JPS589094B2 - Ｎ−ヒドロキシスルホアルキルアニリン誘導体及びその応用 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は特許請求の範囲に記載の一般式（Ｉ）で示され
るＮ−ヒドロキシスルホアルキルアニリン誘導体及びそ
の塩類（以下「本発明化合物」と略す）に関するもので
ある。

上記の本発明化合物はいずれも文献未載の新規物質であ
って、パーオキシダーゼまたは、それと同様な作用のあ
る物質が触媒し又は関与するところの過酸化水素の定量
のための色素形成物質として有用である。

さらに本発明は特許請求の範囲第１項に記載の物質を構
成成分とするところの過酸化物質定量用組成物、及びそ
のような組成物を用いるところの過酸化物質定量方法に
も関するものである。

ここに「過酸化物質」とは、例えば過酸化水素や過酸化
脂質のような酸化作用を有する物質をいう。

これを更に詳し《いえば、本発明はパーオキシダーゼま
たは、それと同様な触媒作用を有する物質が触媒し、ま
たは関与するところの過酸化水素あるいは過酸化脂質の
ごとき過酸化物質を定量するための組成物、及び該組成
物を使用するところの過酸化物質の定量法にも関する。

さて臨床検査としての酵素的分析法は近年にいたりその
特異性がますます高く評価されると共に、急速に普及し
つつある。

例えば体液中のグルコース、尿酸、コレステロール等が
、グルコースオキシダーゼ、ウリカーゼ、コレステロー
ルオキシダーゼ等の酵素により酸化をうけると過酸化水
素が生成するが、その過酸化水素を定量することにより
、体液中のグルコース、尿酸、コレステロール等を定量
することができる。

尿酸を例にとると、これはウリカーゼにより次のように
酸化されて過酸化水素を生ずる。

そのほか生体組織や体液中の過酸化脂質は、老化現象や
退行性変化を伴う疾患の原因との関連で注目されている
。

更に最近では、食品中に含まれる過酸化水素の発癌性が
明らかにされている。

このように生体内で酸化酵素によって生ずる過酸化水素
や、生体内の過酸化脂質、食品中に含まれる過酸化水素
を定量することの必要性が最近とみに高まってきている
。

さて、過酸化物質を定量するためには、普通、酵素的又
は非酵素的に触媒作用のある物質（パーオキシダーゼや
鉄イオンのような遷移金属、またはこれらと同様の作用
のある物質）及び過酸化物質とこれらの共存下で、検出
可能な変化（普通は色変化）を起す物質とから成る組成
物が用いられている。

そして後者、すなわち色変化をおこすところのいわゆる
色素形成物質には次のようなものがある。

（１）アニリン並びにその誘導体（例えばＮ−Ｎ−ジメ
チルアニリン）及びトルイジン並びにその誘導体（例え
ばＮ−Ｎ−ジエチルトルイジン）のようなモノアミン類
。

（２）フエニレンジアミン並びにその誘導体及びベンジ
ン、ジアニシジンのようなジアミン類。

（３）フェノール並びにその誘導体及びクレゾール、ナ
フトールのようなフェノール類。

（４）２・６−ジクロ口フェノールインドフェノールの
ような染料 （５）ロイコマラカイトグリーン、ロイコフェノールフ
タレインのようなトリフエニルメタン類。

これらは単独に使用されることもあれば、４−アミノア
ンチピリンや３−メチルベンゾテアゾリノンヒドラゾン
のような発色剤と一緒に用いられる場合もある。

一方、生体内の測定の目的物を酸化分解する酵素は、そ
の至適活性ｐＨの分布範囲が広く通常ｐＨ５〜９の範囲
に散在している。

例えば、グリコースオキシダーゼの至適ｐＨは５．６、
ウリカーゼの場合は８．５、コレステロールオキシダー
ゼは６．５〜８．０である。

ところが前記の色素形成物質、特にモノアミン類、ジア
ミン類は酵素活性の至適ｐＨでは、水に対する溶解性が
極めて低い。

このためにこれら色素形成物質溶液の調製には、従来は
界面活性剤を添加して分散させたり、有機溶媒を加えて
これら物質の析出を防ぐ等の工夫が成されている。

しかしながらこのような方法によっても、なおその水溶
液濃度は経時的に変化するために測定精度の信頼性が低
く、また界面活性剤や有機溶媒の添加が酵素反応に悪影
響を及ぼすのではないかという懸念もある。

