CN114645004B - 一种保持功效递送的动物双歧杆菌乳亚种菌剂的制备方法 - Google Patents

一种保持功效递送的动物双歧杆菌乳亚种菌剂的制备方法 Download PDF

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CN114645004B CN202210531928.7A CN202210531928A CN114645004B CN 114645004 B CN114645004 B CN 114645004B CN 202210531928 A CN202210531928 A CN 202210531928A CN 114645004 B CN114645004 B CN 114645004B
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Abstract

本发明提供一种保持功效递送的动物双歧杆菌乳亚种菌剂的制备方法。所述制备方法包括以下步骤：（1）将保护剂和生长特定时期的动物双歧杆菌乳亚种菌体混合，得到乳化液；（2）将乳化液和包埋壁材混合，进行微包埋处理，得到包埋混合物；（3）将包埋混合物进行静电喷雾干燥，得到所述保持功效递送的动物双歧杆菌乳亚种菌剂。本发明所述制备方法能够显著减少工艺生产过程对菌体细胞造成的损伤，使菌体的活性得到保持，精准在肠道进行释放，在贮存保质期内仍能保持益生菌的功效性，适合工业化生产。

Description

一种保持功效递送的动物双歧杆菌乳亚种菌剂的制备方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种保持功效递送的动物双歧杆菌乳亚种菌剂的制备方法。
背景技术
乳酸菌是人和动物肠道中重要的生理菌群之一，通过定殖在肠道内，具有维持肠道内菌群平衡，缓解便秘腹泻，提高免疫力，促进营养物质吸收等多种功能。
乳酸菌在生产、贮存、使用等过程中，都会对其菌体活性造成一定的影响，从而影响其功效性；若要使菌体的功效能更高效的递送，更长久的保持，在保持原有菌种不变的情况下，则需要从生产工艺方面，收集活性较高的菌体，同时对其菌体进行保护剂包埋处理，采用对菌体损伤最小的干燥方式来保证菌体的活性，最后在贮存过程中，保持菌体在最适的环境下保存，使用时菌体能耐受胃酸、胆盐，使其顺利通过胃酸到达肠道，同时能在肠道内快速崩解释放使其能顺利到达肠道精准释放发挥其功效。
目前，有很多研究报道了乳酸菌的各种益生功能、功效，基本都是在菌体制备出来后，短期内对其功能性进行研究，而且大部分都是低温（-18℃以下）长期保存，得到较好的功能性效果，而随着菌体在贮存过程中的菌体活性发生变化，长期贮存下其功能性会大大降低。
CN103749672A公开了一种含有双歧杆菌包埋珠或包埋块的酸乳及其制备方法，步骤F、添加保护剂，将离心收集的菌体悬浮于离心前发酵罐培养液原体积1/100-1/10的保护剂中；在零下20℃~10℃的温度下贮存备用；G、双歧杆菌的包埋：将悬浮于保护剂中双歧杆菌菌体与灭菌包埋材料溶液混合，搅拌均匀后，挤入固化剂，慢速搅拌5-30 min，过滤，用无菌水洗涤，即得双歧杆菌包埋珠或包埋块；该发明虽然通过添加保护剂和包埋的方式一定程度上提高了贮存性能，但仍然无法实现常温或储存期限较长情况下的保存，且未说明其贮存保质期内益生菌功效递送保持情况。
CN108220193A公开了一株动物双歧杆菌乳亚种、一种动物双歧杆菌乳亚种冻干粉及其制备方法，所述动物双歧杆菌乳亚种冻干粉的方法，所述方法在厌氧环境下进行包埋冻干处理，并且在冻干处理前分步骤使用多种抗氧剂对所述动物双歧杆菌乳亚种进行包埋处理，有效防止氧气与所述动物双歧杆菌乳亚种细胞膜系统的相互作用，从而阻止损害DNA合成的行为，并且能够清除在菌株冻干前产生的自由基，从而预防干燥过程中的氧化损伤，并使所述动物双歧杆菌乳亚种在常温贮藏条件下不易失活。但根据其给出的数据显示其最佳条件下制备得到的冻干粉在常温贮藏6个月后，活菌存活率就降低至52.361%，显然其在常温或储存期限较长情况下的保存能力仍有待提高，且同样未说明其在贮存保质期内益生菌功效递送保持情况。
因此，如何更好的保持其菌株功效递送及其在贮存过程中的功能性，已成为亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种保持功效递送的动物双歧杆菌乳亚种菌剂的制备方法。所述制备方法通过收集益生菌生长的特定时期的菌体，对其进行微包埋处理，采用低温静电喷雾干燥的制备方法，得到高活性的益生菌，采用特定包装贮存，在肠道中进行定向释放，贮存两年后仍能有效保持益生菌的功能性递送；且所述制备方法能够减少工艺生产过程对菌体细胞造成的损伤，使菌体的活性得到保持，精准在肠道进行释放，最终保持了益生菌的功效性。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种保持功效递送的动物双歧杆菌乳亚种菌剂的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
