドアニオンである、特許請求の範囲第１項又は第２項
   記載の定量方法。