そこでこの精度を向上させるために、色素形成物質の水
溶液を用時に調製するという手段を講ずればよいが、逆
に操作の簡易性及び経済性が悪くなるという別の面で新
たな問題が生じる。

また上記のモノアミン類、ジアミン類等は常温Ｋ於いて
粘稠な液体であり、フェノールやクレゾール類も融点が
１０〜４０℃付近にあるために室温で凝固することもあ
る。

ゆえにこれらの化合物の一定量を正しく秤り取ることは
非常に難かしく、試薬溶液の調製に簡便さを欠くことに
なる。

本発明者らは、これらの欠点に鑑み、４−アミノアンチ
ピリンや３−メチルベンゾチアゾリノンヒドラゾン等の
発色剤と酸化縮合し安定な測定値を与え、かつ試薬溶液
が簡便に調製できる色素形成物質を見出すべく種々研究
を重ねた結果前記一般式（Ｉ）で示される化合物が極め
て優れていることを見出した。

すなわちこれらの化合物は幅広いｐＨに於いて高い水溶
性を示し、常温において固体であるため試薬溶液の調製
が非常に簡便であり、しかもこの水溶液を４−アミノア
ンチピリンとパーオキシダーゼによる酸化縮合を行なっ
たところ、下記の（Ｉ）式で示されるインドフェノール
型色素を生成して極めて高感度に発色と長時間優れた呈
色安定性を維持することを見い出した。

即ち、本発明化合物（Ｉ）は４−アミノアンチピリンと
高い反応性を示す色素形成性物質であり、しかも格段の
水に対する溶解性とその溶液の安定性を持ち、加うるに
４−アミノアンチピリンと酸化縮合して生成される色素
は優れた呈色安定性を与えるという数々の優れた性質を
有するため、応用範囲のすこぶる広い新規かつ有用な化
合物である。

一般式（１）で示される本発明の化合物は、例えば一般
式（Ｉ） （式中Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４は前出二般式（Ｉ）と同じ意味
を有する。

）で示されるアニリン誘導体に、２−クロルー１−ヒド
ロキシエタンスルホン酸ナトリウム、３−クロルー２−
ヒドロキシプロパンスルホン酸ナトリウムなどを作用さ
せ、窒素原子と結合している水素を置換することによっ
て製造することができる。

ところで、Ｎ−ヒドロキシスルホアルキルアニリン誘導
体のうち炭素数５以上のＮ−ヒドロキシスルホアニリン
誘導体については、本発明の化合物（炭素数１〜４）と
比べると色素形成物質としての特異性にとぼしく、かつ
製造する場合の経済性からみても不利である。

この見地から、色素形成性物質としては、本発明の化合
物、即ち炭素数が１〜４のＮ−ヒドロキシスルホアルキ
ルアニリン誘導体が最も適している。

さて一般式（Ｉ）で示される本発明化合物の具体例とそ
の融点及びｐＨ６．５に於げる４−アミノアンチピリン
との酸化縮合色素の吸収極大波長λｍａＸ（ｎｒ）を表
１に示す。

表中の吸収極太波長は測定ｐＨ値での極太波長であって
、吸収が最大となる最適ｐＨ値を示すものではない。

むろん本発明の化合物は表１に示したものに限られず、
アニリンの窒素に結合した水素が炭素数１〜４のヒドロ
キシスルホアルキル基で置換されたＮ−ヒドロギシスル
ホアルキルアニリンの誘導体を全て包含する。

