JPH064037B2 - ス−パ−オキシドジスムタ−ゼ活性測定法 - Google Patents
ス−パ−オキシドジスムタ−ゼ活性測定法Info
- Publication number
- JPH064037B2 JPH064037B2 JP3338286A JP3338286A JPH064037B2 JP H064037 B2 JPH064037 B2 JP H064037B2 JP 3338286 A JP3338286 A JP 3338286A JP 3338286 A JP3338286 A JP 3338286A JP H064037 B2 JPH064037 B2 JP H064037B2
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- salt
- reagent
- maleimide
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 〔発明の利用分野〕 本発明は、血清、血球、尿等に含まれるスーパーオキシ
ドジスムターゼ（以下、ＳＯＤと略称する。）活性測定
法に関する。
ドジスムターゼ（以下、ＳＯＤと略称する。）活性測定
法に関する。
自然界に於て、微生物，植物，高等動物など好気的生物
は、分子状酸素を有効に利用して生命維持に不可欠なエ
ネルギーを効率よく得ているが、同時に種々の活性酸素
が生成し、これが生体にさまざまな害を及ぼすことが知
られている。例えば活性酸素の１つであるスーパーオキ
シドアニオン（以下、 とする。）は炎症、発癌、老化、また、核酸・酵素・脂
質などの変性の原因となるなど、広範囲にわたり生体に
とって有害である。
は、分子状酸素を有効に利用して生命維持に不可欠なエ
ネルギーを効率よく得ているが、同時に種々の活性酸素
が生成し、これが生体にさまざまな害を及ぼすことが知
られている。例えば活性酸素の１つであるスーパーオキ
シドアニオン（以下、 とする。）は炎症、発癌、老化、また、核酸・酵素・脂
質などの変性の原因となるなど、広範囲にわたり生体に
とって有害である。
ＳＯＤは好気的生物のすべてに普遍的に存在し、超酸化
物不均化酵素ともよばれ、生体内の の不均化反応、即ち を触媒する酵素であり、生体を酸素毒性から守ってい
る。
物不均化酵素ともよばれ、生体内の の不均化反応、即ち を触媒する酵素であり、生体を酸素毒性から守ってい
る。
赤血球，白血球，組織切片中のＳＯＤ活性測定と臨床的
意義に関する報告は多いが、血清中のＳＯＤについては
蛋白成分をはじめ種々の成分がＳＯＤ測定値に影響を及
ぼす為、未だ充分な検討はなされていない。現在行われ
ているＳＯＤ活性測定法は、いずれの方法も を発生させる系と を検出する系とから構成され、ＳＯＤが の不均化を促進することによって の生成量が減少するのを利用したものである。
意義に関する報告は多いが、血清中のＳＯＤについては
蛋白成分をはじめ種々の成分がＳＯＤ測定値に影響を及
ぼす為、未だ充分な検討はなされていない。現在行われ
ているＳＯＤ活性測定法は、いずれの方法も を発生させる系と を検出する系とから構成され、ＳＯＤが の不均化を促進することによって の生成量が減少するのを利用したものである。
ＳＯＤ活性測定法に於ける の発生系には、超酸化化合物、例えば超酸化カリウムに
より を生成させる系や還元型補酵素と電子伝達体の反応によ
り を生成させる系等もあるが、現在、主としてキサンチン
にキサンチンオキシダーゼを作用させる方法が一般に用
いられている。この反応を次に示す。
より を生成させる系や還元型補酵素と電子伝達体の反応によ
り を生成させる系等もあるが、現在、主としてキサンチン
にキサンチンオキシダーゼを作用させる方法が一般に用
いられている。この反応を次に示す。
また、 の検出系には、 の還元作用を利用したニトロテトラゾリウムブルー（以
下、NO2-ＴＢと略称する。）法、チトクロームＣ法、 の酸化作用を利用したエピネフリン法、ピロガロール
法、６−ヒドロキシドーパミン法などがある。
下、NO2-ＴＢと略称する。）法、チトクロームＣ法、 の酸化作用を利用したエピネフリン法、ピロガロール
法、６−ヒドロキシドーパミン法などがある。
これらＳＯＤ活性測定法の原理を、 の発生系にキサンチン、キサンチンオキシダーゼを用
い、 の検出系にNO2−ＴＢ法を用いた方法を例にとり下式に
示す。
い、 の検出系にNO2−ＴＢ法を用いた方法を例にとり下式に
示す。
即ち、 発生系に於て、例えばキサンチンオキシダーゼはキサン
チンと分子状酸素（O2）との反応を触媒し、 を生じるが、この系にＳＯＤが存在すると、 の不均化が促進され生じた はO2とH2O2とになる。ここに生成する はチトクロームＣ、NO2-ＴＢなどを還元・発色させ、
又、エピネフリン、ピロガロール、６−ヒドロキシドー
パミンなどを酸化・発色させる性質を有するので、この
性質を利用して試薬盲検値に対する検体吸光度の減少を
測定しＳＯＤ活性値を求めている。従って、これらの方
法はいずれも試薬盲検値が高い為測定精度が悪く、ま
た、測定範囲も狭いなどの欠点を有している。
チンと分子状酸素（O2）との反応を触媒し、 を生じるが、この系にＳＯＤが存在すると、 の不均化が促進され生じた はO2とH2O2とになる。ここに生成する はチトクロームＣ、NO2-ＴＢなどを還元・発色させ、
又、エピネフリン、ピロガロール、６−ヒドロキシドー
パミンなどを酸化・発色させる性質を有するので、この
性質を利用して試薬盲検値に対する検体吸光度の減少を
測定しＳＯＤ活性値を求めている。従って、これらの方
法はいずれも試薬盲検値が高い為測定精度が悪く、ま
た、測定範囲も狭いなどの欠点を有している。
かかる状況に於て、本発明者らは を基質とするＳＯＤ活性の測定法について鋭意研究を重
