JPS63246356A - 新規な尿素誘導体及びこれを発色成分として用いる測定法 - Google Patents

新規な尿素誘導体及びこれを発色成分として用いる測定法

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JPS63246356A
JPS63246356A JP62144838A JP14483887A JPS63246356A JP S63246356 A JPS63246356 A JP S63246356A JP 62144838 A JP62144838 A JP 62144838A JP 14483887 A JP14483887 A JP 14483887A JP S63246356 A JPS63246356 A JP S63246356A
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橋爪　利至
Tsutomu Iwata
勉 岩田
Toyoji Mukai
向井　豊治
Masaaki Kida
正章 木田
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の利用分野ｊ 本発明は、新規な尿素誘導体、及び該化合物を発色成分
として用いる酸化性物質の定量方法並びにペルオキシダ
ーゼ様物質の定量方法に関する。
「発明の背景」 生体成分、例えば血液や尿などの体液成分を測定するこ
とは、その変動が疾病と大きく関連しているため、疾患
の診断、′病態の解明、治療経過の判定を行なう上で、
必須なものとなっている。
例えば、血液中のコレステロール、トリグリセライド、
グルコース、尿酸、リン脂質、胆汁酸、モノアミンオキ
シダーゼなどを始め、非常に多種類の微量成分の測定法
が開発されており、疾病の診断上役立っていることは周
知の通りである。
現在、血清成分の測定法としては、それが酵素以外のも
のである場合には、１」的成分に特異的に作用する酵素
を用い、また、［Ｉ的成分が酵素の場合には、その基質
となるべき化合物を用いて、夫々酵素反応を行ない、こ
れによる生成物を測定して目的成分量を求める、所謂“
酵素法”が一般に広く普及している。なかでも、Ｉ＋　
２０２生成酵素、例えば、オキシダーゼを働かせて目的
成分に相当する１１□０２を生成させ、これをペルオキ
シダーゼ、及び発色成分である被酸化性呈色試薬を用い
て発色系に導き、その呈色を比色定量することにより目
的成分量を求める方法が、被酸化性呈色試薬の開発と相
まって増加しつつある。例えば、コレステロール−コレ
ステロールオキシダーゼ、トリグリセライドーリボプロ
テインリパニゼーグリセロールオキシダーゼ、尿酸−ウ
リカーゼなどの組合せで発生する１１．０２を、ペルオ
キシダーゼ（ＰＯＤ）、被酸化性呈色試薬を用いて発色
系に導き、その呈色の吸光度を測定することにより１．
１的成分量を求める方法である。この方法に於て用いら
れる発色成分である被酸化性呈色試薬の代表的なものと
しては、４−アミノアンチピリンと、フェノール系化合
物又は、Ｎ、Ｎ−ジ置換アニリン系化合物とを組合せた
被酸化性呈色試薬、３−メチルベンゾチアゾリノンヒド
ラゾン（ＭＢＴ）ｌ）とアニリン系化合物との組合せ試
薬、２．２′−アミノビス（３−エチルベンゾチアゾリ
ン−６−スルホン酸）（ＡＩＩＴＳ）、トリフェニルメ
タン系ロイコ色素、ベンジジン誘導体、〇−トリジン誘
導体、トリアリルイミダゾール誘導体、０−フ二二レン
ジアミン等が挙げられる。しかしながら、これら従来か
ら用いられている被酸化性呈色試薬は、大部分がその呈
色波長が６００　ｎｍ以下であり、ビリルビン、ヘモグ
ロビン等の血清成分の影響を受は易く（尿中成分測定時
には尿中の色素体の影響を受は易い）、また、４−アミ
ノアンチピリンとの組合せ試薬やトリフェニルメタン系
ロイコ色素の一部を除いて、゛いずれも色原体の安定性
が低い等の問題点を有する。
一方、比較的色原体の安定性が良く、またＬｉｄ色波長
が比較的長波長側にある色原体として染料ｉｉｆ駆体（
ロイコ色素）のジフェニルアミン誘導体が開示されてい
る（特開昭５６−１４５３５２号公報、特開昭５９−１
