JPH0310696A - 体液成分の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、被酸化性呈色試薬を用いた酵素法による体液
成分の測定法に間する。更に詳しくは、体液中に共存す
るビリルビン、ヘモグロビン等の妨害物質の影響を回避
した酵素法（被酸化性呈色試薬を用いた）による基質又
は酵素活性の測定法に間する。

［発明の背景］ 生体成分、例えば血液や尿などの体液成分を測定するこ
とは、その変動が疾病と大きく関連しているため、疾患
の診断、病体の解明、治療経過の判定を行う上で、必須
なものとなっている０例えば、血液中のコレステロール
、尿酸、グルコース、トリグリセリド、リン脂質、コリ
ン、クレアチン、クレアチニン、胆汁酸、モノアミンオ
キシダーゼなどを始め非常に多種類の体液成分の測定法
が開発されており、疾病の診断上役立っていることは周
知のとおりである。

現在、血清成分の測定法としては、それが酵素以外のも
のである場合には、目的成分に特異的に作用する酵素を
用い、また、目的成分が酵素の場合には、その基質とな
るべき化合物を用いて夫々酵素反応を行い、これによる
生成物を測定して目的成分量を求める、所謂“酵素法”
が広く普及している。なかでも、過酸化水素生成酵素、
例えば、酸化酵素くオキシダーゼ）を作用させて目的成
分或は目的成分から導かれた物質に相当する過酸化水素
を生成させ、これをペルオキシダーゼ、及び発色成分で
ある被酸化性呈色試薬を用いて発色系に導き、その呈色
を比色定置することにより目的成分量を求める方法が、
被酸化性呈色試薬の開発と相まって増加しつつある０例
えば、コレステロール−コレステロールオキシダーゼ、
トリグリセリド−リボプロティンリパーゼ−グリセロー
ルオキシダーゼ、尿酸−ウリカーゼなどの組み合わせで
発生する過酸化水素を、ペルオキシダーゼ、被酸化性呈
色試薬を用いて発色系に導き、その呈色の吸光度を測定
することにより目的成分量を求める方法である。

しかしながら、これら被酸化性呈色試薬を用いた酵素法
による体液成分の測定法は、試料中に共存する生体内還
元物質、例えばアスコルビン酸、ビリルビン、ヘモグロ
ビン等の還元作用による影響を受けやすく、測定値に負
の誤差を生じることがしばしばあった。また、ヘモグロ
ビン、ビリルビン等の色素は、測定波長によっては誤差
の原因になるし、更には、これら色素自身の吸収が光及
び測定試薬中の成分等により測定中に経時的に変化し、
測定結果に影響を与えることも一般によく知られている
通りである。そこで、これら妨害物質を除くため種々の
方法がこれまでに提案され、検討されている。

これら妨害物質のうち、アスコルビン酸に間しては、そ
の分解方法として、アスコルビン酸酸化酵素を用いる方
法（特公昭５６−３９１９８号公報）、ヨウ素酸若しく
はその塩又は過ヨウ素酸若しくはその塩を用いる方法（
特閏昭５６−１０９５９５号公報、特閏昭５６−１５１
３５８号公報。

特閏昭５６−１０７１６１号公報）、及び鋼イオンを用
いる方法（特閏昭８０−２８２５９９号公報）などが開
示されており、反応が温和な条件で行えるアスコルビン
酸酸化酵素による方法が最も広く普及している。この方
法は、アスコルビン酸酸化酵素が酵素であるが故の固有
の問題点、即ち熱安定側及び貯蔵安定性の問題はあるも
のの、実用土、殆ど影響のない測定系が組み立てられて
おり、更なる改良に対する希求は比較的少ない。

一方、ビリルビンの影響回避方法としては、銅イオンを
用いる方法（特閏昭６０−２６２５９９号公報）及びビ
リルビンオキシダーゼを用いる方法等が開示されている
が、測定試薬の保存安定性、測定系の使用酵素等への阻
害などの問題点があり、未だ満足すべき方法は確立され
ていない、また、ヘモグロビンの影響回避方法としては
、チオ尿素を用いる方法（特閏昭６２−２４８５００号
公報）等が開示されているが、チオ尿素は強い還元剤で
あり、酸化還元反応を利用する測定系への適用にはあま
りにも問題が多い。

［発明の目的］ 本発明は、上記した如き状況に鑑みなされたもので、被
酸化性呈色試薬を用いた酵素法による体液成分の測定に
おけるビリルビン、ヘモグロビンの影響回避方法と、こ
れら妨害物質の影響を回避した体液成分の測定方法を提
供することを目的とする。