ね、電子伝達体の共存下、 にＳＯＤが作用して生ずるH2O2を定量することによりＳ
ＯＤ活性が測定し得ることを見出し、先に特許出願して
いる（特願昭60-40526号）。また、更にそれを改良した
試薬盲検値の変動がなく且つ感度及び検量線の直線性に
優れたＳＯＤ活性測定法についても特許出願している
（特願昭60-144168号，特願昭60-265257号）。
ね、電子伝達体の共存下、 にＳＯＤが作用して生ずるH2O2を定量することによりＳ
ＯＤ活性が測定し得ることを見出し、先に特許出願して
いる（特願昭60-40526号）。また、更にそれを改良した
試薬盲検値の変動がなく且つ感度及び検量線の直線性に
優れたＳＯＤ活性測定法についても特許出願している
（特願昭60-144168号，特願昭60-265257号）。
最初の発明は、通常 はそれ自体の不均化反応により次第にH2O2に変化する
が、そこに電子伝達体が存在すると 自体の不均化反応によるH2O2生成は起らず、この系にＳ
ＯＤが存在する場合のみ、その活性量に比例してH2O2が
生成するという事実に基づきなされたものであり、２番
目の発明は、この測定法の反応系に更にマレイミド又は
マレイミド誘導体を共存させると、試薬盲検値の変動が
なくなり、且つ感度及び検量線の直線性も改善されると
いうものであり、３番目の発明は、この系に更に臭素イ
オンを共存させると感度及び検量線の直線性が更に改善
されるというものである。しかしながら、その後の研究
の結果、上記３番目の方法でも検量線の直線性はＳＯＤ
活性値約150U／mlまでであり、ＳＯＤの高値を示す試料
については実用上必ずしも満足し得るものではないこと
が判明した。
が、そこに電子伝達体が存在すると 自体の不均化反応によるH2O2生成は起らず、この系にＳ
ＯＤが存在する場合のみ、その活性量に比例してH2O2が
生成するという事実に基づきなされたものであり、２番
目の発明は、この測定法の反応系に更にマレイミド又は
マレイミド誘導体を共存させると、試薬盲検値の変動が
なくなり、且つ感度及び検量線の直線性も改善されると
いうものであり、３番目の発明は、この系に更に臭素イ
オンを共存させると感度及び検量線の直線性が更に改善
されるというものである。しかしながら、その後の研究
の結果、上記３番目の方法でも検量線の直線性はＳＯＤ
活性値約150U／mlまでであり、ＳＯＤの高値を示す試料
については実用上必ずしも満足し得るものではないこと
が判明した。
本発明は、電子伝達体、マレイミド又はマレイミド誘導
体、及びカルボニル化合物の存在下、 にＳＯＤが作用して生ずるH2O2を定量することにより行
う体液中のＳＯＤ活性の測定法に於て、検量線の直線性
に優れ、且つ検量範囲が極めて広い、精度の高いＳＯＤ
活性測定法を提供することを目的とする。
体、及びカルボニル化合物の存在下、 にＳＯＤが作用して生ずるH2O2を定量することにより行
う体液中のＳＯＤ活性の測定法に於て、検量線の直線性
に優れ、且つ検量範囲が極めて広い、精度の高いＳＯＤ
活性測定法を提供することを目的とする。
本発明は、スーパーオキシドアニオンを基質とし、電子
伝達体、マレイミド又はマレイミド誘導体、及びカルボ
ニル化合物の存在下、これにＳＯＤが作用して生ずる過
酸化水素を定量することにより行うＳＯＤ活性測定法に
於て、クエン酸又はその塩の共存下にこれを行うことを
特徴とするＳＯＤ活性測定法である。
伝達体、マレイミド又はマレイミド誘導体、及びカルボ
ニル化合物の存在下、これにＳＯＤが作用して生ずる過
酸化水素を定量することにより行うＳＯＤ活性測定法に
於て、クエン酸又はその塩の共存下にこれを行うことを
特徴とするＳＯＤ活性測定法である。
即ち、本発明は、ＳＯＤが存在する 生成系に、電子伝達体、マレイミド又はマレイミド誘導
体、及びカルボニル化合物を共存させ、この系で生成す
るH2O2を測定することによってＳＯＤ活性を測定しよう
とする際に、 生成系にクエン酸又はその塩を共存させると、検量線の
直線性が一段と改善され、ＳＯＤ活性値150U／ml以上の
高濃度の試料でも精度よく測定することが可能となると
いうことを、本発明者らが初めて見出し完成させたもの
である。
体、及びカルボニル化合物を共存させ、この系で生成す
るH2O2を測定することによってＳＯＤ活性を測定しよう
とする際に、 生成系にクエン酸又はその塩を共存させると、検量線の
直線性が一段と改善され、ＳＯＤ活性値150U／ml以上の
高濃度の試料でも精度よく測定することが可能となると
いうことを、本発明者らが初めて見出し完成させたもの
である。
本発明に於けるクエン酸（又はその塩）を他の有機酸
（又はその塩）と置き換えた場合には、本発明の如き効
果は全く得られない。
（又はその塩）と置き換えた場合には、本発明の如き効
果は全く得られない。
即ち、例えば、クエン酸と同様に水酸基を有する酸であ
る、乳酸、グリコール酸、酒石酸、リンゴ酸、α−オキ
シ酪酸等のオキシ酸やその他の酢酸、コハク酸、マレイ
ン酸、マロン酸等の有機酸類を用いた場合には無添加の
場合と殆ど差がなく、ＳＯＤが高濃度の場合には検量線
の直線性が全く得られない。このように、各種有機酸類
の中でクエン酸だけにこのような効果があるということ
は、極めて意外なことである。
る、乳酸、グリコール酸、酒石酸、リンゴ酸、α−オキ
シ酪酸等のオキシ酸やその他の酢酸、コハク酸、マレイ
ン酸、マロン酸等の有機酸類を用いた場合には無添加の
場合と殆ど差がなく、ＳＯＤが高濃度の場合には検量線
の直線性が全く得られない。このように、各種有機酸類
の中でクエン酸だけにこのような効果があるということ
は、極めて意外なことである。
本発明に用いられるクエン酸又はその塩の濃度は特に限