８２３６１号公報、特公昭６０−３：１４７９号公ｆ６
ｌ等）。
こわらのジフェニルアミン誘導体は、いずれもその呈色
波長が７０Ｏｎ＋ｎ以上と比較的長波長側にあり感度も
比較的高いが、色原体の安定性、呈色安定性共に未だ充
分満足のいくものであるとは云えず、また、いずれも水
に対する溶解性が悪いという欠点をも有する。
この欠点を補う為、一般的には界面活性剤や有機溶剤を
溶解補助剤として用いてこれらの色原体を可溶化し、発
色試液の調製を行っている。しかしながら、このような
方法は、例えばグリセロリン酸オキシダーゼ、リボプロ
ティンリパーゼ、コレステロールオキシダーゼ、コレス
テロールエステラーゼ、ホスホリパーゼＤ等のような、
界面活性剤により比較的失活しやすく、使用可能な界面
活性剤の種類や濃度に制限のある酵素が測定系に存在す
る場合には、ルだ問題があり、決して好ましい方法であ
るとは言えない。一方、これら既存のジフェニルアミン
誘４体を色原体として組込んだ発色試液を所謂臨床検査
試薬として商品化しようとした場合には、これらは水溶
液中では長期間にわたる安定性を有しない為、所謂凍結
乾燥品中にこれを含有させる必要があるが、凍結乾燥品
の原液中には通常使用濃度の１０〜１００倍量の色原体
を溶解させなければならないので、原液調製時に特殊な
技術を必要とするなど実用上用だ問題が多い。
「発明の目的」 本発明の目的は、呈色時に極大吸収波長が６５０ｎｍ以
上から近赤外域に至る長波長側にあり、高感度で、色原
体の安定性、呈色安定性共に優れ。
しかも水溶性の極めて高い尿素誘導体の開発と、該化合
物を用いる酸化性物質及びペルオキシダーゼ様物質の精
度の高い測定法を提供することにある。
「発明の構成」 本発明は、一般式［！］ （式中、Ｒ１，Ｒ２は夫々独立して４−ジ置換アミノア
リール基を示し、Ｒ１とＲ２のアリール基は、酸素又は
硫黄原子を介して互いに結合していてもよく、Ｒ３はカ
ルボキシアルキル基、アルコキシカルボニル基、アルキ
ルカルボニル基、アリールスルホニル基、スルホアリー
ル基又はカルボキシアリ−ル基を示す。） で示される尿素誘導体、及び該化合物を発色成分として
用いる酸化性物質の定量方法、並びに該化合物を発色成
分として用いるペルオキシダーゼ様物質の定量法である
。
本発明者らは、高感度発色試薬として有用なジフェニル
アミン誘導体が有する０「記した如き問題点を解決すべ
く鋭意研究の途上、色原体の安定性、呈色安定性に優れ
、且つ、界面活性剤や有機溶剤等の溶解補助剤を用いる
ことなしに水又は緩衝液に容易に溶解し得る前記［Ｉ］
式で示さｉる尿素誘導体を新たに見出し、本発明を完成
させるに到フた。
一般式［Ｉ３で示される本発明の尿素誘導体にルポキシ
アルキル基、ヒドロキシアルキル」＾、アルコキシアル
キル基〔これらアルキル基、置換アルキル基のアルキル
基としては、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、
ブチル基、アミル基、ヘキシル基環炭素数１〜６の低級
アルキル基（直鎖状、分枝状のいずれにても可。）が挙
げられ、アルコキシアルキル基のアルコキシ基としては
、例えばメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ブト
キシ基、アミルオキシ基、ヘキシルオキシ基環炭素数１
〜６の低級アルコキシ基（直鎖状、分枝状のいずれにて
も可。）が挙げられる。また、カルボキシアルキル基は
カルボキシル基の部分が、ナトリウム、カリウム、リチ
ウム等のアルカリ金属塩、又はアンモニウム塩等の塩の
形になフていてもよい。〕等が挙げられ、Ｒ４とＰ、１
（６と１１７は夫々同じであっても異なっていてもよい
。またＲ４とＲ５又は／及びＲ６とＩｔ’か互いに結合
して、１１’、　Ｒ５及びＮとで又は／及び［６，［７
及びＮとで、例えばピペリジン環の如き環を形成してい
てもよい。４−ジ置換アミノアリール基のアリール基と
してはフェニルＪ、ζ、置換フェニル基（例えばトリル
基、メトキシフェニル基等）、ナフチル基、置換ナフチ
ル基（例えばメチルナフチル基、メト・キシナフチル基
等）等が挙げられる。１１’と１（２のアリール基は、
