JPS62228272A - 安定なペルオキシダ−ゼ製剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野　　゛ 本発明は安定なペルオキシダーゼ製剤に関する。更に詳
細には、ペルオキシダーゼとアスコルビン酸類、キサン
タンガム、タマリンド種子多糖類、グア種子多糖類の一
種又は二種以上を含有する水性又は乾性組成物からなる
安定なペルオキシダーゼ製剤に関する。

ペルオキシダーゼは、過酸化水素存在下に種々の化合物
を酸化する酵素で、本発明の該製剤は研究試薬、臨床診
断における酵素分析や免疫分析の他、食品分野に於いて
巾広く利用されうる。

従来の技術 ペルオキシダーゼを安定化せしめた技術としては、ホウ
酸イオン生成物質を含有する安定なペルオキシダーゼ組
成物（特開昭５５−５４８９５）　、ミエロペルオキシ
ダーゼにクエン酸又はその塩を添加した粉末製剤（特開
昭５９−２６８６　）　、ペルオキシダーゼに血清蛋白
質及びポリアルキレンぐ゛リコールを含む酵素組成物（
特開昭５９−２１０８８５　＞　、ミエロペルオキシダ
ーゼにアルブミンを添加した粉末製剤（特開昭５８−１
３５２１）　、炭素数１乃至５ケを有する低級アルコー
ルの少なくとも１つを含む酵素溶液の安定化（特開昭５
５−１３００８）　、グルタチオンペルオキシダーゼに
五、六炭糖、五、六価糖アルコール及び三糖類のうちの
少なくとも１つを含有する酵素組成物（特開昭５８−９
６８８　）　、ハプテン、抗原、抗体、又は結合タンパ
クとのコンジュゲートしたペルオキシダーゼ組成物（ア
メリカ特許第４゜５０４．５７９号）、フェリシアン化
カリウムによる安定化（Ｊ、ｌＩｉｓｔｏｃｈｅｍ、Ｃ
ｙｔｏｃｈｅｍ、　、３２巻、１００５頁。

１９８４年）、カルシウムイオンによる熱安定性の向上
（Ｂｉｏｏｒｇ、Ｋｈｉｍ、、　７巻、７５頁、　１９
８１年）、トリトンＸ　−１００，ツイーン界面活性剤
による安定化（Ｚ、Ｍｅ＋ｉ、ＬａｂｏｒａＬｏｒｉｕ
ｍｓｄｉａｇｎ、　、　２１巻、１８０頁、　１９８０
年）、硫酸鉄、マンニトール、ポリエチレングリコール
、ラクトアルブミンを含むペルオキシダーゼ含有物の安
定化（ドイツ特許第２，７４２，６９９号）等が報告さ
れている。

発明が解決しようとする問題点 上記のようにペルオキシダーゼの安定化に関しては種々
の報告がなされているが、これらの安定化剤は製剤化特
に練合、造粒、乾燥といった圧力及び熱に対しての安定
化には殆ど寄与しない。

又、長期間の溶液保存によるペルオキシダーゼの失活を
有効に防止した安定化剤はない。

更に、上記安定化剤の中には、食品用としては有害で使
用できなかったり、検査用の試薬として用いるには反応
系を妨害して使用に耐えないなどの問題がある。

そこで本発明は、かかる欠点を補うべくペルオキシダー
ゼの製剤加工、溶液保存に於ける著しい失活を防ぎ且つ
該製剤の保存・管理においてその活性を長期間にわたり
維持せしめることを目的とし、食品分野の他、臨床診断
用の酵素製剤として使用できる安定なペルオキシダーゼ
製剤をうろことにある。

問題点を解決するための手段 本発明者らは、ペルオキシダーゼの安定化剤となりうる
無害で且つそれ自身安定な、食品、臨床検査診断用に好
適な物質を種々検討した。

そしてアスコルビン酸類、キサンタンガム、タマリンド
種子多糖類、グア種子多糖類の一種又は二種以上を含む
物質がペルオキシダーゼの製剤化に伴う失活並びに溶液
保存における失活を防止し卓越した安定化効果がみられ
、又経時的な安定性にも寄与することを見い出し、本発
明を完成するに至った。