定されないが、通常、 生成系中、３〜40mmol/lが好ましく用いられる。
定されないが、通常、 生成系中、３〜40mmol/lが好ましく用いられる。
本発明に用いられるクエン酸の塩としては、例えばナト
リウム塩、カリウム塩、リチウム塩等のアルカリ金属塩
や、アンモニウム塩、各種有機アミン塩等が挙げられ
る。
リウム塩、カリウム塩、リチウム塩等のアルカリ金属塩
や、アンモニウム塩、各種有機アミン塩等が挙げられ
る。
本発明に用いられるマレイミド又はマレイミド誘導体と
しては、例えばマレイミド、N-エチルマレイミド（以下
ＮＥＭと略称する。）N-（9-アクリジニル）マレイミ
ド、N-（1-アニリノナフチル−4）マレイミド、N-（4-
アニリノフェニル）マレイミド、N-〔p-（2-ベンズイミ
ダゾリル）フェニル〕マレイミド、N-（7-ジメチルアミ
ノ-4-メチルクマリニル）マレイミド、N-（3-フルオラ
ンチル）マレイミド等や、特開昭59-204171号公報で開
示されている一般式[I]で表わされるN-置換マレイミド
誘導体など各種のものが使用できるが、なかでもＮＥＭ
が水に対する溶解性が優れているという点で好ましく用
いられる。
しては、例えばマレイミド、N-エチルマレイミド（以下
ＮＥＭと略称する。）N-（9-アクリジニル）マレイミ
ド、N-（1-アニリノナフチル−4）マレイミド、N-（4-
アニリノフェニル）マレイミド、N-〔p-（2-ベンズイミ
ダゾリル）フェニル〕マレイミド、N-（7-ジメチルアミ
ノ-4-メチルクマリニル）マレイミド、N-（3-フルオラ
ンチル）マレイミド等や、特開昭59-204171号公報で開
示されている一般式[I]で表わされるN-置換マレイミド
誘導体など各種のものが使用できるが、なかでもＮＥＭ
が水に対する溶解性が優れているという点で好ましく用
いられる。
〔式中、R1は水素、ニトロ基、ジ低級アルキルアミノ基
又はR3-CONH-なる基（但し、R3は低級アルキル基又はフ
ェニル基である。）であり、R2は水素又はニトロ基であ
る。また、マレイミド置換基はベンゾイル置換基のオル
ト又はパラ位にある。〕 本発明に於て用いられるマレイミド又はマレイミド誘導
体の濃度は、反応液中0.5mmol/l以上であれば有効であ
るが、通常は２〜40mmol/lの範囲が好ましく用いられ
る。
又はR3-CONH-なる基（但し、R3は低級アルキル基又はフ
ェニル基である。）であり、R2は水素又はニトロ基であ
る。また、マレイミド置換基はベンゾイル置換基のオル
ト又はパラ位にある。〕 本発明に於て用いられるマレイミド又はマレイミド誘導
体の濃度は、反応液中0.5mmol/l以上であれば有効であ
るが、通常は２〜40mmol/lの範囲が好ましく用いられ
る。
本発明に用いられるカルボニル化合物としては、芳香族
ケトン化合物又は脂肪族ケトン化合物等が挙げられる。
これらのものを例示すると、芳香族ケトンとしてはベン
ゾフェノン、アセトフェノン、2-ヒドロキシ-4-メトキ
シベンゾフェノン-5-スルホン酸（以下ＨＭＢＰと略称
する。）、ベンゾフェノン-2-カルボン酸、3,3',4,4'-
ベンゾフェノンテトラカルボン酸、ｏ−ヒドロキシベン
ゾフェノン、ｐ−ヒドロキシベンゾフェノン、ベンゾフ
ェノン-2,4'-ジカルボン酸、2-ヒドロキシ-5-メチルベ
ンゾフェノン、2'−−ヒドロキシ-5'-メチルアセトフェ
ノン、4'−ヒドロキシ-2'-メチルアセトフェノン、4'−
ヒドロキシ-3'-メチルアセトフェノン、2'−ヒドロキシ
-4'-メトキシアセトフェノン、2-ヒドロキシ-4'-メトキ
シアセトフェノンなどが挙げられ、又脂肪族ケトンとし
てはアセトン、メチルエチルケトン、メチル-n-ブチル
ケトン、メチルイソブチルケトン、メチル-tert-ブチル
ケトン、メチル-n-アミルケトン、メチルイソアミルケ
トンなどが挙げられる。使用濃度は反応液中0.5mmol/l
以上であれば有効であるが、通常は1mmol/l〜40mmol/l
の範囲が好ましく用いられる。
ケトン化合物又は脂肪族ケトン化合物等が挙げられる。
これらのものを例示すると、芳香族ケトンとしてはベン
ゾフェノン、アセトフェノン、2-ヒドロキシ-4-メトキ
シベンゾフェノン-5-スルホン酸（以下ＨＭＢＰと略称
する。）、ベンゾフェノン-2-カルボン酸、3,3',4,4'-
ベンゾフェノンテトラカルボン酸、ｏ−ヒドロキシベン
ゾフェノン、ｐ−ヒドロキシベンゾフェノン、ベンゾフ
ェノン-2,4'-ジカルボン酸、2-ヒドロキシ-5-メチルベ
ンゾフェノン、2'−−ヒドロキシ-5'-メチルアセトフェ
ノン、4'−ヒドロキシ-2'-メチルアセトフェノン、4'−
ヒドロキシ-3'-メチルアセトフェノン、2'−ヒドロキシ
-4'-メトキシアセトフェノン、2-ヒドロキシ-4'-メトキ
シアセトフェノンなどが挙げられ、又脂肪族ケトンとし
てはアセトン、メチルエチルケトン、メチル-n-ブチル
ケトン、メチルイソブチルケトン、メチル-tert-ブチル
ケトン、メチル-n-アミルケトン、メチルイソアミルケ
トンなどが挙げられる。使用濃度は反応液中0.5mmol/l
以上であれば有効であるが、通常は1mmol/l〜40mmol/l
の範囲が好ましく用いられる。
本発明の方法に於て用いられる電子伝達体としては、例
えばフェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）、1-メトキ
シ-5-メチルフェナジニウムメチルサルフェート（1-メ
トキシＰＭＳ）、9-ジメチルアミノベンゾ−α−フェナ
ゾキソニウムクロリド（メルドラブルー）等が挙げられ
るがこれらに限定されるものではなく、これらと同等の
作用を有する電子伝達体は全て使用可能である。これら
は夫々単独で用いても２種以上混合して用いてもかまわ