また、酸素又は硫黄原子を介して、例えば の如く互いに結合していてもよい。また、Ｐで示される
、カルボキシアルキル基、アルキルカルボニル基のアル
キル基としては、例えばメチル基、エチル基、プロピル
基、ブチル基、アミル基、ヘキシルＪ、ｔ（等炭素数１
〜６のアルキルＪ、ｌ；（直鎖状５分枝状のいずれにて
も可。）が挙げられ、アルコキシカルボニル基のアルコ
キシ基としては、例えばメトキシ基、エトキシ基、プロ
ポキシ基、ブトキシ基、アミルオキシ基、ヘキシルオキ
シ基環炭素数１〜６のアルコキシ基（直３ｎ状、分枝状
のいずわにても可。）が挙げられる。アリールスルボニ
ル基、スルホアリール基、カルボキシアリール基のアリ
ール基としては、例えばフェニル基、置換フェニル基（
例えばトリルチ歩基、メトキシフェニル基等）、ナフチ
ル基、置換ナフチル基（例えばメチルナフチル基、メト
キシナフチル基等）等が例示される。１（３としては、
これらカルボキシアルキル基、アルコキシカルボニル基
、アルキルカルボニル基、アリールスルホニル基、スル
ホアリール基、カルボキシアリール」＾等が通常好まし
く用いられるが、これらに限定されるものではなく、一
般に知られている親水性を有する官能基や極性の高い構
造を有する官能基を導入するＥとも勿論可能である６ 一般式［Ｉ１で示される本発明化合物は、例えば、下記
の如くして容易に合成し得る。
即ち、例えば−・般式［Ｉ１］ （但し、Ｒ１，［２は前記と同じ。） で示されるジアリールアミン誘導体と、通常これと等モ
ルの一般式［ＩＩ［］ ０＝　Ｃ＝Ｎ−１毫８　　　　　［■］（但し、Ｐはカ
ルボキシアルキル基、アルコキシカルボニル基、アルキ
ルカルボニル基、アリールスルホニル基、スルホアリー
ル基、カルボキシアリール基又はアルコキシカルボニル
アルキル基を示す。） で示されるイソシアネート誘導体とを適当な有機溶媒（
例えばクロロホルム、ｎ−ヘキサン、酢酸エチル、ジメ
チルホルムアミド等）中、室温乃至要すれば加温下に数
時間乃至数十時間反応させる。反応後は、例えばカラム
クロマトグラフィー等により生成物をｊｌｉ離、精製す
るなど自体公知の方法に従って後処理を行なうことによ
り、また、必要に応じてこれを川にアルカリ処理し、然
る後、常法に従って後処理を行なうことにより目的とす
る本発明の尿素誘導体が得られる。
本発明の尿素誘導体の製造に用いられる一般式［■］で
示されるジアリールアミン誘導体は、古くから知られて
いるインダミンの製法〔例えば、Ｃｈｅｍ、　Ｂｅｒ、
、　１６．４６４　（１８８３）等〕に準じて、例えば
アニリン誘導体とフェニレンジアミン話導体とを過ヨウ
素酸等で酸化縮合して色素を合成した後、これを還元す
ることにより容易に１：Ｐられるから、このようにして
ｆＪられたものを用いることで足りる。また、本発明の
尿素誘導体の製造に用いられる、一般式［Ｉ１１］で示
されるインシアネート誘導体も、公知文献（例えば、大
有機化学、第５巻、４５２−４５３頁、朝倉書店、昭和
４２年第６版等）に記載のイソシアネートの製法に準じ
て容易に合成し得るので、このようにして得られたもの
を用いることで足りる。
本発明化合物は、水成≠は界面活性剤の溶存する水溶液
中で極めて安定で、所謂ブランク値が低い。一方、これ
を酸化剤、例えばペルオキシダーゼの存在下過酸化水素
により酸化すると、６５０ｎｍから近赤外領域に極大吸
収を有する呈色安定性に優れた色素を定Ｊｌ的に形成す
る。また、本発明化合物は親水性官能基又は極性の高い
構造を有しているので、水成≠は界面活性剤の溶存する
水溶液に対する溶解性が非常に良好なため、発色試液等
の調製に於て極めて有利であり、好ましい。
表１（１）及び（２）に、本発明化合物の具体例１４例
について、そのロイコ体溶液の安定性、呈色後の安定性
、極大吸収波長（λ□Ｘ）、感度（ε）及び水に対する
溶解性を示すか１本発明化合物はこれら具体例に限定さ
れるものではない。
表１（１）及び（２）中のロイコ体溶液の安定性とＶ色
溶液の安定性に於て、Ａは安定、Ｂはやや不安定を意味
する。水に対する溶解性に於ては、◎は極めて易溶、Ｏ
は可溶、Ｘは難溶であることを意味する。
以下余白 本発明の尿素誘導体は、酸化性物質の定量やペルオキシ