本発明で使用するペルオキシダーゼは、種々の起源のも
のから得られ、例えば西洋ワサビ、ダイコン、カブ、コ
ムギ胚、コメ胚、サツマイモ、ダイズ子葉、タケノコ等
植物起源のものや、血液及′　びその構成成分の白血球
、乳汁、甲状腺、小腸。

唾液等動物由来のもの及び酵母、細菌などの微生物起源
のものも用いることができる。具体的に示せば、西洋ワ
サビペルオキシダーゼ、ミエロペルオキシダーゼ、ラフ
１−ペルオキシダーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ
、チトクロムＣペルオキシダーゼ、クロロペルオキシダ
ーゼ、ブロムペルオキシダーゼ、ＮＡＤ　（Ｐ）Ｈペル
オキシダーゼ等が挙げられる。

上記酵素は、酵素精製の常套手段によりその使　　゛用
用途に応じて粗酵素から高純度ネｒ１製酵素までその純
度を任意に調整しろる。

ペルオキシダーゼを製剤加工するに際し用いられる安定
化剤としては、アスコルビン酸類、キサンタンガム、タ
マリンド種子多糖類、グア種子多糖類の一種又は二種以
上を含む物質が挙げられる。

アスコルビン酸類とはアスコルビン酸及びその塩を含む
ことを示す。キサンタンガムは微生物Ｘａｎ　ｔｈｏｍ
ｏｎａｓ　ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓが産生ずる多糖類（分
子量２００万）であり、タマリンド種子多糖類とはタマ
リンド種子から得られる多糖類例えばグリロイド〔登録
商標〕　（分子量６５万）であり、グア種子多糖類とは
グア種子から得られる多糖類例えばグアパック〔登録商
標〕　（分子量２０万〜３０万）等が挙げられる。この
うち、特にキサンタンガムが好ましく用いられる。

使用される量としては、アスコルビン酸及びその塩にお
いてはペルオキシダーゼ活性２００単位に対し０．５〜
５ｍｇ、好ましくは１〜２ｍｇであり、製剤全量に対し
ては０．００５〜０．０３％である。０．０３％以上で
は活性測定における反応系を阻害したり、安定化が損な
われる為使用できない。

キサンタンガム、タマリンド種子多糖類又はグア種子多
糖類は製剤全量に対して０．０１〜０．１％添加するこ
とが好ましい。０．１％以上ではこれら多糖類の粘性増
加に伴い、特に造粒が困難となる。

本発明のペルオキシダーゼ製剤は、その性状が顆粒状、
細粒状等の乾性組成物でもよいが、液状のものであって
も何等差し支えるものではない。

又、この液状組成物を凍結乾燥、真空乾燥等の乾燥手段
により乾性組成物にすることも制限されるものではない
。

ペルオキシダーゼ製剤をうるには、賦形剤と酵素を含む
混合粉末に結合剤を添加し、練合して造粒し、顆粒剤又
は細粒剤にすることが適当である。

ここで用いられる造粒の種類は、その機能を生かしうる
ちのであれば如何なるものでもよいが例えば押し出し造
粒、オシレーター造粒、転勤造粒。

流動層造粒、噴霧造粒等を挙げることができる。

又、造粒に際して使用する溶剤はアルコール類でもよい
が水が最も好ましい。水で造粒することにより、安定化
剤による効果が顕著にみられることや賦形剤に水系のも
のが使用できること、加えるにコストの低減が図れるメ
リットを有するのである。

ここで好ましい実施態様の−っである押し出し造粒法に
よるペルオキシダーゼ製剤について説明する。

まず、乳糖、アビセル、沈降炭酸カルシウム。

ハレイシ：Ｉ澱粉、トウモロコシ澱粉、デキストリン、
合成ケイ酸アルミニウムなどの賦形剤にペルオキシダー
ゼ溶液又は凍結乾燥粉末を添加して均等に混和する。し
かるのち、アラビアゴム、ゼラチン、ブドウ糖、寒天、
グラニュー糖、ヒドロキシプロピルセルロース、メチル
セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カ
ルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロー
スナトリウム、ポリビニルピロリドン、澱粉などの結合
剤を水又は緩衝液に溶解した液及び安定化剤であるアス
コルビン酸類、キサンタンガム、グリロイド〔登録商標
〕、グアバツク〔登録商標〕の一種又は二種以上を含む
溶液を上記の混合粉末に加えてニーグー中に入れ、３０
分程度よく練合する。