［発明の構成］ 本発明は、測定対象物質に、対応する酸化酵素を作用さ
せ、或は酵素反応により生成した物質に対応する酸化酵
素を作用させ、生成する過酸化水素を被酸化性呈色試薬
を用いて光学的に測定することにより体液中の基質又は
酵素活性を測定する方法において、体液中に共存する測
定妨害物質の影響を回避する目的で、測定系にカチオン
性界面活性剤又は／及び両性界面活性剤を存在させるこ
とを特徴とする体液中の基質又は酵素活性の測定方法で
ある。

即ち、本発明者らは、被酸化性呈色試薬を用いた酵素法
による体液成分の測定法において、体液中に存在するビ
リルビン及びヘモグロビンの影響を回避すべく鋭意研究
を行った結果、測定系にカチオン性界面活性剤又は／及
び両性界面活性剤を存在させることにより、その目的を
達成しうろことを見出し、本発明を完成するに至った。

ここで、被酸化性呈色試薬を用いた酵素法による体液成
分の測定法とは、酸化酵素を作用させて目的成分或は目
的成分から導かれた物質に相当する過酸化水素を生成さ
せ、これをペルオキシダーゼ、及び被酸化性呈色試薬を
用いて発色系に導き、その呈色を比色定量することによ
り目的とする体液成分量を求める方法のことである。

本発明で用いられるカチオン性界面活性剤又は両性界面
活性剤は本発明の目的を達成しうるものであれば何れに
てもよいが、例えばカチオン性界面活性剤としては、下
記一般式［Ｉ］から一般式［■］で表わされる化合物が
代表的なものとして挙げられる。

［式中、Ｒ１，Ｒ２は夫々独立して水素原子、炭素数１
〜２２の直鎖状若しくは分校状の、飽和又は不飽和のア
ルキル基、フェニル基、置換フェニル基（置換基は、炭
素数１−１２の直鎖状若しくは分枝状のアルキル基、炭
素数１〜５のアルコキシ基又はハロゲン原子）、アラル
キル基（例えばベンジル基、フェネチル基等）、置換ア
ラルキル基く置換基は、炭素数１〜１２の直鎖状若しく
は分枝状のアルキル基、炭素数１〜５のアルコキシ基又
はハロゲン原子）、又は炭素数５又は６のシクロアルキ
ル基を表わし、アルキル基以下の官能基はその水素原子
の一つが水酸基又はアミノ基で置換されていてもよいｅ
　Ｒ２ＨＲ’は夫々独立して水素原子、炭素数１〜４の
直鎖状若しくは分校状のアルキル基、フェニル基又はト
リル基を表わし、アルキル基以下の官能基はその水素原
子の一つが水酸基又はアミノ基で置換されていてもよい
ｅ　Ｘ’は酸素原子、イオウ原子、−Ｎ（ＣＨ３）−１
−Ｃ０−１−ＣＯＮ　Ｈ−１−ＮＨＣＯ−−ＣＯＯ−−
０ＣＯ−−５Ｏ２Ｎ　Ｈ−−Ｎ　ＨＳ　Ｏ２−１−ＳＯ
３−１−ＯＳＯ２−又は−０５０３−を表わし、Ｙは一
価のアニオン（例えば塩素、臭素、ヨウ素等のハロゲン
原子のアニオン、酢酸、乳酸、硫酸、モノメチル硫酸等
の共役塩基）を表わす、また、Ｊは１から３の整数を表
わし、ｋはＯから２５の整数を表わす、但し、Ｒ１，Ｒ
２，Ｒ３，Ｒ’が共に水素原子であり、かつ、ｋが０で
ある場合、及びＸｌが、−ＣＯ−・Ｃ０ＮＨ−−ＣＯＯ
−、−３０２Ｎ　Ｈ−、−９０３−又は一０Ｓ０２−で
あってＲ１が水素原子である場合を除く。コ（式中、ｘ
２は酸素原子、イオウ原子、−Ｎ（ＣＲ３）−１−ＣＯ
−−ＣＯＮＨ−１＝ＮＨＣＯ−−ＣＯＯ−−ＯＣＯ−−
３Ｏ２Ｎ　Ｈ−１−ＮＨＳＯ２−１−ＳＯ３−１−ｏ　
ｓ　ｏ２−又は−〇５０３−を表わし、ｍは１から３の
整数を表ワシ、Ｒ’、Ｒ２，Ｒ３，Ｒ’、ＸＩ、Ｙ及び
Ｊは前記と同じ、但し、ＸＩが、−ＣＯ−−ＣＯＮ　Ｈ
−、−ＣＯＯ−、−５０２Ｎ　Ｈ−−５０３−又は−０
８０２−であってＲ１が水素原子である場合を除く、） は６員の飽和複素環又はその縮合環を表わし、Ｒ５は水
素原子、炭素数１〜４の直鎖状若しくは分枝状のアルキ
ル基、フェニル基又はトリル基を表わし、アルキル基以
下の官能基はその水素原子の一つが水酸基又はアミノ基
で置換されていてもよく、Ｒ’、Ｒ２，Ｒ３，Ｒ’及び
Ｙは前記と同じ、）は６員の飽和複素環を表わし、Ｒ１
，Ｒ２，Ｒ３及びＹは前記と同じ、但し、Ｒ１及びＲ２
の１又は２が水素原子である場合を除く、） は６員の不飽和複素環又はその縮合環を表わし、Ｈ＋、
Ｒ２，Ｒ３Ｊ　Ｒ４，ＸＺ　Ｙ、ｊ及びｋは前記と同じ
、） Ｉ ３ （式中、”＋　Ｒ２＊　Ｒ３ＨＲ’及びＹは前記と同じ
。

