JPH0466087A

JPH0466087A - 安定化されたアスコルビン酸酸化酵素組成物

Info

Publication number: JPH0466087A
Application number: JP17925690A
Authority: JP
Inventors: Toru Eguchi; 徹江口; Kazuyoshi Kita; 一吉喜多; Yoshio Tokokuni; 常国　美穂; Chiyo Morikawa; 森川　千代
Original assignee: Sunstar Inc
Current assignee: Sunstar Inc
Priority date: 1990-07-05
Filing date: 1990-07-05
Publication date: 1992-03-02
Anticipated expiration: 2010-11-08
Also published as: JPH07102133B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】童！上史息囲公！本発明は、アスコルビン酸酸化酵素（酵素番号（ＥＣ１
，１０，３３）　、以下ＡＳＯと略称する）の活性の安
定化法、および該酵素を安定に配合した組成物に関する
。

従来技術とその課題ＡＳ○は古（から多くの植物に存在することが知られて
いる酵素で、酸素の存在下、アスコルビン酸を酸化する
酵素であり、近年臨床検査分野に多く利用されている。

例えば、アスコルビン酸そのものの定量や、臨床検査に
繁用される過酸化水素定１系において、被検体中のアス
コルビン酸による干渉を除去するために、本酵素を使用
することが一般化している。

しかしながら、ＡＳ○は非常に不安定な酵素であり、従
来から、その安定化が種々検討されている。

一般に、酵素を安定化する方法としては、例えハ、酵素
溶液中にシュークロース、マルトース等の糖類、アルブ
ミン、脱脂粉乳等の蛋白質、Ｃａ″′塩、Ｍ　ｇ　！　
”塩等の塩類、２−メルカプトエタノール等の還元剤等
を添加する方法、酵素を適当な担体へ固定化する方法、
遺伝子工学の手法により酵素のアミノ酸配列を改変する
方法等が知られているが、特定の酵素についてこれらの
どの方法がよいというような一般的な法則はなく、個々
の酵素について試行錯誤的に安定化方法を選択している
のが現状である。ＡＳＯの安定化の試みとしては、これ
らの方法以外にホウ酸塩、あるいはアルギニン等のアミ
ノ酸を混在させることによる方法（特公昭６１−１２６
７５号）が提案されているが、これは凍結乾燥粉末のよ
うな製剤における安定化に限られている。また、ポリア
ルキレングリコールおよび／またはその誘導体で化学修
飾することによる方法（特開平１−１２８７８６号）も
提案されているが、これは溶液状態での安定化に限られ
ており、安定化の期間も短期間である。

しかし、乾燥状態、溶液状態を問わず、いずれの状態に
おいても、安定性の向上が臨床検査薬の品質やコストの
点から強く望まれている。

このような事情に鑑み、本発明者らは、製造および貯蔵
時に、乾燥状態および溶液状態を問わず、充分にＡＳＯ
の安定化をできる方法について種々検討を行った。

すなわち、製造から貯蔵まで一貫して安定化を確立する
為には、最終反応時の条件での安定化が最も重要となる
。通常、生体成分の反応を行なうには、中性付近のｐＨ
を用い、生理的塩濃度に近い溶液状態で実施することが
多く、まず、この条件に合う緩衝剤系の選択が重要とな
る。すなわち、ＡＳＯが本条件下の溶液状態で安定であ
ることが、貯蔵における安定化につながる。一方、−船
釣に酵素の安定化を目的として種々の緩衝剤、ＢＳＡ等
のタンパク等を添加することが知られているが、これら
は目的である酵素反応を時として妨害することも知られ
ている。そこで、本発明者らは、ＡＳＯ活性が維持され
、かつ、水溶液中での安定性が増大する緩衝剤を種々検
討した結果、いわゆるグツド緩衝剤の一種であるＮ−置
換タウリン系緩衝剤が、ＡＳＯの安定性を溶液状態にお
いて従来に比べ、著しく向上すること、特に、糖類との
併用により、その効果が顕著であることを見出した。

また、これにより、製剤化における凍結乾燥等における
回収率が良好であるばかりでな（、乾燥状態における安
定化についても著しい向上が認められるごとが判明した
。

課題を解決するための手段本発明は、ＡＳＯをＮ−置換タウリン系緩衝剤の存在下
に保持することを特徴とするＡＳＯの安定化を提供する
ものである。また、ＡＳＯにＮ−置換タウリン系緩衝剤
を配合してなる安定化されたＡＳＯの組成物も提供する
。本発明においては、さらに糖類を共存させることが好
ましく、本発明によれば、乾燥状態、溶液状態を問わず
、ＡＳＯの安定性が著しく向上する。