ない。これら電子伝達体の使用濃度は特に限定されない
が、通常0.001〜1mMが好ましく用いられる。
えばフェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）、1-メトキ
シ-5-メチルフェナジニウムメチルサルフェート（1-メ
トキシＰＭＳ）、9-ジメチルアミノベンゾ−α−フェナ
ゾキソニウムクロリド（メルドラブルー）等が挙げられ
るがこれらに限定されるものではなく、これらと同等の
作用を有する電子伝達体は全て使用可能である。これら
は夫々単独で用いても２種以上混合して用いてもかまわ
ない。これら電子伝達体の使用濃度は特に限定されない
が、通常0.001〜1mMが好ましく用いられる。
本発明は、スーパーオキシドアニオンを基質とし、これ
と電子伝達体、マレイミド又はマレイミド誘導体及びカ
ルボニル化合物からなるＳＯＤ測定系にクエン酸又はそ
の塩を共有させると、検量線の直線性が更に高濃度まで
延びるというものであるが、スーパーオキシドアニオン
を基質とし、これと電子伝達体、マレイミド又はマレイ
ミド誘導体、カルボニル化合物及び臭素イオンからなる
ＳＯＤ測定系にクエン酸又はその塩を共存させても全く
同様の効果が得られる。
と電子伝達体、マレイミド又はマレイミド誘導体及びカ
ルボニル化合物からなるＳＯＤ測定系にクエン酸又はそ
の塩を共有させると、検量線の直線性が更に高濃度まで
延びるというものであるが、スーパーオキシドアニオン
を基質とし、これと電子伝達体、マレイミド又はマレイ
ミド誘導体、カルボニル化合物及び臭素イオンからなる
ＳＯＤ測定系にクエン酸又はその塩を共存させても全く
同様の効果が得られる。
この場合に用いられる臭素イオンの濃度は特に限定され
ないが、通常、 生成系中、0.05ミリイオン当量〜10ミリイオン当量／
が好ましく用いられる。臭素イオン源としては、臭素
イオンBを解離するものであればいずれにてもよい
が、通常は無機及び有機の臭素塩類がより好ましく用い
られる。無機臭素塩類としては、例えば、臭化アンモニ
ウム、臭化ナトリウム、臭化カリウム、臭化リチウム、
臭化マグネシウム等の塩類や、臭化水素酸をアルカリ性
物質で中和したその他の塩類などが挙げられるが、これ
らに限定されるものではない。また、有機臭素塩類とし
ては、例えば、セチルトリメチルアンモニウムブロミ
ド、テトラメチルアンモニウムブロミド、セチルジメチ
ルエチルアンモニウムブロミド、及びセチルピリジニウ
ムブロミドなどのカチオン性界面活性剤や、臭化水素酸
を有機塩基性物質例えばアミン類等で中和した化合物な
どが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
ないが、通常、 生成系中、0.05ミリイオン当量〜10ミリイオン当量／
が好ましく用いられる。臭素イオン源としては、臭素
イオンBを解離するものであればいずれにてもよい
が、通常は無機及び有機の臭素塩類がより好ましく用い
られる。無機臭素塩類としては、例えば、臭化アンモニ
ウム、臭化ナトリウム、臭化カリウム、臭化リチウム、
臭化マグネシウム等の塩類や、臭化水素酸をアルカリ性
物質で中和したその他の塩類などが挙げられるが、これ
らに限定されるものではない。また、有機臭素塩類とし
ては、例えば、セチルトリメチルアンモニウムブロミ
ド、テトラメチルアンモニウムブロミド、セチルジメチ
ルエチルアンモニウムブロミド、及びセチルピリジニウ
ムブロミドなどのカチオン性界面活性剤や、臭化水素酸
を有機塩基性物質例えばアミン類等で中和した化合物な
どが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本発明に用いられる 生成系としては、キサンチンとキサンチンオキシダーゼ
との反応により を生成させる系、超酸化化合物（例えば超酸化カリウ
ム）により を生成させる系、又は還元型補酵素と電子伝達体との反
応により を生成させる系が主として用いられるが、その他の方
法、例えば還元型フラビンとO2との反応、低原子価の遷
都金属イオンによる還元、O2の電解還元などにより生成
する 等も利用できることは勿論である。
との反応により を生成させる系、超酸化化合物（例えば超酸化カリウ
ム）により を生成させる系、又は還元型補酵素と電子伝達体との反
応により を生成させる系が主として用いられるが、その他の方
法、例えば還元型フラビンとO2との反応、低原子価の遷
都金属イオンによる還元、O2の電解還元などにより生成
する 等も利用できることは勿論である。
酵素反応の液性は中性からアルカリ性であればよいが、
通常pH７〜10が好ましく用いられる。
通常pH７〜10が好ましく用いられる。
本発明の方法は、ＳＯＤの作用により一定時間内に生成
したH2O2量を測定することによって酵素活性を求める方
法であり、H2O2と反応して発色する発色剤を酵素反応系
に存在させ、その呈色の単位時間当りの吸光度変化量か
らＳＯＤ活性を求める、いわゆるレイト法でも測定可能
であるが、又、一定時間酵素反応させ反応を停止させた
後に吸光度を測定する、いわゆるエンド法でも測定可能
である。一般に、用手法で行う場合にはエンド法を用い
ることが多い。エンド法は、所定時間酵素反応させた後
に反応を停止させ生成したH2O2を定量する方法である
為、反応停止剤が必要となる。この場合、一定時間酵素
反応と発色反応を行った後反応停止剤を加えて反応を停
止させ吸光度を測定する方法でも、又一定時間酵素反応
させた後反応停止剤を加えて酵素反応を停止させると同
時に発色反応を行わせる方法でも可能である。
したH2O2量を測定することによって酵素活性を求める方
法であり、H2O2と反応して発色する発色剤を酵素反応系