但し、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３及びＲ４の１又は２以上が水素
原子である場合を除く、） （式中、ＲＬ、Ｒ２，Ｒ３及びＹは前記と同じ。但し、
Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３の１又は２以上が水素原子である場合
を除く。） また、両性界面活性剤としては下記一般式［■］から［
Ｘ　Ｉｌｌで表わされる化合物がその代表的なものとし
て挙げられる。

（式中、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３は前記と同じ、但し、Ｒ１Ｒ
２，Ｒ３の１又は２以上が水素原子である場合を除く。

） ２ ［式中、Ｒ６は水素原子、炭素数１〜２２の直鎖状若し
くは分枝状の、飽和又は不飽和のアルキル基、フェニル
基、置換フェニル基（置換基は、炭素数１〜１２の直鎖
状若しくは分校状のアルキル基、炭素数１〜５のアルコ
キシ基又はハロゲン原子）、アラルキル基（例えばベン
ジル基、フェネチル基等）、置換アラルキル基（置換基
は、炭素数１−１２の直鎖状若しくは分枝状のアルキル
基、炭素数１〜５のアルコキシ基又はハロゲン原子）、
又は炭素数５又は６のシクロアルキル基を表わし、アル
キル基以下の官能基はその水素原子の一つが水酸基又は
アミノ基で置換されていてもよい、ｎ。

ｐは夫々独立して０から３の整数を表わし、Ｒ１Ｒ２，
Ｒ３，ＸＺ及びｊは前記と同じ、）（式中、Ｒ１、Ｒ２
、Ｒ３、Ｒ６、Ｘ　ｌ　、　Ｘ　２及びｎは前記と同じ
、） Ｊ　、　ｍ ２ は６員の飽和複素環又はその縮合環を表わし、Ｒ９Ｒ２
ｓ　Ｒ３ｔ　Ｒ’＋Ｒ６＋　Ｘ’ｓ　Ｊ及びｎは前記と
同じ、） （式中、ｘ３は低級アルキレン基又はフェニレン基を表
わし、Ｒ’ｔ　Ｒ２ｔ　Ｒ３＋　Ｘ２＋　Ｊ及びｎは前
記と同じ、） 一般式［夏］で表わされる化合物の具体例としては、例
えばラウリルアミン、ステアリルアミン。

ラウリルステアリルアミン、［２−（バルミチル力ルポ
ニルオキシ）エチル］ジメチルアミン。

（ポリオキシエチレン）ラウリルアミン、ラウリルメチ
ルアニリン等の一級〜三級アミンの塩酸塩。

酢酸塩、乳酸塩等、臭化上チルトリメチルアンモニウム
、臭化ミリスチルトリメチルアンモニウム。

塩化ベンジルデシルジメチルアンモニウム、塩化（４−
ラウリル−２−メチルベンジル）トリメチルアンモニウ
ム、臭化ラウリルジメチル［２−（４−１−オクチルフ
ェニル）エチル］アンモニウム。