本発明に用いるＮ−置換タウリン系緩衝剤としては、２
−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、３
−　（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホンｆｌ　（ＭＯ
ＰＳ）　、Ｎ−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ−２−
エタンスルポンＭ（ＨＥＰＥＳ）、ピペラジン−Ｎ、Ｎ
’−ビス（２−エタンスルホン酸（Ｐ　Ｉ　ＰＥ５）　
、Ｎ〜トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−７ミノ
エタンスルポン！！　（ＴＥＳ）　、Ｎ、Ｎ’−ビス（
２−ヒドロキシメチル）２−アミノエタンスルホンｆｉ
（ＢＥＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミ／エ
タンスルホン酸（ＡＣＥＳ）　、Ｎ−２−ヒドロキシエ
チルピペラジン−Ｎ’−３−プロパンスルホン酸（ＨＥ
ＰＰＳ）　、Ｎ−）リス（ヒドロキシメチル）メチル−
３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、シクロへ
キシルアミノエタンスルホンＷＩＣＣＨＥＳ）、シクロ
へキシルアミノプロパンスルポン酸（ＣＡＰＳ）等が挙
げられる。添加濃度は特に制限はないが、通常、酵素組
成物中１０ｍＭ以上であり、溶解度、目的とするｐＨに
より、適宜選択される。

本発明に用いる糖類は、単糖類、少糖類、多糖類いずれ
でもよく、これは単独でも、二種以上を併用してもよい
。単糖類、少糖類を用いる場合、単糖類よりも少糖類が
好ましく、少糖類の中でもＪＩＪ１元糖Ｃ例、シェーク
ロース、トレハロース等）がより好ましい。濃度は酵素
組成物中０．１重量％以上、望ましくは１重量％以上３
０重量％以下であり、３０重量％を越えると添加物の沈
澱が生じることがある。

多糖類としては、その分子量が５．０００〜５００，０
００の水溶性のものであればよく、特に限定されるもの
ではないが、例えば、デキストラン、デキストラン硫酸
、プルラン、可溶性デンプン、コンドロイチン硫酸、デ
キストリン等のものが好ましく挙げられる。濃度は酵素
組成物中０．１重量％〜１０％であり、１０％より多い
と添加剤の沈澱が生じることがある。

本発明に用いるＡＳＯの由来については、キュウリ、カ
ポチャ等の植物由来のものでも、微生物由来のものでも
制限はないが、キュウリまたはカポチャ由来のものが好
ましく用いられる。また、ＡＳＯは必ずしも純品である
必要はないが、好ましくは、臨床検査に使用できる程度
に精製されたものがよい。

本発明の安定化法を実施するには、ＡＳＯとＮ−置換タ
ウリン系緩衝剤、所望により糖類を乾燥状態、または溶
液状態で常法により混合すればよい。例えば、ＡＳＯを
Ｎ−置換タウリン系緩衝剤を含む溶液に溶解し、ついで
、所望により糖類を添加する。また、糖類を含むＮ−置
換タウリン系緩衝剤溶液にＡＳＯを添加したり、あるい
はＡＳＯと糖類とＮ−置換タウリン系緩衝剤を同時に溶
解してもよい。ｐＨは６〜９、好ましくは、６〜８とす
るのが望ましく、また、他の反応補助酸物や防腐剤等を
共存させてもよい。

本発明の酵素組成物は、前記のようなＡＳＯｌＮ−置換
タウリン系緩衝剤、所望により糖類の混合物を常法によ
り、液剤や、凍結乾燥品、錠剤、顆粒のような固形剤と
することにより得られる。

その安定性がより向上するので、凍結乾燥品が好ましい
。

なお、本発明で使用するＡＳＯの酵素活性は以下の方法
で測定する。

（１）反応液の組成１ｍＭアスコルビン酸溶液（０，２Ｍリン酸１カリウム
および１ｍＭエチレンジアミンテトラ酢酸・２ナトリウ
ム塩を含む）０．５１１２０．０１Ｍリン酸２ナトリウム溶液０．５友Ｑ酵素液（０，０４〜０，３単位／１１Ｑに０．０５％牛
血清アルブミンを含む０．ＯＩＭ！Ｊン酸２ナトリウム
溶液で希釈）　　０．１ｘＱ（２）反応条件および酵素
力価３０℃にて５分間反応させる。反応停止は０．２Ｎ塩酸
を３．０１１２添加して行い、分解されたアスコルビン
酸量を２４５ｎｍの吸光度の減少量から求める。すなわ
ち、アスコルビン酸のこの条件下における２４５ｎｍで
の分子吸光係数として（ε−１０Ｘ１０１）を用い、反
応時の２４５ｎｍにおける吸光度の減少量から分解され
たアスコルビン酸量を求め、これをもとにして試料中の
酵素力価を算出する。

酵素力価の表示は、この条件下で１分間に１μモルのア
スコルビン酸が分解される酵素量を１単位として行なう
。

大施思つぎに、実験および実施例を挙げて、本発明をさらに詳
しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものでは
ない。

