CN113005040B - 一种乳双歧杆菌冻干保护剂及其使用方法 - Google Patents

一种乳双歧杆菌冻干保护剂及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种乳双歧杆菌冻干保护剂及其使用方法，属于益生菌生产领域。本发明的冻干保护剂包含如下按质量百分比计的成分：海藻糖6‑8%、麦芽糊精6‑8%，蔗糖1‑4%、维生素C 0.01‑0.05%、甘油1‑5%、L‑精氨酸0.1‑1%，余量为水；其制备方法为：维生素C溶解于适量水中，用滤膜过滤除菌；用余量的水溶解其余组分，搅拌均匀后灭菌；将两者混匀。其使用方法为：将离心收集的菌泥与冻干保护剂混匀后进行冷冻干燥。本发明的冻干保护剂可使乳双歧杆菌菌体冻干存活率稳定在80%以上，菌粉活菌数为1×1012CFU/g，菌粉保藏1年时存活率为50%以上，大大提高了菌体冻干存活率及后期菌粉稳定性。

Description

一种乳双歧杆菌冻干保护剂及其使用方法
技术领域
本发明属于益生菌生产领域，具体涉及一种乳双歧杆菌冻干保护剂及其使用方法。
背景技术
乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)又称动物双歧杆菌，归属于双歧杆菌属。双歧杆菌为革兰氏阳性菌，无鞭毛、不运动，不形成芽孢，厌氧，其菌体形态各异，典型的有V形、 Y形和曲状等，主要存在于人类和哺乳动物肠道内，能够定植于肠道且形成优势菌群发挥益生功效，如调节肠道菌群并防治相关疾病、降低胆固醇、增强机体免疫力、延缓衰老等，是人体内的重要益生菌。因其独特的益生功效，已广泛应用于食品、医疗保健、畜禽养殖等领域。
目前，乳双歧杆菌菌粉主要通过真空冷冻干燥技术来生产，菌液直接冷冻干燥存活率极低，而合适的冷冻干燥保护剂能够大大提高菌体存活率，除此之外，菌粉的后期储藏稳定性也与冻干保护剂有着密切的关系，因此开发一种合适的乳双歧杆菌冻干保护剂尤为重要。
发明内容
本发明的目的在于解决现有冷冻干燥生产乳双歧杆菌菌粉菌体存活率低、菌粉菌数含量低的问题，提供一种乳双歧杆菌冻干保护剂及其使用方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种乳双歧杆菌冻干保护剂，包含如下按质量百分比计的成分：海藻糖6-8％、麦芽糊精 6-8％，蔗糖1-4％、维生素C 0.01-0.05％、甘油1-5％、L-精氨酸0.1-1％，余量为水。所述的麦芽糊精型号为MD20，DE在18％～22％之间，有一定的吸潮性，溶解性良好，在食品中使用时不会提高黏度。所述的L-精氨酸的质量百分比优选为0.5-0.8％。
优选的，所述的乳双歧杆菌冻干保护剂包含如下按质量百分比计的成分：海藻糖6％、麦芽糊精8％，蔗糖2％、维生素C 0.02％、甘油3％、L-精氨酸0.5-0.8％，余量为水。
所述的乳双歧杆菌冻干保护剂的制备方法，包括如下步骤：维生素C溶解于适量的水中，用滤膜过滤除菌后，得到溶液A；再用余量的水溶解海藻糖、麦芽糊精、蔗糖、甘油、L-精氨酸，搅拌均匀后灭菌，得到溶液B；将溶液A和溶液B混合均匀后得到完整的保护剂，存于4℃备用。优选的，所述的滤膜为0.22μm的滤膜；所述的灭菌的条件为115℃灭菌20min。
所述的乳双歧杆菌冻干保护剂的使用方法，包括如下步骤：将离心收集的菌泥与冻干保护剂混合均匀，冷冻干燥后，得到乳双歧杆菌菌粉。