これらを押し出し造粒機でスクリーン径約０．５〜１、
Ｏｔｍにて造粒する。この場合の造粒には、ロータリー
型、スクリュー型、ペレットミル型の造粒機が用いられ
る。

調製された顆粒は、通常用いられる乾燥機例えば流動乾
燥機で５０〜７０℃、好ましくは５５〜６５°Ｃで約３
０分乾燥すればよい。

溶液剤はペルオキシダーゼを水又は緩衝液に熔解して安
定化剤を添加溶解した後、防腐剤を０．０１％程度加え
て調製される。この溶液の中には、臨床検査測定に必要
とされ企酵素、色素（発色団）、界面活性剤なども含有
させることができる。

かくして、上記の製剤加工工程での加圧及びそれに伴う
熱発生、溶液保存などによる酵素活性の損失を未然に防
止し、活性を保持したままの安定なペルオキシダーゼ製
剤を得ることが可能となった。加えて、該製剤は経時的
に安定であるため、長期間にわたり品質の維持を保証す
るものである。

ペルオキシダーゼの活性測定は以下の方法により測定し
た。

試薬 （１）緩衝液　リン酸水素−カリウム１．３６ｇ　、　
５％フェノール３　ｍｅ及び５％トリトンＸ−１００３
−を水５０ｍ１！に溶解し、２Ｎ−水酸化ナトリウム溶
液でρ！■を７．ＯＯに開塾した汲水を加えて正確に１
００＋＋＋Ｊ！とする。

（２）過酸化水素試液　過酸化水素水（過酸化水素３１
％含有）０．１ｍｅに水を加えて正確に１００−とする
。

（３）４−アミノアンチピリン試液　４−アミノアンチ
ピリン４０ｍｇに水を加えて正確に１００カとする。

酵素溶液 ５００ｎｍにおける１分間の吸光度変化が０．０２にな
るように、０．１Ｍリン酸緩ｉ封液（ｐＨ７，０）にｌ
８解する。

反応方法 緩衝液２ｍ！、過酸化水素試液１ｍｌ！、４−アミノア
ンチピリン試液０．１−及び酵素溶液０．１ｍｅをキュ
ベｙ　ｔ・に入れ、３７℃で反応させ２分後及び４分後
の吸光度を測定する。

酵素活性単位 ここで１単位とは、１分間に１１１ｍｏｌｅのキノンイ
ミン色素を生成する酵素量をいう。

以下に実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、
本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例１ 乳糖１００ｇにペルオキシダーゼ（２００単位／ｍｇ＋
天野製薬■製）　１５ｍｇを添加してよく混合し、アス
コルビン酸ナトリウム（田辺製薬（掬製）　１５ｍｇを
含む１％アラビアゴム未氷水溶液１０−加え練合して押
し出し造粒機（不二バウダル製、ＥＸＫ−１型）でスク
リーン０．８ｍｓにて造粒した。できた顆粒は、流動乾
燥機（不ニパウダル製、ＤＰ−１０型）に入れ６０℃で
２０分間乾燥した。

実施例２ 乳糖１００ｇにペルオキシダーゼ（２００単位／ｍｇ。

天野製薬ａ菊製）１５ｍｇを添加してよく混合し、キサ
ンタンガム（大日本製薬（４増製）　５０ｍｇを含む１
％アラビアゴム末氷水溶液１０−加え、以下実施例１と
同様に処理して顆粒剤を得た。

実施例３ バレイショ澱粉１２０ｇにペルオキシダーゼ（１００単
位／ｍｇ＋天野製薬■製）　２０ｍｇを添加してよく混
合し、これにグリロイド（登録商標、大日本製薬０鴫製
）　５０ｍｇを含む１％ゼラチン水溶液２０セを加えて
１５分間練合し、以下実施例１と同様に処理して顆粒剤
を得た。

実施例４ ペルオキシダーゼ（２５０単位／ｍｇ＋天野製薬側製）
　５０ｍｇにアスコルビン酸（田辺製薬＠製）　７０ｍ
ｇを添加し、これを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０
）１００ｍｔ’（防腐剤を含む）に熔解して溶液剤を調
製した。