叉囚ユＡＳＯを、各濃度のＰＩＰＥＳ　（ｐＨ７，０）を含有
する溶液に溶解し、４０°Ｃ１７−日および１４日放置
後、その残存活性を検討した。

結果を第１表に示す。

第１表第１表から明らかなごとく、ＰＩＰＥＳの濃度の上昇と
共に、ＡＳＯの貯蔵安定性が向上する。

寒橡７ＡＳＯ（３１９０／１９）を、第２表に示す濃度で、２
０ｍＭ緩衝剤（ｐＨ７，０）および、所望により、糖類
を添加した溶液に約１００Ｕ／ｚｇとなる様に溶解し、
溶液状態で４０°Ｃ１１４日後の酵素活性の残存率を測
定し、２０ｍＭＡＤＡ、ホウ酸ナトリウムおよび０．０
５％アルブミン溶液と比較した。

結果を第２表に示す。第２表から、明らかなように、Ｐ
Ｉ　ＰＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ等のＮ−置
換タウリン系緩衝剤を用いた場合、ＡＳＯの安定性の著
しい向上が認められた。さらに、単糖類、少糖類では、
０．１％〜３０％、多糖類では、０．１〜１０％の濃度
において、溶液の状態を変化させることなく、安定性が
さらに向上した。

一般に、ＡＳＯの安定化剤として用いられるホウ酸ナト
リウム、アルブミンと比べても、そノ安定化効果は高い
ものであった。しかし、グリシン系緩衝剤であるＡＤＡ
を用いた場合、著しい活性の低下が認められた。

基線１１２０ｍＭＰＩＰＥＳ緩衝液に、シュークロース、ラク
トース、デキストラン、アミロデキストリンを、各々、
０．１％の濃度となるように添加した溶液に、Ａ　Ｓ　
Ｏ（４５８Ｕ／１１２）ヲ約１００Ｕ／ｘＱとなるよう
に溶解し、１０℃にて４力月後までの酵素活性の残存率
を測定した。

結果を第３表に示す。

第３表＊０日口の活性を１００％とした。

第３表から明らかな様に、糖類の種類にかかわらず、溶
液状態で１０℃の条件下にてＡＳＯの長期間にわたる安
定化が示された。

寒皇珂ユ２２０ｍＭＰ　Ｉ　ＰＥＳ　（ｐＨ８，０）およびこれ
にシェークロース２２ｕ／ｘ（ｌを添加した溶液を調製
し、この溶液にＡＳＯをｌ１００Ｕ／３１１２となる様
に溶解した。この溶液３ＭＱを、３０１１２真空凍結乾
燥用バイアルビンに分注し、−４５℃テ凍結後、４８時
間凍結乾燥を実施した。同様に、ＡＳ０１１００Ｕ／ｊ
Ｉｉ２を精製水に溶解し、凍結乾燥した。凍結乾燥終了
後、バイアルにｌＱＱｍＭＰＩＰＥＳ　（ｐＨ７，０）
３３１１２を加えて溶解し、溶解直後に酵素活性を測定
した。ＡＳＯは製造ロットの異なる４種を用い検討した
。

結果を第４表に示す。

第４表＊仕込み前の溶液の活性を１００％とした。

第４表から明らかなように、Ｎ−置換タウリン系緩衝液
、あるいは糖類を添加した組成物においては、無添加に
比べ凍結乾燥回収率の著しい向上か認められ、糖類の添
加により更に回収率が向上した。

実施例２２２０ｍＭＰ　Ｉ　ＰＥＳ　（ｐＨ８，０）に、シュー
クロースまたはラクトースを２２ｍ９／ｚ（ｌとなる様
に添加し、この溶液１．１−ＡＳＯを１１００　Ｕ／ｘ
Ｑとなる様に溶解した。この溶液を実施例１と同様の方
法で凍結乾燥品とした。これらを１０″Ｃ１３０℃、４
０℃の条件下で保存し、・その安定性を検討した。その
結果を第５表に示す。

第５表から明らかな様に、ＡＳＯ、Ｎ−置換タウリン系
緩衝液、糖類の組成物において、いずれの組成物でも、
長時間にわたり高い安定性が認められた。しかし、ＡＳ
Ｏ単独では著しい活性の低下が認められ、本発明の安定
性向上が認められた。

発明の効果本発明によれば、溶液状態および乾燥状態を問わずＡＳ
Ｏの安定化が図れ、臨床検査等におけるＡＳＯの使用上
、きわめて有効である。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）アスコルビン酸酸化酵素を、Ｎ−置換タウリン系
緩衝剤の存在下に保持することを特徴とするアスコルビ
ン酸酸化酵素の安定化法。
（２）糖類を共存させる請求項（１）記載の安定化法。
（３）アスコルビン酸酸化酵素に、Ｎ−置換タウリン系
緩衝剤を配合してなることを特徴とする安定化されたア
スコルビン酸酸化酵素組成物。
（４）さらに、糖類を配合してなる請求項（３）記載の
組成物。