塩化（ラウリルチオメチル）トリメチルアンモニウム、
塩化ベンジルジエチル−［２−（バルミチル力ルポニル
アミノ）エチル］アンモニウム、塩化ベンジルジメチル
−［３−（イソプロピルスルホニルアミノ）プロピル］
アンモニウム、臭化２−（デシルメチルアミノ）エチル
トリメチルアンモニウム、塩化ベンジルジメチル［（４
−ｔ−オクチルフェニル）ポリオキシエチレン］アンモ
ニウム等の四級アンモニウム塩が挙げられる。一般式［
１１］で表わされる化合物の具体例としては、例えば塩
酸ビス（ヒドロキシエチル）−（ステアロイルアミノメ
チルカルボニルオキシ）エチルアミン、塩化（ラウロイ
ルオキシエチルアミノカルボニル）メチルトリメチルア
ンモニウム、沃化［２−（４−ｔ−オクチルフェノキシ
）エトキシコメチルトリメチルアンモニウム等が挙げら
る。一般式［■］で表わされる化合物の具体例としては
、例えば塩酸２−［（４−ｔ−オクチルフェノキシ）エ
トキシ］エチルモルホリン、塩化ベンジル−２−（（４
−ｔ−オクチルフェノキシ）エトキシ］エチルピペラジ
ニウム、塩酸２−ヘプタデシル−４−イソプロピル−４
，５−ジヒドロイミダゾール、塩化ｌ−ベンジル−１−
ヒドロキシエチル−２−トリデシル−４，５−ジヒドロ
イミダゾリウム等が挙げられる。一般式［ＩＶ］で表わ
される化合物の具体例としては、例えば塩化ラウリルピ
リジニウム、塩化ラウリルイソキノリニウム、塩化パル
ミチルオキシメチルビリジニウム、塩化２，３−ジフェ
ニル−５−ウンデシルテトラゾリウム等が挙げられる。

一般式［Ｖ］で表わされる化合物の具体例としては、例
えば臭化ラウリルトリメチルホスホニウム、塩化ラウリ
ル（トリーｐ−１リル）ホスホニウム等が挙げられる。

−般式［■］で表わされる化合物の具体例としては、例
えば臭化ラウリルフェニルシクロテトラメチレンホスホ
ニウム等が挙げられる。一般式［■］で表わされる化合
物の具体例としては、例えばメチル硫酸ベンジルラウリ
ルメチルスルホニウム、メチル硫酸エチルバルミチルメ
チルスルホニウム等が挙げられる。一般式［■］で表わ
される化合物の具体例としては、例えばラウリルジメチ
ルアミンオキシド等が挙げられる。一般式［ＩＸ］で表
わされる化合物の具体例としては、例えばＮ、Ｎ−ビス
（オクチルアミノエチル）グリシン、Ｎ−ラウリルアラ
ニン、ラウリル−Ｎ、Ｎ、Ｎ−）サメチル−α−ベタイ
ン、Ｎ−ステアリルオキシメチル−Ｎ、Ｎ−ジメチルベ
タイン、Ｎ−ラウリルチオメチル−Ｎ、Ｎ−ジメチルベ
タイン等が挙げられる。一般式［Ｘ］で表わされる化合
物の具体例としては、例えばＮ−（ラウリルチオエトキ
シ）メチル−Ｎ、Ｎ−ジメチルベタイン等が挙げられる
。一般式［ＸＩ］で表わされる化合物の具体例としては
、例えばＮ−カルボキシメチル−Ｎ−（ステアリルオキ
シメチル）ピペリジニウムベタイン、２−ラウリル−１
−力ルボキシメチルー１−（２−ヒドロキエチル）イミ
ダゾリウムベタイン等が挙げられる。一般式［Ｘｎ］で
表わされる化合物の具体例としては、例えばＮ−バルミ
チルスルホタウリン、４−（パルミチルアミノメチル）
ベンゼンスルホン酸等が挙げられる。しかしながら、こ
れらの具体例は単なる例示であって本発明に係るカチオ
ン性及び両性界面活性剤はこれらに限定されるものでな
いことは言うまでもない、これらカチオン性又は／及び
両性界面活性剤は通常、試料中０．００１〜１０％の濃
度で、好ましくは０．０１〜３％の濃度で用いられ、夫
々単独で用いても、二種以上を組み合わせて用いても任
意である。

本発明の方法により測定可能な体液成分としては、例え
ばコレステロール、尿酸、グルコース、トリグリセリド
、リン脂質、コリン、クレアチン、クレアチニン、胆汁
酸、乳酸、遊離脂肪酸又はピルビン酸等の基質や、例え
ばモノアミンオキシダーゼ、グアナーゼ、コリンエステ
ラーゼ等の酵素等が挙げられるが、特にこれらに限定さ
れるものではなく、酵素反応により生成する過酸化水素
を定量することによって測定が可能な体液成分は全て測
定可能である。

本発明の測定法は、体液中に共存する測定妨害物質の影
響を回避する目的で測定系にカチオン性界面活性剤又は
／及び両性界面活性剤を存在させる（通常は測定試液中
に添加する）以外は被酸化性呈色試薬を用いる自体公知
の酵素法（酵素反応により生成する過酸化水素を被酸化
性呈色試薬を用いて光学的に測定することにより目的と
する体液成分量を求める）による体液成分の測定法に準
じてこれを行えば足りる。