ダーゼ様物質の定量に於ける発色成分として有効に用い
得るが、とりわけ酵素反応により生成した過酸化水素を
ペルオキシダーゼの存在ド発色系に導き、その呈色を比
色定量することにより行なう生体試料中の微量成分の定
量に於ける発色成分として特に有効に使用し得る。
即ち、本発明の酸化性物質の定量法は、基質、又は酵素
反応により生成した物質に酸化酵素を作用させ、生成す
る過酸化水素を定量することにより行なう生体試料中の
基質又は酵素活性の定ｈｌ法として特に効果的に使用し
得る。
本発明の方法により測定可能な生体試料中の微量成分と
しては、例えば、コレステロール、グルコース、グリセ
リン、トリグリセライド、遊離脂肪酸、尿酸、リン脂質
、胆汁酸、モノアミンオキシダーセ、グアナーゼ、コリ
ンエステラーゼ等が挙げられるが、これらに限定される
ものではなく、酵素反応により生成する過酸化水素を定
量することによって測定が可能な生体成分は全て定量可
能である。
本発明の測定法は、発色剤（被酸化性呈色試薬）として
本発明の尿素誘導体を用いる以外は自体公知の酵素法（
１１２０２生成酵素を用いる）による測定法に準じてこ
れを行なえば足りる。
使用される発色剤の濃度は、特に限定されないが、通常
数μｍａｎ／１以上、好ましくは５０　μｍＯ！Ｑ７１
〜１００μｍａｆＬ／ｌの濃度が用いられる。
本発明の方法による生体成分の定量に於て、過酸化水素
を生成させる酵素として用いられる酸化酵素（オキシダ
ーゼ）及びその他の目的で用いら。
れる酵素類並びに酵素反応に関与する」＾質及びその他
の物質の種類及び使用Ｊｉｔは被酸化性呈色試薬を用い
る自体公知の生体成分の定量法に準じて夫々測定対象と
なる物質に応じて適宜選択すればよい。又、本発明によ
る過酸化水素の定量に於て用いられるペルオキシダーゼ
としては、その起源、由来に特に限定はなく、植物、動
物、微生物起源のペルオキシダーゼ又はペルオキシダー
ゼ様物質が、一種若しくは要すれば二種以上組合せて用
いられる。又、その使用噛は目的に応じて適宜定められ
、特に限定されない。
本発明の方法による生体成分の定量は、通常、。
ｐ１１４．０〜１０．０、より好ましくはｐＨ６、ｏ〜
８．０で実施される。用いられる緩衝剤としては、リン
酸塩、クエン酸塩、ホウ酸塩、炭酸塩、トリス緩衝液、
グツド（Ｇｏａｄ’ｓ）緩衝液などが挙げられるが、特
にこれらに限定されない。
本発明の尿、Ａ話導体は、過酸化水素等酸化性物質の定
量に有効に用い得るが、又、これと過酸化水素とを組み
合せることによりペルオキシダーゼ様物質の定量を行な
うことも可能である。ペルオキシダーゼ様物質としては
、ペルオキシダーゼそのものの他、ヘモグロビンその他
のヘム化合物が挙げられる。
即ち、本発明の尿素話導体は、例えば、ペルオキシダー
ゼを標識化合物に用いた酵素免疫測定法にも応用可能で
あり、又、血清中のヘモグロビンを過酸化水素若しくは
過硼素酸ナトリウムのような酸化性物質を用いて測定す
る場合などにも有効に使用し得る。
以下に実りｂ例を挙げるが、本発明はこれら実施例によ
り何隻制約を受けるものではない。
「実ｈｈ例」 実施例　１．Ｎ、Ｎ−ビス（４−ジメチルアミノフェニ
ル）−Ｎ−カルボキシメチル尿素。
Ｎａ塩〔本発明化合物（ｌ）〕の合成 ビンドシェドラーグリーン、ロイコ体 （Ｂｉｎｄｓｈｅｄｌｅｒ’ｓ　Ｇｒｅｅｎ、　Ｌｅｕ
ｃｏ　Ｂａ５ｅ；同位化学研究所製、以下ＢＧと略記す
る。）２．５ｇをクロロホルム１００ｒｎ！に溶解し、
イソシアネート酢酸エチル（関東化学■製）１．３ｇを
徐々に加え２０℃で２０時間反応させた。反応混合物を
、１００〜２００メツシユのシリカゲルを充填したカラ
ム（溶媒：クロロホルム）に流し、クロロホルムとメタ
ノールの混合溶媒で溶出し、目的画分を得た。次に、こ
れからクロロホルム、メタノールを留去した後、メタノ
ール３００ｒｒＬｌとｌ　ＮＮａｏｌｌｌｏｍＺとを加
え、更に２０℃で１０時間反応させた後、濃縮、凍結乾
燥し無色結晶２．１ｇを（ｉｔた。
ＴＬＣ（シリカゲル、クロロホルム：メタノール＝９：
　１）　　：Ｒｆ−０，４゜ Ｎ　Ｍ　Ｒ（（：ＤＣ１Ｉ３）　（エチルエステル体）