に存在させ、その呈色の単位時間当りの吸光度変化量か
らＳＯＤ活性を求める、いわゆるレイト法でも測定可能
であるが、又、一定時間酵素反応させ反応を停止させた
後に吸光度を測定する、いわゆるエンド法でも測定可能
である。一般に、用手法で行う場合にはエンド法を用い
ることが多い。エンド法は、所定時間酵素反応させた後
に反応を停止させ生成したH2O2を定量する方法である
為、反応停止剤が必要となる。この場合、一定時間酵素
反応と発色反応を行った後反応停止剤を加えて反応を停
止させ吸光度を測定する方法でも、又一定時間酵素反応
させた後反応停止剤を加えて酵素反応を停止させると同
時に発色反応を行わせる方法でも可能である。
反応停止剤としては、H2O2の定量の通常ペルオキシダー
ゼ（ＰＯＤ）と被酸素性呈色試薬とを用いて行われた
り、４価のチタン化合物と2-（5-ブロモ-2-ピリジルア
ゾ)-5-(N-プロピル-N-スルホプロピルアミノ）フェノー
ル又は／及びその塩とから成る試薬を用いて行われるこ
とを考慮すると、液性が中性付近で且つこれら呈色試薬
の発色に影響を与えないような反応停止剤が要求され
る。
ゼ（ＰＯＤ）と被酸素性呈色試薬とを用いて行われた
り、４価のチタン化合物と2-（5-ブロモ-2-ピリジルア
ゾ)-5-(N-プロピル-N-スルホプロピルアミノ）フェノー
ル又は／及びその塩とから成る試薬を用いて行われるこ
とを考慮すると、液性が中性付近で且つこれら呈色試薬
の発色に影響を与えないような反応停止剤が要求され
る。
これらの要求にかなうものとして本発明者らは先の特許
出願（特願昭60-40526号）に於てデシル硫酸又はその
塩、ドデシル硫酸又はその塩、及びドデシルベンゼンス
ルホン酸又はその塩から成る群より選ばれた１種又は２
種以上の混合物を反応停止剤として取り上げ、これらを
用いることにより問題点が解決し得ることを見出した
が、本発明に於てもこれらの反応停止剤が停止剤として
の効果になんら変りがなく有効に使用し得ることを確認
した。
出願（特願昭60-40526号）に於てデシル硫酸又はその
塩、ドデシル硫酸又はその塩、及びドデシルベンゼンス
ルホン酸又はその塩から成る群より選ばれた１種又は２
種以上の混合物を反応停止剤として取り上げ、これらを
用いることにより問題点が解決し得ることを見出した
が、本発明に於てもこれらの反応停止剤が停止剤として
の効果になんら変りがなく有効に使用し得ることを確認
した。
反応停止剤の濃度は、1.5mmol/l以上であれば充分その
機能を発揮するが、通常３〜100mmol/lが好ましく用い
られる。又液性は、最終呈色液の液性が発色反応の至適
条件に合うように自由に選択できるが、通常はＰＯＤの
安定性、被酸化性呈色試薬の安定性、呈色に適した液性
などを考慮してpH４〜９が好ましく用いられる。
機能を発揮するが、通常３〜100mmol/lが好ましく用い
られる。又液性は、最終呈色液の液性が発色反応の至適
条件に合うように自由に選択できるが、通常はＰＯＤの
安定性、被酸化性呈色試薬の安定性、呈色に適した液性
などを考慮してpH４〜９が好ましく用いられる。
本発明のＳＯＤ活性測定法におけるH2O2の定量法及びH2
O2定量用試薬としては、従来行われているH2O2のいずれ
の定量法でも、又、従来用いられているH2O2のいずれの
定量用試薬でもよく、例えばペルオキシダーゼと被酸化
性呈色試薬との組合せでH2O2を定量する方法及びこれに
用いる被酸化性呈色試薬その他の定量用試薬はすべて使
用可能である。かかる被酸化性呈色試薬としては例え
ば、4-アミノアンチピリン（以下4-ＡＡＰと略称す
る。）と、フェノール系化合物又はN,N−ジ置換アニリ
ン系化合物とを組合せた被酸化性呈色試薬、3-メチルベ
ンゾチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）とアニリン系
化合物との組合せ試薬、2,2'−アジノビス（3-エチルベ
ンゾチアゾリン-6-スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、トリフ
ェニルメタン系ロイコ色素、ベンジジン誘導体、ｏ−ト
リジン誘導体、ジフェニルアミン誘導体、トリアリルイ
ミダゾール誘導体、ｏ−フェニレンジアミン、ロイコメ
チレンブルー誘導体等が挙げられるが、これらに限定さ
れるものではない。この他、ＰＯＤを用いない方法とし
て最近開発された４価のチタン化合物と2-(5ブロモ-2-
ピリジルアゾ）-5−（N-プロピル-N-スルホプロピルア
ミノ）フェノール又は／及びその塩との組合せ試薬を用
いる方法等もH2O2の定量法として使用できる。
O2定量用試薬としては、従来行われているH2O2のいずれ
の定量法でも、又、従来用いられているH2O2のいずれの
定量用試薬でもよく、例えばペルオキシダーゼと被酸化
性呈色試薬との組合せでH2O2を定量する方法及びこれに
用いる被酸化性呈色試薬その他の定量用試薬はすべて使
用可能である。かかる被酸化性呈色試薬としては例え
ば、4-アミノアンチピリン（以下4-ＡＡＰと略称す
る。）と、フェノール系化合物又はN,N−ジ置換アニリ
ン系化合物とを組合せた被酸化性呈色試薬、3-メチルベ
ンゾチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）とアニリン系
化合物との組合せ試薬、2,2'−アジノビス（3-エチルベ
ンゾチアゾリン-6-スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、トリフ
ェニルメタン系ロイコ色素、ベンジジン誘導体、ｏ−ト
リジン誘導体、ジフェニルアミン誘導体、トリアリルイ
ミダゾール誘導体、ｏ−フェニレンジアミン、ロイコメ