これらはいずれも優れた水可溶性および溶液の安定性を
示す。

ところで、従来より使用されているフェノールでは、４
−アミノアンチピリンとの縮合生成物のもつ極太吸収波
長が５００ｎｍに、Ｎ−Ｎ−ジエチルアニリンでは５２
０ｎｍにあるが、体液中のビリルビンや溶血の吸収が紫
外域から５００ｎｍ付近と広範囲にあるため、測定値に
正の誤差を生じるおそれがある。

よってこれらの影響を避けるためには、極太吸収波長が
５００ｎｍ以上にあることが必要である。

ところで本発明の一般式（Ｉ）で示されるＮ−ヒドロキ
シスルホアルキルアニリン誘導体は、４−アミノアンチ
ピリンとの縮合生成物のもつ極太吸収波長が、殆んど５
３０ｎｍ以上にあるために、ビリルビンや溶血の影響を
避けることができる。

特に一般式（Ｉ）で示されるＮ−ヒドロキシスルホアル
キルアニリン誘導体のうち、ベンゼン環の３位及び５位
が低級アルキル基またはアルコキシ基で置換されたもの
は、極大吸収波長が６００ｎｍ付近にあり、〔例えば、
Ｎ一（２一ヒドロキシ−３−スルホプ口ピル）−３・５
一ジメチルアニリンナトリウム塩では６３０ｎｒ、Ｎ−
メチルーＮ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプ口ピル）
−３・５−ジメトキシアニリンナトリウム塩では５８７
ｎｍ）臨床検査に於いて有用である。

また、本発明の一般式（Ｉ）で示される化合物は、全て
常温において固体であるので加工された固型物、例えば
錠剤、凍結乾燥品等として他の必要成分とともに使用に
供することができる。

表２に、一般式（Ｉ）で示される化合物のうち代表的な
ものについての各ｐＨに於ける呈色安定性を示す。

表中、呈色安定性の数値は、試料と試薬溶液を混合し、
室温に５分間放置後の吸光度を１００％として、これに
対する６０分後の吸光度の比率（％）を示したものであ
る。

吸光度の測定方法と測定に用いた試料及び発色試薬溶液
の組成及び調整方法は下記のとおりである。

〔測定方法〕試料２０μｌに対して試薬溶液３ｍｌの割
合で混合し各々の極太吸収波長（λｍａＸ）に於ける吸
光度を測定した。

〔試料〕過酸化水素溶液 Ｈ２０２；２ｍｍｏｌ／ｌ〔
試薬溶液〕パーオキシダーゼ２００単位、４−アミノア
ンチピリン０．１ｍＭ，色素形成物質０．５ｒＭを各ｐ
Ｈの緩衝液１００ｍｌに溶解し、試薬溶液とする。

表２には本発明の化合物のうち代表的なものと従来使用
されてきた化合物とについての結果を示してあるが、本
発明化合物は広いｐＨ範囲に於いて呈色安定性が優れて
いる。

また、各ｐＨの緩衝液に溶解する際、フェノール及びジ
メチルアニリンは、メタノールに溶解してから緩衝液を
加えるが、本発明の化合物は、界面活性剤や有機溶媒を
加える必要がなく、試薬溶液調整が簡便である。

表２には、本発明の色素形成物質のうち、代表的なもの
についてのみの結果を示すが、本発明の色素形成物質、
即ちこれ以外の、Ｎ−ヒドロキシスルホアルキルアニリ
ン誘導体（Ｉ）についても、殆んど同様の結果が得られ
ることはいうまでもない。

本発明の定量用組成物及び定量方法を実施するに際して
は、本発明の色素形成物質（Ｉ）に、（イ）過酸化作用
のある物質及び（口）発色剤を配合したものを使用する
。

前者、すなわち（イ）の例としては、パーオキシダーゼ
のほか遷移金属、例えば鉄イオンのようなものがあり、
後者すなわち（口）の例としては、４−アミノアンチピ
リンや３−メチルベンゾチアゾリノンヒドラゾンが挙げ
られる。