：δｐｐ＋ｎ×２）、４．１１５　（ＩＩＩ、　ｔ、−
Ｎｌｌ−）、６．６５〜７．４５　（８１１，ＩＩＩ。
ａｒｏｍａ　Ｌｉｃ　　Ｈ）。
ＮＭＲ（（：Ｄα３）（フリ一体ン；δｐｐｍ　：１．
１５　　（１２１１゜（１１１，ｓ、−Ｎｌｌ−）、６
．６５〜７．４８（８１１，ｎ＋、ａｒｏｍａｔｉｃ　
ＩＩ）。
Ｍ　Ｓ　：　Ｍ”−３７８゜ ■］（ニジＮ１１＝　３４００ｃＩＩ＋−’　、νｃｎ
＝　２９３０ｃｍ−’、シｃｍｏ−１６５０ｃｍ−’　
、シｃ−ｏ　＝　１１００ｃｍ−’。
実ｈｈ例　２．Ｎ、Ｎ−ビス（４−ジメチルアミノフェ
ニル）　−Ｎ’−（４−スルホフェニル）尿素、　Ｎａ
塩〔本発明化合物（２）〕の合成 りＧ　０．５ｇと４−スルホフェニルイソシアネート。
Ｎａ塩（アルドリッチ社５Ｊ）２．５５ｇをジメチルス
ルホキシド（ＤＭＳＯ）　　１００ｒｎ！に溶解し、８
０℃で２０時間反応させた。反応混合物を、１００〜２
００メツシユのシリカゲルを充填したカラム（溶媒：ク
ロロホルム）に流し、クロロホルムとメタノールの混合
溶媒で溶出し、目的画分を濃縮乾固して無色結晶１５０
りを得た。
ＴＬＣ（シリカゲル、メタノール）：Ｒｒ−０，１゜２
）、６．２１〜７．４０（１２１１，ｖａ、　ａｒｏｍ
ａＬｉｃ　Ｉｔ）、４．７５（ｉｌｌ。
ｓ、　−Ｎｌｌ−）。
ＭＳ：Ｍ“−４５４゜ Ｉｌｌ：　ｖ、４＋１＝３４００ＣＩ−’　、１／ｃＨ
＝２９：１０１ｊ１１−’、　ｕ（２ｍ６−１６５０ｃ
ｍ−’　、νｓｏ　　＝　１２００ｃｍ−’。
実施例　３．Ｎ−（４−ジメチルアミノ−２−メチルフ
ェニル）　−Ｎ−（４°−ジエチルアミノ−２−メチル
フェニル）　−Ｎ’−（４−メチルフェニルスルホニル
）尿素 〔本発明化合物（７）〕の合成 Ｎ、Ｎ−ジエチルトリレンジアミン１塩酸塩２．１ｇと
Ｎ、Ｎ−ジメチル−ｍ−トルイジン２．４ｇをメタノー
ル１００ｍ１に溶解し、過沃素酸３ｇを加えて室６′□
１で１時間反応させた。これに史に亜鉛末６ｇと６Ｎ塩
酸５ｒｎ！を没入して反応させ、反応後クロロポルムで
抽出した。油層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、
これにｐ−トルエンスルホニルイソシア卆−ト（和光紬
薬工業■製）９ｇを加えて、室温で２時間反応させた。
反応混合物を、１００〜２００メツシユのシリカゲルを
充填したカラム（溶媒：クロロホルム、ヘキサン）に流
し、クロロホルムとヘキサンの混合溶媒で溶出し、目的
画分を濃縮乾固して無色結晶５０りをて：＃た。
ＴＬＣ（シリカゲル、クロロホルム：ヘキサン＝　ｌ　
：　ｌ　）　：　Ｒｆ　−０，５５゜Ｍ　Ｓ　：　Ｍ”
−５０８゜ ｒＲ（ＫＢｒ）：　　νｓＨ＝　３２４０ｃｍ−’、　
　シｃ−ｏ　　＝　１６９５ｃｍ−’、　　υ５　ｓｏ
２−１３５０ｃｍ−’　　、　　νａｌ　ｓｏ、−１１
６５ｃｕ＋−’。
実施例　４．１０−（カルボキシメチルアミノカルボニ
ル）　４．７−ビス（ジメチルアミ ノ）フェノチアジン、　Ｎａ３怠（本発明化合物（９）
）の合成 メチレンブルー（和光紬薬工業■製）３．０ｇを蒸留水
３００ｒｒＩｌに溶解し、亜３１１粉末３ｇとＩＮ塩酸
ｌＯ−を用いて還元した。【拒鉛を除去した後、酢酸エ
チルで塩基性下で抽出し、油層を硫酸マグネシウムに通
して脱水した。直ちにインシアネート酢酸エチル（関東
化学■製）２．７ｇを加えて、室温で２０時間反応させ
た。反応液を濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフ
ィ（シリカゲル＝１００〜２００メツシュ、溶出溶媒：
クロロホルム）で鯖製し目的画分を得た。この両分から
クロロホルムを留去し、メタノール５００ｒｒＬｌと　
ＩＮ　Ｎａ０１１１０ｒｒＬｌを加えて２０℃で１０時
間反応させ、その後濃縮、凍結乾燥して無色結晶９８０
町を得た。
ＴＬＣ（シリカゲル、クロロホルム：メタノール＝９　
：　１）　：Ｒｆ　−０，５゜×２）、３．７４°（２
１１，ｓ、−Ｃ１ｌ□−）、４．７５　（１１１，ｓ、
−Ｎｉｌ−）、６．７２〜７．５５（ａｌｌ、ｍ、　　
ａｒｏｍａｔｉｃ　　ＩＩ）。
ＭＳ：Ｍ“−４０８゜ Ｉｌｌ：　υ、、、、＝：１４００ｃｍ−’　、シ、、