チレンブルー誘導体等が挙げられるが、これらに限定さ
れるものではない。この他、ＰＯＤを用いない方法とし
て最近開発された４価のチタン化合物と2-(5ブロモ-2-
ピリジルアゾ）-5−（N-プロピル-N-スルホプロピルア
ミノ）フェノール又は／及びその塩との組合せ試薬を用
いる方法等もH2O2の定量法として使用できる。
被酸化性呈色試薬及び酸化発色後のその呈色をより安定
化させるには、本発明者らが先の特許出願に於て述べた
ように、β−シクロデキストリン又は／及びその誘導
体、若しくはγ−シクロデキストリン又は／及びその誘
導体を溶液中に共存させればよい。
化させるには、本発明者らが先の特許出願に於て述べた
ように、β−シクロデキストリン又は／及びその誘導
体、若しくはγ−シクロデキストリン又は／及びその誘
導体を溶液中に共存させればよい。
これらの濃度としてはβ−シクロデキストリンは溶液中
通常0.01〜1.5重量／容量％，γ−シクロデキストリン
は0.1〜３重量／容量％，β−シクロデキストリン誘導
体は0.1〜５重量／容量％，γ−シクロデキストリン誘
導体は0.1〜５重量／容量％が夫々用いられ、又、これ
ら２種以上の化合物を上記濃度で任意の比率で混合して
用いてもよい。
通常0.01〜1.5重量／容量％，γ−シクロデキストリン
は0.1〜３重量／容量％，β−シクロデキストリン誘導
体は0.1〜５重量／容量％，γ−シクロデキストリン誘
導体は0.1〜５重量／容量％が夫々用いられ、又、これ
ら２種以上の化合物を上記濃度で任意の比率で混合して
用いてもよい。
シクロデキストリン誘導体としては例えば、 β−CD(-OH)19(ONO2)2 β−CD(-OH)19.2(OPO3H)1.8 β−CD(-OH)19(OSO3H)2 β−CD(-OH)18.5(-O-CH2-CO2H)2.5 β−CD(-OH)19.3(-O-CH2CH2CH2-SO3H)1.7 β−CD(-OH)18.5(-O-CH2CH2CH2-SO3H)2.5 β−CD(-OH)18.0(-O-CH2CH2CH2-SO3H)3.0 β−CD(-OH)7(-OCH3)14 β−CD(-OCH3)21 等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本発明の方法をより効果的に実施するには、例えば、キ
サンチンを0.05〜20mmol/l、電子伝達体、例えば1-メト
キシＰＭＳを0.001〜1mmol/l、マレイミド又はマレイミ
ド誘導体、例えばＮＥＭを２〜40mmol/l含むpH約７〜10
の緩衝液（第１試薬）の一定量に、一定量の血清を加
え、37℃に加温後、キサンチンオキシダーゼの反応液中
濃度が10〜200U/lになるようにキサンチンオキシダーゼ
を含み、且つクエン酸を３〜40mmol/l、カルボニル化合
物を１〜40mmol/lと被酸化性呈色試薬及び要すればβ−
（又は／及びγ−）シクロデキストリン又は／及びその
誘導体とを含むpH７〜10の緩衝液（第２試薬）の一定量
を加えて37℃で一定時間酵素反応させる。その後、反応
停止剤及びＰＯＤを含む緩衝液（第３試薬）の一定量を
加えて酵素反応を停止させると同時に生成したH2O2と被
酸化性呈色試薬との発色反応を開始させ、37℃で一定時
間反応させた後呈色度を測定する。第３試薬の液性は、
最終呈色液の液性が被酸化性呈色試薬の至適発色液性に
なるように適宜選択すればよい。
サンチンを0.05〜20mmol/l、電子伝達体、例えば1-メト
キシＰＭＳを0.001〜1mmol/l、マレイミド又はマレイミ
ド誘導体、例えばＮＥＭを２〜40mmol/l含むpH約７〜10
の緩衝液（第１試薬）の一定量に、一定量の血清を加
え、37℃に加温後、キサンチンオキシダーゼの反応液中
濃度が10〜200U/lになるようにキサンチンオキシダーゼ
を含み、且つクエン酸を３〜40mmol/l、カルボニル化合
物を１〜40mmol/lと被酸化性呈色試薬及び要すればβ−
（又は／及びγ−）シクロデキストリン又は／及びその
誘導体とを含むpH７〜10の緩衝液（第２試薬）の一定量
を加えて37℃で一定時間酵素反応させる。その後、反応
停止剤及びＰＯＤを含む緩衝液（第３試薬）の一定量を
加えて酵素反応を停止させると同時に生成したH2O2と被
酸化性呈色試薬との発色反応を開始させ、37℃で一定時
間反応させた後呈色度を測定する。第３試薬の液性は、
最終呈色液の液性が被酸化性呈色試薬の至適発色液性に
なるように適宜選択すればよい。
また、本発明の方法は、タンパク電気泳動法によるＳＯ
Ｄ分画の染色にも利用できる。タンパク電気泳動法によ
るＳＯＤ分画の染色法は、Charles Beauchamp,Irwin Fr
idovichら（Anal.Biochem.,44,276〜287,1971）により
報告されている如く、基質（ ）によるニトロテトラゾリウムブルーの還元に基づく支
持体の染色が、ＳＯＤの存在により阻害されてＳＯＤ分
画部分の染色が弱くなることを利用した方法であり、こ
れまでデンシトメーターによる染色度の測定は困難であ
ったが、本発明により、定量的な染色法の開発の可能性
が生まれた。
Ｄ分画の染色にも利用できる。タンパク電気泳動法によ
るＳＯＤ分画の染色法は、Charles Beauchamp,Irwin Fr
idovichら（Anal.Biochem.,44,276〜287,1971）により
報告されている如く、基質（ ）によるニトロテトラゾリウムブルーの還元に基づく支
持体の染色が、ＳＯＤの存在により阻害されてＳＯＤ分
画部分の染色が弱くなることを利用した方法であり、こ
れまでデンシトメーターによる染色度の測定は困難であ
ったが、本発明により、定量的な染色法の開発の可能性
が生まれた。
更にまた、本発明の方法は組織或は細胞内のＳＯＤ活性