本発明の方法による体液成分の定量において、過酸化水
素を生成させる酵素として用いられる酸化酵素くオキシ
ダーゼ）及びその他の目的で用いられる酵素類並びに酵
素反応に閏与する基質及びその他の物質の種類及び使用
量は被酸化性呈色試薬を用いる自体公知の体液成分の測
定法に準じて夫々測定対象となる物質に応じて適宜選択
すればよい。

本発明の測定法に於いて使用される被酸化性呈色試薬と
しては、過酸化水素と反応して呈色するものであれば何
れにてもよいが、例えば４−アミノアンチピリンとフェ
ノール系、ナフトール系若しくはアニリン系化合物の絹
み合わせ、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラ
ゾンとアニリン系化合物の絹み合わせ、２，２′−アミ
ノビス（３−エチルベゾチアゾリン−６−スルホン酸）
、トリフェニルメタン系ロイコ色素、ジフェニルアミン
誘導体、ベンジン誘導体、トリアリルイミダゾール誘導
体、ロイコメチレンブル−誘導体又は〇−フェニレンジ
アミン誘導体等を挙げることができる。４−アミノアン
チピリンと組み合わされるフェノール系化合物の具体例
としては、例えばフェノール、ｐ−クロロフェノール又
は２，４−ジクロロフェノール等が挙げられ、ナフトー
ル系化合物の具体例としては、例えばｌ−ナフトール、
１−ナフトール−２−スルホン酸又はｌ−ナフトール−
２−カルボン酸等が挙げられ、また、４−アミノアンチ
ピリン又は３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラ
ゾンと組み合わされるアニリン系化合物の具体例として
は、例えばアニリン、　Ｎ、Ｎ−ジエチルアミン、Ｎ−
エチル−Ｎ−（β−ヒドロキシエチル）−ｍ−トルイジ
ン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプ
ロピル）−３，５−ジメトキシアニリン又はＮ−エチル
−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−
１ルイジン等が挙げられる。また、トリフェニルメタン
系ロイコ色素の具体例としては、例えばロイコマラカイ
トグリーン、ビス（ｐ−ジエチルアミノフェニル）−２
−スルホフェニルメタン又はビス（ｐ−ジエチルアミノ
フェニル’）−３，４−ジスルホプロポキシフェニルメ
タン・ジナトリウム塩等が挙げられ、ジフェニルアミン
誘導体の具体例としては、例えばビス［４−ジ（２−ブ
トキシエチル）アミノ−２−メチルフェニル］アミン又
はＮ、Ｎ−ビス（４−ジエチルアミノ−２−メチルフェ
ニル）−Ｎ’−ｐ−）ルエンスルホニル尿素等が挙げら
れ、また、ロイコメチレンブル−誘導体の具体例として
は、例えば１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル
）＝３．７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン・
ナトリウム塩又は１０−［３−（メトキシカルボニルア
ミノメチル）フェニルメチルアミノ力ルボニルト３゜７
−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン等が挙げられ
る。更に、ベンジン誘導体の具体例としては、例えばベ
ンジン、ｏ−トリジン、０−ジアニシジン、３．３’−
ジアミノベンジン又は３，３１　、５　、５１−テトラ
アミノベンジン等が挙げられ、トリアリルイミダゾール
誘導体の具体例としては、例えば２−（４−カルボキシ
フェニル）−３−Ｎ−メチルカルバモイル−４，５−ビ
ス（４−ジエチルアミノフェニル）イミダゾール又は２
−（３−メトキシ−４−ジエチルアミノフェニル）−３
−Ｎ−メチルカルバモイル−４，５−ビス（２−メチル
−４−ジエチルアミノフェニル）イミダゾール等が挙げ
られる。

また、本発明において用いられるベルオキシダーゼとし
ては、その起源、由来に特に限定はなく、植物、動物、
微生物起源のペルオキシダーゼ又はペルオキシダーゼ様
物質が、一種若しくは二種以上鞘み合わせて用いられる
。被酸化性呈色試薬及びペルオキシダーゼの使用量は目
的に応じて適宜室められ、特に限定されない。

本発明による体液成分の定量は、通常、ｐＨ４，０〜１
Ｏ１０、より好ましくはｐＨ６，０〜８．０で実施され
る。

用いられる緩衝剤としては、リン酸塩、クエン酸塩、ホ
ウ酸塩、炭酸塩、トリス緩衝剤、グツド（Ｇｏｏｄ’ｓ
）　Ｗｉ衝剤等が挙げられるが、特にこれらに限定され
ない。なお、カチオン性界面活性剤又は／及び両性界面
活性剤と検体成分とにより濁り等が生じた場合には、非
イオン性界面活性剤（例えばトリトンＸ−１００（ロー
ム及ｎ−フ社商品名）等）や糖類等を添加して、これを
防止しても差し支えない。