、＝２９］Ｏｃｍ−’、　ｖ、。−１６５０ｃｍ−’　
、υ０−０＝　１１００ｃｍ−’。
実施例　５１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル
）−２，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノキサジン、
　Ｎａ塩〔本発明化合物（１０）　）の合成 カブリブルー（東京化成■製）２．７ｇを蒸留水３００
ｒｒＬ！に溶解し、亜鉛粉末３ｇと１Ｎ塩酸１０ｉを用
いて還元した。亜鉛を除去した後、酢酸エチルで塩基性
下で抽出し、油層を硫酸マグネシウムに通して脱水した
。直ちにインシアネート酢酸丁番ＩＩ／　／　ｒｕｌ宙
イ制御岬Ｉ）ワ７σル１１「１テて　宕ｔ１りで２０時
間反応させた。反応液を濃縮後、シリカゲルカラムクロ
マトグラフィ（シリカゲル：１００〜２００メツシユ、
溶出溶媒：クロロホルム）で精製しＬｉ的両分を得た。
この両分からクロロポルムを留去し、メタノール５００
ｒｎ！とＩＮ　Ｎａ０ＩＩ　１０−を加えて２０℃で１
０時間反応させ、その後濃縮、凍結乾燥して無色結晶９
８０りを得た。
ＴＬＣ（シリカゲル、クロロホルム：メタノール＝９　
：　１）　＋１ｌｆ−０，５゜ＮＭＲ（ＣＤα３）（エ
チルエステル体）＝δｐｐｍ１．３５　　（３１１，ｔ
、　　−〇ｌｈにＩｈ）、　２．２５（２＋１．　　ｑ
、　　−ｆ；拝□ｅｌ＋、）、／にシ ２．４０　（２＋１．ｄ、　−ＣＩ＋、　）、３．１７
（＋２１１．　ｓ、　−Ｎ、ｃ、、、ｘ２）、４．９０
（ＩＨ，Ｌ、−Ｎ１１−）、６．７２〜７．５５（８！
Ｉ、ｍ、ａｒｏｍａｔｉｃ　ＩＩ）。
Ｍ　Ｓ　：　Ｍ　”−３９２゜ ＩＲニジＮ１１＝　３４００ｃｍ−’　、υｃｕ＝　２
９３０ｃｍ−’　、シｃｓｏ−１６５０ｃｍ−’　、ｖ
　Ｏ−ｃ　＝　１１００ｃｍ−’。
実施例　６．過酸化水素の定量 （測定試液） 本発明化合物（１）　０．０５ｍ　ｍ０１／ｌ、ペルオ
キシダーゼ１００／ｍｊの濃度になるように、５０　ｍ
Ｍ　ｔ’ｌＰｌミＳ〔ピペラジン−Ｎ、Ｎ’−ビス（２
−エタンスルホン酸）〕−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ７，０）に溶解した。
〔試料液〕
市販過酸化水素水をイオン交換水で０．５．１．０゜１
．５．２．（１，４，Ｏｒｎ　ｍａｎ／ｌの濃度になる
ように希釈した。
〔測定方法〕
測定試液３ｒｎｌに試料液２０μを加え、３７℃で５分
間加温後、７３００ｍに於ける吸光度（０Ｄ７３ｏ）を
Ｚ同定した。
（結　果） 第１図に過酸化水素濃度と吸光度との関係を示′１−０
第１図より明らかな如く、各過酸化水素濃度（ｍ　ｍａ
ｆＬ／ｌ　＞に対してプロットした吸光度（０Ｄ７３０
）を結ぶ検量線は良好な定量性を示している。
実施例　乙　正常人血清共存下での過酸化水素の定量 〔測定試液〕 実施例　６．に同し。
〔試料液〕
実施例　６．に同じ。
〔測定方法〕
測定試液３ｍＪｌ”Ｑ正常人血清あるいはイオン交換水
５０４を加えた後、試料液２０４を加え５３７℃で５分
間加温後、７３０ｎｍに於ける吸光度（００７３０）を
測定した。
（結　果） 表２に過酸化水素濃度と吸光度との関係を示す。
以下余白 表　　　　　　２ 表２より明らかな如く、本発明化合物を発色成分とする
過酸化水素の定量法は、人血清の存在によりその測定値
に何ら影響を受けないことが判る。
実施例　８．尿酸の定量 〔測定試液〕 本発明化合物（１）　０．１］５ｍ　ｔｎｏｌ／ｌ　、
ペルオキシダーゼ１０１０Ｏ７、ウリカーゼ２　Ｕ／ｄ
、アスコルビン酸オキシダーゼ２　Ｕ／ｒｎｌの濃度に
なるように５０ｍＭＰＩＰＩＥＳ−水酸化ナトリウム緩
衝液（ρ１１６，４）に溶解した。
〔試料液〕
ｌＯす／ｄ！の尿酸を含有する標準液及び人血清１３検
体を試料とした。
〔測定方法〕
測定試液３−に試料２０μを添加し、３７℃で５分間加
温後、７３０ｎｍに於ける吸光度（ＯＤｙｉｏ）を測定
した。
次式に従い人血清中の尿酸濃度を算出した。
参考例　１．尿酸の定量 実施例８と同じ試料を用い、尿酸測定用の市販キット〔
尿酸Ｃ−テストワコー、和光純薬工業■製〕を使用して
、尿酸濃度を測定した。