の局在を染色し観察する方法としての組織化学染色法へ
の応用も気体できるものである。
の局在を染色し観察する方法としての組織化学染色法へ
の応用も気体できるものである。
以下に実施例及び比較例を挙げて本発明を更に詳細に説
明うるが、本発明はこれら実施例により何ら限定される
ものではない。
明うるが、本発明はこれら実施例により何ら限定される
ものではない。
実施例１． ［試 薬］ (1)第１試液 キサンチンを0.3mmol/l、１−メトキシＰＭＳを0.03mmo
l/l、ＮＥＭを８mmol/l、の濃度になるように、0.05Ｍ
リン酸塩緩衝液（pH8.0）に溶解した。
l/l、ＮＥＭを８mmol/l、の濃度になるように、0.05Ｍ
リン酸塩緩衝液（pH8.0）に溶解した。
(2)第２試液 キサンチンオキシダーゼを60U/、４−ＡＡＰを0.01
％、ＴＯＯＳを0.1％、クエン酸三ナトリウム・２水和
物を17mmol/l、ＨＭＢＰを５mmol/lの濃度になるよう
に、0.05Ｍリン酸塩緩衝液（pH8.0）に溶解した。
％、ＴＯＯＳを0.1％、クエン酸三ナトリウム・２水和
物を17mmol/l、ＨＭＢＰを５mmol/lの濃度になるよう
に、0.05Ｍリン酸塩緩衝液（pH8.0）に溶解した。
(3)第３試液 ドデシル硫酸ナトリウムを70mmol/l、ＰＯＤを5000U/
の濃度になるように、0.2Ｍリン酸一ナトリウム溶液に
溶解した。
の濃度になるように、0.2Ｍリン酸一ナトリウム溶液に
溶解した。
［試 料］ Sigma社製人由来ＳＯＤ（Product Number Ｓ7006）を
イオン交換水で、50，100，150，200U/mlになるように
溶解し調製した。
イオン交換水で、50，100，150，200U/mlになるように
溶解し調製した。
［操作法］ 試料 100μをとり、第１試液1.0mlを加え、37℃恒温
槽中３分間加温後、第２試液1.0mlを加えて、更に37℃
で20分間加温した。次いで、第３試液2.0mlを加えて混
和し、37℃で５分間加温後、試料の代りにイオン交換水
を用いて同様に操作した試薬盲検を対照として、波長55
5nmの吸光度を測定した。
槽中３分間加温後、第２試液1.0mlを加えて、更に37℃
で20分間加温した。次いで、第３試液2.0mlを加えて混
和し、37℃で５分間加温後、試料の代りにイオン交換水
を用いて同様に操作した試薬盲検を対照として、波長55
5nmの吸光度を測定した。
比較列１． ［試 薬］ (1)第１試液 実施例１の第１試液と同じ。
(2)第２試液 実施例１の第２試液の組成から、クエン酸三ナトリウム
を除いた組成の試液を調製した。
を除いた組成の試液を調製した。
(3)第３試液 実施例１の第３試液と同じ。
［試 料］ 実施例１と同じ。
［操作法］ 実施例１と同じ。
比較例２〜10 ［試 薬］ (1)第１試液 実施例１の第１試液と同じ。
(2)第２試液 実施例１の第２試液の組成のうち、クエン酸三ナトリウ
ム・２水和物17mmol/lを各種有機酸又はその塩（乳酸、
グリコール酸、リンゴ酸、酒石酸二ナトリウム・２水和
物、コハク酸、酢酸ナトリウム、安息香酸ナトリウム、
マレイン酸、マロン酸）17mmol/lに代えた試液を調製し
た。
ム・２水和物17mmol/lを各種有機酸又はその塩（乳酸、
グリコール酸、リンゴ酸、酒石酸二ナトリウム・２水和
物、コハク酸、酢酸ナトリウム、安息香酸ナトリウム、
マレイン酸、マロン酸）17mmol/lに代えた試液を調製し
た。
(3)第３試液 実施例１の第３試液と同じ。
［試 料］ 実施例１と同じ。
［操作法］ 実施例１と同じ。
実施例１及び比較例１の検量線を第１図に示す（但し、
実施例１の検量線は−・−で示し、比較例１の検量線は
−−×−−で示した。）。
実施例１の検量線は−・−で示し、比較例１の検量線は
−−×−−で示した。）。
第１図より明らかな如く、各ＳＯＤ活性値に対してプロ
ットした吸光度を結ぶ検量線は、実施例１ではＳＯＤ活
性値200U/mlまで原点を通る直線になるが、比較例１で
はＳＯＤ活性値100U/ml以上では検量線が湾曲し、定量
性が乏しくなっている。
ットした吸光度を結ぶ検量線は、実施例１ではＳＯＤ活
性値200U/mlまで原点を通る直線になるが、比較例１で
はＳＯＤ活性値100U/ml以上では検量線が湾曲し、定量
性が乏しくなっている。
また、表１に実施例１及び比較例１〜10の測定結果を示
す。
す。
表１より明らかな如く、クエン酸以外の有機酸を添加し
た場合は無添加と殆ど差はなく、クエン酸のような効果
は全く得られなかった。
た場合は無添加と殆ど差はなく、クエン酸のような効果
は全く得られなかった。
実施例２． ［試 薬］ (1)第１試液 キサンチンを0.3mmol/l、１−メトキシＰＭＳを0.03mmo
l/l、臭化ナトリウムを７mmol/l、ＮＥＭを８mmol/lの
濃度になるように、0.05Ｍリン酸塩緩衝液（pH8.0）に
溶解した。
l/l、臭化ナトリウムを７mmol/l、ＮＥＭを８mmol/lの
濃度になるように、0.05Ｍリン酸塩緩衝液（pH8.0）に
溶解した。
(2)第２試液 実施例１の第２試液と同じ。
(3)第３試液 実施例１の第３試液と同じ。
［試 料］ 実施例１と同じ。
［操作法］ 実施例１と同じ。
第２図にＳＯＤ活性値（Ｕ／ml）と吸光度との関係を示
す。
す。
第２図より明らかな如く、各ＳＯＤ活性値に対してプロ
ットした吸光度を結ぶ検量線は200U/mlまで原点を通る
直線となり、検量線は良好な定量性を示す。
ットした吸光度を結ぶ検量線は200U/mlまで原点を通る
直線となり、検量線は良好な定量性を示す。
以上に詳述した如く、本発明は、体液例えば血清等に含
まれるＳＯＤ活性を、電子伝達体、マレイミド又はマレ