ただしこれらは単なる例示であって本発明がこれによっ
て限定されるものではない。

次に、実施例をあげてさらに具体的に本発明を説明する
が、本発明はその要旨を越えない限り以下の実施例に制
約されるものではない。

尚、実施例１〜３は本発明化合物の製造法の例示であり
、実施例４〜５は本発明化合物を用いたところの過酸化
物質定量方法の例示である。

実施例 １ （化合物Ｅの製法） ３−クロロ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸ナトリ
ウム９．８９（０．０５モル）を純水１００ｍｌに溶解
しこれにイソープロピルアルコール５０ｍｌを加える。

次いで、Ｎ一エチル−３−メチルアニリン６．８ｒ（０
．０５モル）を加え、当量のＮａＯＨ水溶液を滴下しな
がら徐々に加温しＮａＯＨ水溶液滴下終了後３時間加熱
還流を行なう。

冷後一旦溶液を濃縮乾固し、純水５ｏｒｌをこれに加え
て溶解し、エーテルで未反応のＮ一エチル−３−メチル
アニリンを抽出除去する。

水層を濃縮し、冷却後生じた結晶を戸取し、水より再結
晶して、Ｎ一エチルーＮ一（２−ヒドロキシ−３−スル
ホプ口ピル）−３−メチルアニリンナトリウム塩の白色
結晶１０．３８？を得る。

収率７０．３％。元素分析値（％） Ｃ１２Ｈ１８ＮＳ
０４Ｎａ Ｃ Ｈ Ｎ
理論値 ４８．８０ ６，１４ ４．７４実測値
４８，４２ ６．２０ ４．７３ＩＲ吸収特性（Ｎ
ｕｊｏｌ ｎｕｌｌＣｎ−１）ν一ＣＮ：（１２８０）
、ν−ＳＯ３−（１０７０）、ν一芳香環（１６００） 実施例 ２ （化合物Ｂの製造） ３−クロロ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸ナトリ
ウム９．８ｆ（０．０５モル）を純水１００ｍｌに溶解
し、これにイソープ口ピルアルコール５０ｍｌを加える
。

次いでＮ一エチルーアニリン６．４！（０．０５−Ｅ）
を加え当量のＮａＯＨ水溶液を滴下しながら徐々に加温
し、ＮａＯＨ水溶液、滴下終了後、３時間加熱還流を行
なう。

冷後、一旦、溶液を濃縮乾固し、純水５０ｍｌをこれに
加えて溶解し、エーテルで未反応のＮ一エチルアニリン
を抽出除去する。

水層を濃縮し、冷却後、生じた結晶をｒ取し、水より再
結晶してＮ−エチルーＮ−（２−ヒドロキシ−３−スル
ホプロビル）アニリンナトリウム塩の白色結晶８．２１
ｇを得る。

収率５８．４％元素分析値（％） Ｃ１１Ｈ１６ＮＳＯ
４Ｎａ Ｃ Ｈ Ｎ理論
値 ４６，９７ ５．７３ ４．９８実測値 ４６
，６２ ５．９５ ４．６７ＩＲ吸収特性（Ｎｕｊ
ｏｌ ｎｕｌｌＣｒ−１）ν一ＣＨて（１２８０）、ν
−ＳＯａ（１０７０）、ν一芳香環（１６００） 実施例 ３ （化合物■の製造） ３−クロロ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸ナトリ
ウム９．８Ｓ（０．０５モル）を純水１００ｍｌに溶解
し、これにイソープロピルアルコール５０ｍｌを加える
。

次いでＮ一エチル−３−メトキシアニリン７．６Ｐ（０
．０５モル）を加え、当量のＮａＯＨ水溶液を滴下しな
がら徐々に加温し、ＮａＯＨ水溶液滴下終了後２時間加
熱還流を行なう。