実施例８及び参考例１．の測定結果を表３に併せて示す
。
表　　　　　３ 相関係数：γ＝１．００ 回帰直線式：Ｙ＝０．９９Ｘ＋０．１１表３から明らか
な如く、本発明化合物を発色剤として用いた実施例８の
測定法により得られた尿酸の測定値は、市販キットを用
いた従来法のそれとよい相関を示している。
実施例　９．尿酸の定量 〔測定試液〕 本発明化合物（ｔｏ）　０．０２５ｍ　ｍｏｌ／ｌ、ペ
ルオキシダーゼ１０１０Ｏ７，ウリカーゼ２　Ｌｌ／ｍ
Ｊ、アスコルビン酸オキシダーゼ２０／−の濃度になる
ように５０　ｍＭ　ＰｆＰＥＳ−水酸化ナトリウム緩衝
液（ｐＨ６，４）に溶解した。
（試料液） １０す／ｄ！の尿酸を有する標準液及び人血清１０検体
を試料とした。
〔測定方法〕
測定試液３ｄに試料２０４を添加し、３７℃で５分間加
温後、６６６ｎｍに於ける吸光度（ＯＤａｅｅ）を測定
した。
次式に従い人血清中の尿酸濃度を算出した。
参考例　２．尿酸の定ｈ１ 実施例９と同じ試料を用い、尿酸測定用の市販キット（
尿酸Ｃ−テストワコー、和光純薬工業■製）を使用して
、尿酸濃度を測定した。
実施例９及び参考例２の測定結果を表４に併せて示す。
相関係数：γ＝１．００ 回帰直線式：　Ｙ＝０．９８Ｘ＋０．１９表４から明ら
かな如く１本発明化合物を発色剤として用いた実施例９
の測定法により１：すられた尿酸の測定値は、市販キッ
トを用いた従来法のそれとよい相関を示している。
実施例　１０．尿酸の定！辻 （測定試液〕 本発明化合物（７）　０．０５ｍ　ｍｏｌ／ｌ　、ペル
オキシダーゼ１０１／ｍｌ、ウリカーゼ２　Ｕ／ｒｎ！
、アスコルビン酸オキシダーゼ２υ／ｒｒＬｌの濃度に
なるように５０＋ｎＭＰＩＰＥＳ−水酸化ナトリウム緩
衝液（ｐｌ＋　６．４）に溶解した。
（試料液〕 １０す／ｄ！の尿酸を含有する標準液及び人血清１３検
体を試料とした。
〔測定方法〕
測定試液３ｍｌに試料１５４を添加し、３７℃で５分間
加温後、７４０ｎｍに於ける吸光度（００７４゜）を測
定した。
次式に従い人血清中の尿酸濃度を算出した。
参考例　３．尿酸の定量 実施例１０と同じ試料を用い、尿酸測定用の市販キット
（尿酸Ｃ−テストワコー、和光紬薬工業■製〕を使用し
て、尿酸濃度を測定した。
実施例１０及び参考例３．の測定結果を表５に併せて示
す。
表　　　　５ 相関係数：γ＝１．００ 回帰直線式：　Ｙ＝１．０２Ｘ−０，１４表５から明ら
かな如く、本発明化合物を発色剤として用いた実施例１
０の測定法により得られた尿酸の測定値は、市販キット
を用いた従来法のそれとよい相関を示している。
実施例１１．遊離脂肪酸（ＮＥＦＡ）の測定（測定試液
、〕 本発明化合物（９）　０．０５ｍ　ｍｏ又／又、ペルオ
キシダーゼ６Ｕ／ｍ！、アシルコエンザイムＡシンセタ
ーゼ（Ａ　ＣＳ　）０．ＩＵ／ｍ！、アシルコエンザイ
ムＡオキシダーゼ（ＡＣＯＤ）３０７ｍＪ、コエンザイ
ムＡ（Ｃｏ　Ａ　）　０．５ｍｇ／ｒｒＬｌ、塩化マグ
ネシウム２　ｍＭ。
エマルゲン９１３（ポリオキシエチレンノニルフェノー
ルエーテル、花王（ｍ！！！＞０．２％を含む５０ｍＭ
ＰＩＰＥＳ−水酸化ナトリウムＩＩＬ衝液（ｐ１１６．
９）を調製し、測定試薬とした。
〔試　料〕
１ｍＥｙ／旦のオレイン酸を含有する基準液及び人血清
１５検体を試料とした。
〔操作法〕
測定試薬３ｍｌに試料２０４を加え、３７℃で１０分間
加温後、６６６ｎｍに於ける吸光度（００６８ｇ）を測
定した。
次式に従い人血清中のＮＥＦＡ濃度を算出した。
参考例４゜ 実施例１１と同じ試料を用い、ＮＥＦＡ測定用の市販キ
ット（ＮＥＦＡ　　Ｃ−テストワコー、和尤純薬工業■
製；ＣｏＡの呈色反応への影響を防止する為に第２測定
試衣中にＳＨ試薬としてＮ−エチルマレイミドを含有）
を用いてＮＥＦＡｆｉ度を測定した。
実施例１１及び参考例４で得られた血清中ＮＥＦＡｃＬ
度測定値を表６に示す。
表　　　　６ 相関係数：γ＝　０．９９９８ 回帰直線式：　Ｙ　＝　（１，９９１Ｘ　＋０．０１表
６より明らかな如く、本発明化合物を発色剤として用い
た実施例Ｕの測定法により得られたＮＥＦＡの測定値は
、市Ｉｋキットを用いた従来法のそれとよい相関性を示
した。この結果から、本発明の化合物（９）を発色剤と