イミド誘導体、カルボニル化合物及びクエン酸（又はそ
の塩）の存在下、ＳＯＤの作用で から生成するH2O2を測定することにより求める方法を提
供するものであり、本測定系にクエン酸（又はその塩）
を共存させたことにより、検量線の直線性が一段と改善
され、ＳＯＤ活性値150U／ml以上の高濃度の試料でも精
度よく測定できる点に顕著な効果を奏する発明である。
まれるＳＯＤ活性を、電子伝達体、マレイミド又はマレ
イミド誘導体、カルボニル化合物及びクエン酸（又はそ
の塩）の存在下、ＳＯＤの作用で から生成するH2O2を測定することにより求める方法を提
供するものであり、本測定系にクエン酸（又はその塩）
を共存させたことにより、検量線の直線性が一段と改善
され、ＳＯＤ活性値150U／ml以上の高濃度の試料でも精
度よく測定できる点に顕著な効果を奏する発明である。
第１図は、実施例１及び比較例１に於て得られた検量線
を示す（但し、−・−は実施例１の検量線を表わし、−
−×−−は比較例１の検量線を表わす。）。いずれも横
軸の各ＳＯＤ活性値（U/ml）について得られた吸光度を
縦軸に沿ってプロットした点を結んだものである。 第２図は、実施例２に於て得られた検量線を示し、横軸
の各ＳＯＤ活性値（U/ml）について得られた吸光度を縦
軸に沿ってプロットした点を結んだものである。
を示す（但し、−・−は実施例１の検量線を表わし、−
−×−−は比較例１の検量線を表わす。）。いずれも横
軸の各ＳＯＤ活性値（U/ml）について得られた吸光度を
縦軸に沿ってプロットした点を結んだものである。 第２図は、実施例２に於て得られた検量線を示し、横軸
の各ＳＯＤ活性値（U/ml）について得られた吸光度を縦
軸に沿ってプロットした点を結んだものである。
Claims (5)
- 【請求項１】スーパーオキシドアニオンを基質とし、電
子伝達体、マレイミド又はマレイミド誘導体、及びカル
ボニル化合物の存在下、これにスーパーオキシドジスム
ターゼ（ＳＯＤ）が作用して生ずる過酸化水素を定量す
ることにより行うＳＯＤ活性測定法に於て、クエン酸又
はその塩の共存下にこれを行うことを特徴とするＳＯＤ
活性測定法。 - 【請求項２】電子伝達体が、フェナジンメトサルフェー
ト（ＰＭＳ）、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウ
ムメチルサルフェート（１−メトキシＰＭＳ）、及び９
−ジメチルアミノベンゾ−α−フェナゾキソニウムクロ
リド（メルドラブルー）から成る群より選ばれた１種又
は２種以上である、特許請求の範囲第１項記載の測定
法。 - 【請求項３】スーパーオキシドアニオンが、キサンチン
とキサンチンオキシダーゼの組合せ系、超酸化物、又は
還元型補酵素と電子伝達体の組合せ系から生成される、
特許請求の範囲第１項又は第２項記載の測定法。 - 【請求項４】酵素反応停止剤を用い、酵素反応を停止さ
せた後、或いは停止させると同時に、生成した過酸化水
素をペルオキシダーゼと発色剤を用いて比色定量するこ
とにより行う、特許請求の範囲第１項〜第３項のいずれ
かに記載の測定法。 - 【請求項５】酵素反応停止剤として、デシル硫酸又はそ
の塩、ドデシル硫酸又はその塩、及びドデシルベンゼン
スルホン酸又はその塩から成る群より選ばれた１種又は
２種以上の混合物を用いる、特許請求の範囲第１項〜第
４項のいずれかに記載の測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3338286A JPH064037B2 (ja) | 1986-02-18 | 1986-02-18 | ス−パ−オキシドジスムタ−ゼ活性測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3338286A JPH064037B2 (ja) | 1986-02-18 | 1986-02-18 | ス−パ−オキシドジスムタ−ゼ活性測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62190099A JPS62190099A (ja) | 1987-08-20 |
| JPH064037B2 true JPH064037B2 (ja) | 1994-01-19 |
Family
ID=12385040
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3338286A Expired - Lifetime JPH064037B2 (ja) | 1986-02-18 | 1986-02-18 | ス−パ−オキシドジスムタ−ゼ活性測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH064037B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006013921A1 (ja) * | 2004-08-05 | 2006-02-09 | Asahi Kasei Pharma Corporation | プロテアーゼ反応促進剤及び／又は色素の安定化剤を含む試薬 |
| CN114480561B (zh) * | 2022-01-14 | 2023-08-29 | 山东博科生物产业有限公司 | 一种超氧化物歧化酶检测试剂盒 |
-
1986
- 1986-02-18 JP JP3338286A patent/JPH064037B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS62190099A (ja) | 1987-08-20 |
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