优选的，所述的乳双歧杆菌冻干保护剂的使用方法，包括如下步骤：将离心收集的菌泥与冻干保护剂按照质量比1:1～2混合均匀，置于冷冻干燥机内，-40℃～50℃预冻2-3h，再于10-20Pa条件下2-4h升温至-10℃～-15℃冷冻干燥10-15h，后于10-20Pa条件下2-4h升温至20℃～25℃冷冻干燥10-15h，即可得到乳双歧杆菌菌粉。
本发明的冻干保护剂中的麦芽糊精为大分子糖类物质，能够与菌体一起形成料液骨架结构，在冻干过程中减少升温导致的坍塌，同时在预冻过程中可以减少冰晶的形成对菌体造成的伤害；海藻糖为小分子糖类，能够强力地束缚水分子，与膜脂质共同拥有结合水或本身起到代替膜结合水的功用，从而防止生物体膜和膜蛋白的变性，减少冻干过程中失水导致的菌体死亡；甘油为亲水性物质，能够减少预冻过程中冰晶的形成，减少冰晶对菌体的伤害，并部分取代水分子与菌体表面亲水物质结合，减少干燥伤害；维生素C为抗氧化剂，能够抵挡菌体在冻干前混合时与氧气的接触以及冻干后的菌粉与空气接触时的氧化伤害，增强菌粉稳定性；L-精氨酸能够诱导菌体合成抗冷冻效应蛋白，提高菌体抗冷冻能力。
采用本发明的冻干保护剂及其使用方法可使乳双歧杆菌菌体冻干存活率稳定在80％以上，菌粉活菌数为1×1012CFU/g，菌粉保藏1年时存活率为50％以上，大大提高了菌体冻干存活率及后期菌粉稳定性，本发明的冻干保护剂成分均为常用食品添加剂，且来源广泛，本发明的保护剂制备和使用方法简单、操作难度小，出错了率低，适用于工业化生产。
本发明中的冻干保护剂成分及配比经过大量试验筛选并优化，冷冻干燥条件也经过多项试验并进行改进，与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明冻干保护剂减少了冷冻干燥过程对菌体的伤害，提高了乳双歧杆菌菌体存活率。
(2)采用本发明保护剂及使用方法得到菌粉活菌数高，后期稳定好，常温保藏一年时存活率为50％以上。
(3)本发明提供的冻干保护剂得到的冻干菌粉硬度适中，粉碎操作简单，同时保护剂成分均为无毒无害类，且满足药品生产要求，得到的菌粉可应用的医疗保健领域，市场潜力巨大。
附图说明
图1，不同菌粉菌体存活率随时间变化趋势图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
本实施例设置6组实验：对照组、实验组1、实验组2、实验组3、实验组4、实验组5。将表1所示的不同保护剂分别采用本发明所述的保护剂制备和使用方法，与菌泥进行混合后，进行同条件冷冻干燥，通过检测菌泥质量M1(g)、菌泥活菌数C0(亿cfu/g)、冻干菌粉质量 M(g)、冻干菌粉活菌数C(亿cfu/g)，从而得到菌体冻干存活率X。
X＝C*M/(C0*M1)*100％
1、按照表1的乳双歧杆菌冷冻干燥保护剂配方制备各实验组的保护剂：将维生素C溶解于适量的水中，用0.22μm的滤膜过滤除菌后，得到溶液A；再用余量的水溶解海藻糖、麦芽糊精、蔗糖、甘油、L-精氨酸，搅拌均匀后，115℃灭菌20min，降温后得到溶液B；将溶液A和溶液B混合均匀后得到完整的保护剂，取样检测固形物含量，存于4℃备用。
2、乳双歧杆菌经过发酵培养后，离心收集菌泥。将离心收集的菌泥取样检测活菌数后选取50g，并分别与各实验组配方冻干保护剂按照质量比1:1混合均匀，置于冷冻干燥机内，-40℃预冻2h，再于10Pa条件下4h升温至-10℃冷冻干燥15h，后于20Pa条件下2h升温至25℃冷冻干燥10h，即可得到乳双歧杆菌冻干菌粉，称量菌粉质量并取样检测活菌数。
表1不同保护剂配方对菌体冻干存活率的影响