実施例５ ペルオキシダーゼ（２５０単位／ｍｇ＋天野製薬側製）
　５０ｍｇにキサンクンガム（大日本製薬０零製）０゜
１５ｇを加え、これをトリス−塩酸緩衝液（ｐｆ１７．
５　）１００−に熔解して凍結乾燥し、篩過して粉末製
剤を得た。

実施例６ 乳糖２００ｇにペルオキシダーゼ（５０単位／ｍｇ、天
野製薬０１製）　３０ｍｇを水１０ｍ１！に溶解した液
を添加混合し、これにアスコルビン酸（田辺製薬（横裂
）　１０ｍｇ及びキサンタンガム（大日本製薬０鴫製）
　５０ｍｇを含む０．５％ヒドロキシプロピルセルロー
ス（信越化学（１菊製）　１０ｍｆ’を加えニーダ−に
て練合し、以下実施例１と同様に１桑作して顆粒剤を得
た。

試験例１ 実施例１及び２で得られた顆粒剤の酵素活性を測定した
。なお、コントロールは安定化剤を添加しないものとし
た。結果を第１表に示す。

これから判るように、アスコルビン酸ナトリウム及びキ
サンタンガムは顕著な製剤加工工程における安定化効果
をもたらしている。

第１表 試験例２ 安定化剤の濃度及び結合剤の種類を変えて造粒し、調製
された顆粒剤の酵素活性を調べた。結果を第２表に示す
。括弧内の数値は、結合剤にゼラチンを使用した時のも
のであり、他は全てアラビアゴム末を用いた。

これから明らかなように、アスコルビン酸ナトリウム１
０乃至２０ｍｇ及びキサンタンガムは顕著な効果がみら
れ、ペルオキシダーゼの製剤加工における失活を未然に
防止していることが判る。又、グリロイド〔登録商標〕
、グアパック〔登録商標〕も無添加の場合に比べると安
定化効果がみられた。

第２表 試験例３ 試験例１で用いた顆粒剤の４０℃に於ける経時的変化を
みた。残存活性（％）の結果を第３表に示す。

これかられかるように、本発明のペルオキシダーゼ製剤
は長期間にわたり安定であることが判る。

第３表 試験例４ 実施例４及び実施例５の溶液又は凍結乾燥粉末について
、ペルオキシダーゼ活性の経時的変化を調べた。

比較として、ホウ酸、クエン酸及び可溶性澱粉を同量用
いた。

残存活性の結果を第４表に示す。尚、溶液については４
°Ｃで、凍結乾燥粉末は３７℃で保存した。

これかられかるように、ペルオキシダーゼの溶液及び凍
結乾燥粉末は従来安定化剤として報告されたホウ酸。

クエン酸及び可溶性澱粉よりも優れた安定化効果がみら
れる。

第４表 発明の効果 本発明は、製剤加工や溶液での保存により不安定となっ
たペルオキシダーゼをアスコルビン酸類、タマリンド種
子多糖類、グア種子多糖類の一種又は二種以上を添加す
ることによって安定化せしめ、さらに長期間にわたり優
れた品質を保持することができる利点を併せもつ製剤で
ある。よって、該製剤は食品用並びに臨床検査用として
有利に使用しうる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　ペルオキシダーゼとアスコルビン酸類、キサンタン
   ガム、タマリンド種子多糖類、グア種子多糖類の一種又
   は二種以上を含有する水性又は乾性組成物からなること
   を特徴とする安定なペルオキシダーゼ製剤。 ２　ペルオキシダーゼの造粒工程でアスコルビン酸類、
   キサンタンガム、タマリンド種子多糖類、グア種子多糖
   類の一種又は二種以上を添加する特許請求の範囲第１項
   記載の安定なペルオキシダーゼ製剤。 ３　アスコルビン酸類を０．００５〜０．０３％添加す
   る特許請求の範囲第１項又は第２項記載の安定なペルオ
   キシダーゼ製剤。 ４　キサンタンガム、タマリンド種子多糖類又はグア種
   子多糖類を０．０１〜０．１％添加する特許請求の範囲
   第１項又は第２項記載の安定なペルオキシダーゼ製剤。