冷後、一旦溶液を濃縮乾固し、純水５０ｍｌをこれに加
えて溶解しエーテルで未反応のＮ一エチル−３−メトギ
シアニリンを抽出除去する。

水層を濃縮し、冷却後生じた結晶をＰ取し、メタノール
より再結晶して、Ｎ一エチルーＮ−（２−ヒドロキシ−
３−スルホプ口ピル）−３−メトキシアニリンナトリウ
ム塩の白色結晶５．Ｏｆを得る。

収率３２．１％ 元素分析値（％） Ｃ１２Ｈ１８ＮＳＯ４Ｎａ
Ｃ Ｈ Ｎ埋論値 ４６，２９
５，８３ ４．５０実測値 ４６，０８ ６．１
９ ４．２８ＩＲ吸収特性（Ｎｕｊｏｌ ｎｕｌｌＣ
ｒ−１）ν一ＣＨて（１２８０）、ν−Ｓｏ３−（１０
７０）、ν一芳香環（１６００） 実施例 ４ ０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．６）１００ｎｌに、グル
コースオキシダーゼ４００単位、パーオキシダーゼ２０
０単位、４−アミノアンチピリン３０ｍ９、Ｎ一エチル
ーＮ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプ口ピル）アニリ
ンナトリウム塩１００ｍｇを溶かし、発色試液とする。

試験管に血清２０μｌをとり、上記発色試験試液３．Ｏ
ｎｌを加えて３７℃で反応させた後、試薬盲検を対照に
５６５ｎｒの吸光度を測定し、予め作成した検量線と対
比して血清中のグルコース濃度を算出する。

標準液：グルコース２００ｍｇ／ｄｌ 実施例 ５ 酢酸０．３ｇ、４−アミノアンテピリン４０ｍｇ、硫酸
第一鉄アンモニウム５ｍｇ、Ｎ一エチルーＮ−（２−ヒ
ドロキシー３−スルホプロビル）−３−メチルアニリン
ナトリウム塩１００ｍｇを水１００ｍｌに溶かし、発色
試液とする。

血清２００μｌにイングロビルアルコール４，０ｍｌを
加えミキサーで５秒間隔で２回攪拌した後２０００ｒｐ
ｍでｌＯ分間遠心分離し、試験管に上澄液３．０ｍｌを
とり試薬溶液１，０ｍｌを加え、３７Ｃで反応させた後
試薬盲検を対照に５５５ｎｍの吸光度を測定し予め作成
した検量線によって血清中の過酸化脂質濃度を算出する
。

標準液：ｔ−プチルヒドロパーオキサイド１２μｇ／ｒ
ｌ０

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 一般式 （式中Ｒ１は水素原子、低級アルキル基及び炭素数１〜
   ４のヒドロキシスルホアルキル基よりなる群から選択さ
   れた置換基を表わし、Ｒ２は炭素数１〜４のヒドロキシ
   スルホアルキル基を表わし、Ｒ３は水素原子、低級アル
   コキシ基、水酸基及び低級アルキル基よりなる群から選
   択された置換基を表わし、Ｒ４は水素原子、低級アルコ
   キシ基及び低級アルキル基よりなる群から選択された置
   換基茶表純す）で示されるＮ−ヒドロキシスルホアルキ
   ルアニリン誘導体及びその塩類。 ２ 一般式 で示されるＮ−ヒドロキシスルホアルキルアニリン誘導
   体又はその塩（但し、式中Ｒ１は水素原子、低級アルキ
   ル基及び炭素数１〜４のヒドロキシスルホアルキル基よ
   りなる群から選択された置換基、Ｒ２は炭素数１〜４の
   ヒドロキシスルホアルキル基、Ｒ３は水素原子、低級ア
   ルコキシ基、水酸基及び低級アルキル基よりなる群から
   選択された置換基、Ｒ４は水素原子、低級アルコキシ基
   及び低級アルキル基よりなる群から選択された置換基）
   を色素形成物質として有する過酸化物質定量用組成物。