以下に実施例を挙げるが、本発明はこれら実施例により
何ら制約を受けるものではない。

［実施例コ 実施例１．総コレステロールの定量 （測定試液１） Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピ
ル）−３，５−ジメトキシアニリン・ナトリウム塩を２
００−ｇ／ｌ、コレステロールエステラーゼを２７００
Ｕ／ｌ、ポリオキシエチレンノニルフェノールエーテル
を１．２８／Ｉの濃度になるように、５゜＠Ｍ　ＭＥ　
Ｓ　（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）−水
酸化ナトリウム緩衝液に溶解し、これにカチオン性界面
活性剤である臭化セチルトリメチルアンモニウム（以下
ｒｃＴＭＡ」と略記する。）を夫々０．０１％、（ＬＯ
２５％、０．０５％となるように添加した。

（測定試液２） ４−アミノアンチピリンを８２０３／Ｉ、ペルオキシダ
ーゼを６０００Ｕ／ｌ、コレステロールオキシダーゼを
２００　ＯＬ！／Ｉ及びポリオキシエチレンノニルフェ
ノールエーテルを１．２３／Ｉの濃度になるように、５
０■Ｍ　ＭＥＳ　（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスル
ホン酸）−水酸化ナトリウム緩衝液に溶解した。

（試料液） プール血清にジタウロビリルビンを０．１０，２０．３
０．４０ｍ３／ｄｌになるように添加したものを試料液
とし・た。

（ｉｌｌ定法法 試料液３μｍに測定試液１　３００μｍを加え、３７℃
で５分閏加温後、更に測定試液２　１００μＩを加えて
同温度で５分閏加温した後、７００ｎ−の吸光度から６
００ｎ＊の吸光度を差し引いた吸光度差ＥＳを求めた。

一方、精製水及びコレステロール標準液（コレステロー
ル２００−ｇ／ｄ　＋含有）を用いて同様の操作を行い
、盲検ｄｉ　Ｅ　Ｂ　Ｌ及び標準液吸光度Ｅ　ＳＴＤを
測定した。

次式に従いプール血清中の総コレステロール濃度を算出
した。

総コレステロール濃度（ｓｇ／旧） ＝　（（ＥＳ−ＥＩＩＬ）÷（ＥＳＴＤ−ＥＢＬ））　
Ｘ２００比較例１゜ 実施例１において、測定試液１からＣＴＭＡを除いた以
外は実施例１と全く同様の測定試液を用い、実施例１と
同じ試料液について実施例１と全く同様の測定方法によ
り測定を行い、実施例１と全く同様にしてプール血清中
の総コレステロール濃度を算出した。

実施例１及び比較例１の測定結果を表１に示す。

以下余白 表　　１ されており、ＣＴＭＡの濃度が高くなるにつれてその効
果もより顕著になっていることが判る。

実施例２．総コレステロールの定量 実施例１において、測定試液ｌからＣＴＭＡを除き、代
わりに測定試液２にＣＴＭＡｌｔｏ、０３％、０．０７
５％、０．１５％、０．２０％又は０゜３０％となるよ
うに添加し、それ以外は実施例１と全く同様にして測定
を行い、プール血清中の総コレステロール濃度を算出し
た。

実施例２の測定結果を比較例１の測定結果と共に表２に
示す。

表１から明らかな如く、本発明に係るカチオン性界面活
性剤ＣＴＭＡ存在下に測定を行った実施例１の値はＣＴ
ＭＡ不存在下の比較例１のそれに比べてジタウロビリル
ビンの影響が明らかに低減衰　　２ 表２から明らかな如く、実施例２で得られた値はいずれ
も比較例１に比べてジタウロビリルビンの影響が明らか
に低減されており、実施例１と同様に、ＣＴＭＡの濃度
が高くなるにつれてその効果がｍ著になっていることが
判る。このことがら測定試液ｌ又は測定試液２のいずれ
にＣＴＭＡを添加して使用しても有効であることが判る
。

実施例３．！！コレステロールの定量 実施例２において、ＣＴＭＡの代わりに両性界面活性剤
であるアンヒトール２ＯＮ　（花王（株）商品名、主成
分；ラウリルジメチルアミンオキシド）を測定試液２に
０．３％、０．６％、１．０％、３゜０％、５．０％と
なるように添加し、それ以外は実施例２と全く同様にし
て測定を行い、プール血清中の総コレステロール濃度を
算出した。

比較例２゜ 実施例３において、測定試液２からアンヒトール２ＯＮ
を除いた以外は実施例３と全く同様にして測定を行い、
プール血清中の総コテステロール濃度を算出した。

実施例３及び比較例２の測定結果を表３に示す。

表　　３ 表３から明らかな如く、実施例３で得られた値はいずれ
も比較例２に比べ、ジタウロビリルビンの影響が明らか
に低減されており、その効果はアンヒトール２ＯＮの濃
度が高くなるにつれて顕著になっていることが判る。