して用いてＮＥＦＡの測定を行えば、従来法では必要と
されていたＳＨ試薬を用いることなく測定が可能であり
、その為従来法では成し得なかった１液法での測定も可
能となることが判った。
「発明の効果」 以上述べた如く、本発明の新規尿素誘導体は、いずれも
その呈色時の極大吸収波長が６５０ｎｍ以上と長波長側
にある為、例えば血清、尿等生体試料中の微量成分の定
量に於ける発色成分としてこれを用いた場合には、試料
中に共存、する４１色の妨害物質の影響を全く受けずに
測定を行うことができるという点、並びに、本発明の新
規尿素誘導体は水、或≠は界面活性剤の溶イｔずろ水溶
液に対する溶解性が極めて良好で且つ色原体の安定性、
呈色安定性共に著しく優れている点に顕著な効果を奏す
るものであり、斯業に貢献するところ大なるものである
。
【図面の簡単な説明】
第１図は、実施例６に於て得られた検ｊ辻線を表わし、
横軸の各過酸化水素濃度（ｍｍｏｕ／又）についてｊ：
？られた吸光度を縦軸に沿ってプロットした点を結んだ
ものである。

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）一般式［ I ］ ▲数式、化学式、表等があります▼［ I ］ （式中、Ｒ＾１、Ｒ＾２は夫々独立して４−ジ置換アミ
    ノアリール基を示し、Ｒ＾１とＲ＾２のアリール基は、
    酸素又は硫黄原子を介して互いに結合していてもよく、
    Ｒ＾３はカルボキシアルキル基、アルコキシカルボニル
    基、アルキルカルボニル基、アリールスルホニル基、ス
    ルホアリール基又はカルボキシアリール基を示す。） で示される尿素誘導体。
  2. （２）一般式［ I ］ ▲数式、化学式、表等があります▼［ I ］ （式中、Ｒ＾１、Ｒ＾２は夫々独立して４−ジ置換アミ
    ノアリール基を示し、Ｒ＾１とＲ＾２のアリール基は、
    酸素又は硫黄原子を介して互いに結合していてもよく、
    Ｒ＾３はカルボキシアルキル基、アルコキシカルボニル
    基、アルキルカルボニル基、アリールスルホニル基、ス
    ルホアリール基又はカルボキシアリール基を示す。） で示される尿素誘導体を発色成分として用いることを特
    徴とする酸化性物質の定量法。
  3. （３）酸化性物質が過酸化水素である、特許請求の範囲
    第２項記載の定量法。
  4. （４）ペルオキシダーゼの存在下、発色成分を酸化発色
    させてその呈色を比色定量する、特許請求の範囲第３項
    記載の定量法。
  5. （５）過酸化水素が、酵素反応により生成する過酸化水
    素である、特許請求の範囲第３項又は第４項記載の定量
    法。
  6. （６）過酸化水素が、生体試料中の微量成分の定量に於
    て酵素反応により生成する過酸化水素である、特許請求
    の範囲第５項記載の定量法。
  7. （７）生体試料中の微量成分の定量が、基質又は酵素反
    応により生成した物質に酸化酵素を作用させ生成する過
    酸化水素を定量することにより行なう生体試料中の基質
    又は酵素活性の定量である、特許請求の範囲第６項記載
    の定量法。
  8. （８）一般式［ I ］ ▲数式、化学式、表等があります▼［ I ］ （式中、Ｒ＾１、Ｒ＾２は夫々独立して４−ジ置換アミ
    ノアリール基を示し、Ｒ＾１とＲ＾２のアリール基は、
    酸素又は硫黄原子を介して互いに結合していてもよく、
    Ｒ＾３はカルボキシアルキル基、アルコキシカルボニル
    基、アルキルカルボニル基、アリールスルホニル基、ス
    ルホアリール基又はカルボキシアリール基を示す。） で示される尿素誘導体を発色成分として用いることを特
    徴とする、ペルオキシダーゼ様物質の定量法。
  9. （９）ペルオキシダーゼ様物質がペルオキシダーゼであ
    る、特許請求の範囲第８項記載の定量法。
  10. （１０）ペルオキシダーゼ様物質がヘモグロビン又はそ
    の他のヘム化合物である、特許請求の範囲第８項記載の
    定量法。
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