由上述结果可以看出，对照组只添加无菌水时，菌粉活菌数为5300亿cfu/g，但相比其他实验组菌粉产量将近减半，乳双歧杆菌的冻干存活率仅为21.2％，说明大部分菌体在冻干过程中失去活性；当将配方中的L-精氨酸替换为常用的谷氨酸钠、L-苏氨酸、赖氨酸时，乳双歧杆菌的冻干存活率明显下降，显著低于添加L-精氨酸实验组，说明保护剂中的L-精氨酸成分对大部分菌体在冻干过程中起到了保护作用；实验组4、5、6为L-精氨酸不同添加量对比实验，当L-精氨酸添加量在0.5％和0.8％时，菌粉活菌数均达到10000亿cfu/g，冻干存活率达到了80％-90％，且显著高于0.2％添加量实验组的75.2％，由此可以说明，L-精氨酸在添加量为0.5％-0.8％时能够显著提高乳双歧杆菌的冻干存活率。
将上述对照组、实验组1、实验组5三组所得的冻干菌粉各取15g，分包为每包3g，各5 包，共计15包真空包装后，同时置于25℃样品柜中保存，于1、3、6、12月各组各取一包检测菌粉活菌数，菌粉活菌数分别除以各组初始活菌数即得出存活率，结果见图1。
通过图1可以看出，对照组以添加无菌水代替保护剂时，冻干菌粉在储藏1个月时存活率为22.22％，而添加保护剂的实验组1和5分别为53.52％和79.41％，显著高于对照组，说明添加的保护剂能够增加菌粉储藏的稳定性；实验组5的保护剂相比实验组1将谷氨酸钠替换为L-精氨酸，菌粉储藏1个月时存活率为79.41％，较实验组1的53.52％提高了25.89％，且在后续储藏期均明显高于同期的实验组1和对照组，表明乳双歧杆菌在冻干时添加适量的 L-精氨酸能够提高菌粉后期储藏稳定性，且常温下储藏12个月时，菌粉细胞存活率为52.94％，显著高于空白对照组的8.73％。
由此可以说明，添加适量的L-精氨酸作为冻干保护剂能够显著提高乳双歧杆菌冻干菌粉在常温下储藏的稳定性，本发明所采用的乳双歧杆菌冻干保护剂配方能够显著提高乳双歧杆菌冻干菌粉在常温下储藏的稳定性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1. 一种乳双歧杆菌冻干保护剂，其特征在于：包含如下按质量百分比计的成分：海藻糖6%、麦芽糊精8%，蔗糖2%、维生素C 0.02%、甘油3%、L-精氨酸0.5%，余量为水。
2.权利要求1所述的乳双歧杆菌冻干保护剂的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：维生素C溶解于适量的水中，用滤膜过滤除菌后，得到溶液A；再用余量的水溶解海藻糖、麦芽糊精、蔗糖、甘油、L-精氨酸，搅拌均匀后灭菌，得到溶液B；将溶液A和溶液B混合均匀后得到乳双歧杆菌冻干保护剂。
3.根据权利要求2所述的乳双歧杆菌冻干保护剂的制备方法，其特征在于：所述的滤膜为0.22μm的滤膜。
4.根据权利要求2所述的乳双歧杆菌冻干保护剂的制备方法，其特征在于：所述的灭菌的条件为115℃灭菌20min。
5.权利要求1所述的乳双歧杆菌冻干保护剂的使用方法，其特征在于：包括如下步骤：将离心收集的菌泥与冻干保护剂混合均匀，冷冻干燥后，得到乳双歧杆菌菌粉。
6.根据权利要求5所述的乳双歧杆菌冻干保护剂的使用方法，其特征在于：包括如下步骤：将离心收集的菌泥与冻干保护剂按照质量比1:1～2混合均匀，置于冷冻干燥机内，-40℃～50℃预冻2-3h，再于10-20Pa条件下2-4h升温至-10℃～-15℃冷冻干燥10-15h，后于10-20Pa条件下2-4h升温至20℃～25℃冷冻干燥10-15h，得到乳双歧杆菌菌粉。
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