実施例４．総コレステロールの定量 く測定試液１） 実施例１と同じ。

（測定試液２） 実施例１と同じ。

（試料液） 粉末ビリルビン（和光純薬工業（株）製）を０゜ＩＮ水
酸化ナトリウムで溶解した後、０．ＩＮ塩酸を加えてｐ
Ｈを８．０に調整した溶液をプール血清にビリルビンが
０，１０，２０，３０，４０ＩＩｇ／ｄｉになるように
添加したものを試料液とした。

（測定方法） 実施例１と同じ。

比較例３゜ 実施例４において、測定試液ｌからＣＴＭＡを除いた以
外は実施例４と全く同様にして測定を行い、プール血清
中の総コレステロール濃度を算出した。

実施例４及び比較例３の測定結果を表４に示す。

表　　４ 表４から明らかな如く、実施例４で得られた値はいずれ
も比較例３に比べてビリルビンの影響が低減されており
、本発明に係るカチオン性界面活性剤は遊離のビリルビ
ンに対しても有効であることが判る。

実施例５．尿酸の定量 （測定試液１） Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピ
ル）−ｍ−）ルイジンを２８３＠ｇ／Ｉ、ペルオキシダ
ーゼを３０００ｕ／Ｉ及びトリトンＸ−４０５を１００
−３１＋の濃度になるように、８０ａＭリン酸緩衝液に
溶解し、これにカチオン性界面活性剤である臭化ミリス
チルトリメチルアン毛ニウムとトリトンＸ−１００を夫
々０．１％となるように添加した。

（ｉ？！定試液２） ４−アミノアンチピリンを６１０ｍｚ／Ｉ、ウリカーゼ
を６６００／Ｉ、トリトンＸ−４０５を１００−３１１
の濃度になるように、８０冒門リン酸緩衝液に溶解した
。

（試料液） プール血清にジタウロビリルビンを０．１０，２０．３
０，４０＠ｇ／ｄｌになるように添加したものを試料液
とした。

（測定方法） 試料液１０μｍに測定試液１　３００μｍを加え、３７
℃で５分閏加温後、更に測定試液２１５０μｌを加えて
同温度で５分閏加温した後、５７０ｎｍの吸光度から７
０Ｏｎ＠の吸光度を差し引いた吸光度差Ｅｓを求めた。

一方、精製水及び尿酸標準液（尿酸１０■３１ｃｔ　＋
含有）を用いて同様の操作を行い、盲検値ＥＢＬ及び標
準液吸光度Ｅ　ＳＴＤを測定した。

次式に従いプール血清中の尿酸濃度を算出した。

尿酸濃度（飄３／ｄ　＋　） ＝　　（（Ｅｓ−ＥＢＬ）÷（Ｅｓｒｏ−Ｅ［ｌｔ、）
）　　Ｘ１００比較例４゜ 実施例５において、測定試液１から臭化ミリスチルトリ
メチルアンモニウム及びトリトンＸ−１００を除いた以
外は実施例Ｓと全く同様にして測定を行い、プール血清
中の尿酸濃度を算出した。

実施例５及び比較例４の測定結果を表５に示す。

表５ 表５から明らかな如く、実施例６で得られた値はいずれ
も比較例５に比べてジタウロビリルビンの影響が明らか
に低減されており、本発明の測定法は尿酸の定量におい
ても有効であることが判る。

実施例６．尿酸の定量 （測定試液１） 実施ｆ９４５と同じ。

（ｉ１１定試液２） 実施例５と同じ。

（試料液） 粉末ビリルビン（和光純薬工業（株）！りを０゜ＩＮ水
酸化ナトリウムで溶解した後、０．ＩＮ塩酸を加えてｐ
Ｈを８．０に調整した溶液をプール血清ζこビリルビン
が０．１０，２０，３０，４０置＄／ｄ＋になるように
添加したものを測定試液とした。

比較例５゜ 実施例５において、試料液にジタウロビリルビンの代わ
りに遊離のビリルビンを添加した以外は比較例４と同様
の操作を行い、プール血清中の尿酸濃度を算出した。

実施例６及び比較例５の測定結果を表６に示す。

表　　６ 表６から明らかな如く、実施例６で得られた値はいずれ
も比較例５に比べてビリルビンの影響が低減されており
、本発明に係るカチオン性界面活性剤は遊離のビリルビ
ンに対しても有効であることが判る。

実施例７．尿酸の定量 （測定試液ｌ） 実施例５において測定試液ｌに臭化ミリスチルトリメチ
ルアンモニウム及びトリトンＸ−１００を夫々０．１％
となるように添加する代わりにアンヒトール２ＯＮを０
．３％となるように添加した。

（！定試液２） 実施例５と同じ。

（試料液） プール血清に溶血液（自家ｇ４製）をヘモグロビン４度
が０．１００，２００，３００，４００，５００、１０
００ｍｇ／引になるように添加した。

（ｉｌｌｌｌｌ法定 実施例５と同じ。

比較例６゜ 実施例７において、測定試液ｌからアンヒトール２ＯＮ
を除いた以外は実施例７と全く同様にして測定を行い、
プール血清中の尿酸濃度を算出した。

実施例７及び比較例６の測定結果を表７に示す。

表　　７ 表７から明らかな如く、実施例７で得られた値は比較例
６に比べてヘモグロビンの影響が少なく、本発明に係る
カチオン性界面活性剤はヘモグロビンに対しても有効で
あることが判る。

実施例８．遊離コレステロールの定量 （１１定試液ｌ） 実施例２における測定試液ｌからコレステロールエステ
ラーゼを除いたものを測定試液ｌとした。

（測定試液２） 実施例２の測定試液２に於いて、コレステロールオキシ
ダーゼ濃度２０００Ｕ／Ｉを２００Ｕ／ｌとし、ＣＴＭ
ＡＩＩ度を０．０３％としたものを測定試液２とした。

（試料液） 以下の４種の試料液を調製した。

（１）プール血清にジタウロビリルビン及びヘモグロビ
ンのいずれをも添加しなかった。

（２）プール血清にジタウロビリルビンを４０■ｇ／ｄ
１になるように添加した。

（３）プール血清にヘモグロビンを５００ｍｇ／ｄｌに
なるように添加した。

（４）プール血清にジタウロビリルビン及びヘモグロビ
ンを夫々４０■３１ｄＩ及び５００ｍｇ／ｄｌとなるよ
うに添加した。

（温室方法） 試料液の使用量を３μｍから６μｍに変更し、更にコレ
ステロール標準液をコレステロール２００１ｇ１引含有
のものから１００ｍｇ／ｄｌ含有のものに変更した以外
は実施例２と同様の方法により測定を行い、次式に従い
プール血清中の遊離コレステロール濃度を算出した。

遊離コレステロール濃度（１ｇ／ｄｌ）＝　（（Ｅｓ　
　ＥＢＬ）÷（Ｅｓｔｏ−ＥＢＬ））　Ｘ１００比較例
７゜ 実施例８において、測定試薬２からＣＴＭＡを除いた以
外は実施例８と全く同様にして測定を行い、プール血清
中の総コレステロール濃度を算出した。

実施例８及び比較例７の測定結果を表８に示す。

以下余白 表 ８ 存するビリルビン、ヘモグロビン等の測定妨害物質の影
響を回避し、より正確な測定を可能にした点に顕著な効
果を奏するものである。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）測定対象物質に、対応する酸化酵素を作用させ、
   或は酵素反応により生成した物質に対応する酸化酵素を
   作用させ、生成する過酸化水素を被酸化性呈色試薬を用
   いて光学的に測定することにより体液中の基質又は酵素
   活性を測定する方法において、体液中に共存する測定妨
   害物質の影響を回避する目的で、測定系にカチオン性界
   面活性剤又は／及び両性界面活性剤を存在させることを
   特徴とする体液中の基質又は酵素活性の測定方法。
2. （２）測定妨害物質がビリルビン又は／及びヘモグロビ
   ンである請求項１に記載の測定方法。
3. （３）測定対象となる基質がコレステロール、尿酸、グ
   ルコース、トリグリセリド、リン脂質、コリン、クレア
   チン、クレアチニン、胆汁酸、乳酸、遊離脂肪酸又はピ
   ルビン酸である請求項１又は２に記載の測定方法。
4. （４）測定対象となる酵素がモノアミンオキシダーゼ、
   グアナーゼ又はコレステロールエステラーゼである請求
   項１又は２に記載の測定方法。
5. （５）使用する被酸化性呈色試薬が４−アミノアンチピ
   リンとフェノール系、ナフトール系若しくはアニリン系
   化合物の組み合わせ、３−メチル２−ベンゾチアゾリノ
   ンヒドラゾンとアニリン系化合物の組み合わせ、２、２
   ’−アジノビス（３−エチルベゾチアゾリン−６−スル
   ホン酸）、トリフェニルメタン系ロイコ色素、ジフェニ
   ルアミン誘導体、ベンジン誘導体、トリアリルイミダゾ
   ール誘導体、ロイコメチレンブル−誘導体又は０−フェ
   ニレンジアミン誘導体である請求項１〜４のいずれかに
   記載の測定方法。