（1）将保护剂和生长特定时期的动物双歧杆菌乳亚种菌体混合，得到乳化液；
所述特定时期为菌体生长对数期后期和/或稳定期初期；所述保护剂包括组分一、组分二和组分三，所述组分一包括海藻糖、甜菜碱和山梨糖醇，所述组分二包括大豆卵磷脂，所述组分三包括邻苯二甲酸二丁酯、大豆蛋白和羟乙基淀粉，且所述组分一、组分二和组分三分顺序加入到菌体中；
（2）将步骤（1）得到的乳化液和包埋壁材混合，进行微包埋处理，得到包埋混合物；
（3）将步骤（2）得到的包埋混合物进行静电喷雾干燥，得到所述保持功效递送的动物双歧杆菌乳亚种菌剂。
在本发明中，首先，通过收集菌体生长对数期后期和/或稳定期初期的菌体与保护剂进行混合，快速及时的对其进行处理，以保证菌体的活性处于最佳状态；其次，对菌体进行保护剂有一定的添加顺序添加更好地对菌体形成保护，其中，保护剂中的小分子物质：海藻糖能保证菌体在干燥过程中失水提供相应的氢键，保证菌体的正常结构稳定，甜菜碱及山梨糖醇用于维持菌体细胞内外的渗透压平衡，从细胞内发挥作用；添加的大豆卵磷脂为于维持菌体细胞膜的流动性，保持菌体细胞在干燥过程中细胞膜的功能性完整，从细胞膜上发挥作用；添加的大豆蛋白、羟乙基淀粉两种大分子物质包裹在菌体表面，同时添加邻苯二甲酸二丁酯增强大大分子物质的在菌体表面包裹的紧密程度，同时其也具有抗氧化性，隔绝氧气，降低菌体对外界环境的敏感程度。再次，添加及微包埋处理（通过美拉德反应形成包埋壁材，美拉德反应产物在胃肠道内很难被消化吸收，所以可以作为益生元在肠道内被利用，从而达到益生的效果），提升菌体的耐酸耐胆盐及对外界不良环境的抗逆性，同时能在肠道内精准释放。最后，采用低温静电喷雾干燥，降低了菌体因高温（常规喷雾干燥180-200℃）或者低温（冷冻干燥-50~-45℃）对其菌体造成的损伤。
在本发明中，所述生长特定时期的动物双歧杆菌乳亚种菌体由以下步骤制备得到：
（a）将动物双歧杆菌乳亚种接种至MRS固体培养基中，在36-38℃（例如可以是36℃、36.5℃、37℃、37.5℃、38℃等）下厌氧培养48-72 h（例如可以是48 h、50 h、52 h、54 h、56 h、58 h、60 h、62 h、64 h、66 h、68 h、70 h、72 h等）得到单菌落，再将所述单菌落接种至MRS液体培养基中，在36-38℃（例如可以是36℃、36.5℃、37℃、37.5℃、38℃等）下活化培养9-12 h，得到活化2代后的菌液；
（b）将步骤（a）得到的菌液以0.5-5 vol%（例如可以是0.5 vol%、1 vol%、1.5vol%、2 vol%、2.5 vol%、3 vol%、3.5 vol%、4 vol%、4.5 vol%、5 vol%等）的接种量接种至MRS液体培养基中，在36-38℃（例如可以是36℃、36.5℃、37℃、37.5℃、38℃等）下厌氧培养，所述厌氧培养的过程中通过在线光密度检测仪和在线活细胞检测仪对菌体的光密度及菌体活性进行直接在线检测，直至菌体生长对数期后期和/或稳定期初期，收集得到菌体。
在本发明中，通过在线光密度检测仪及在线活细胞测试仪进行实时在线检测，能及时准确的反应培养过程中菌体的生长状态，快速及时的对其进行处理，以保证菌体的活性处于最佳状态。
在本发明中，步骤（b）中，所述直至菌体生长对数期后期和/或稳定期初期所需时间为10 h以上，例如可以是10 h、10.5 h、11 h、11.5 h、12 h等。
在本发明中，步骤（b）中，所述收集的具体步骤为：将菌液以6500-8000 rpm（例如可以是6500 rpm、7000 rpm、7500 rpm、7500 rpm、8000 rpm等）、3-5℃（例如可以是3℃、3.5℃、4℃、4.5℃、5℃等）的条件下离心10-20 min（例如可以是10 min、12 min、14 min、16min、18 min、20 min等），弃去上清液，采用无菌生理盐水清洗菌体2次以上（2次、3次、4次等）后，再将混合液以6500-8000 rpm（例如可以是6500 rpm、7000 rpm、7500 rpm、7500rpm、8000 rpm等）、3-5℃（例如可以是3℃、3.5℃、4℃、4.5℃、5℃等）的条件下离心10-20min（例如可以是10 min、12 min、14 min、16 min、18 min、20 min等），得到生长的特定时期的动物双歧杆菌乳亚种菌体。
在本发明中，步骤（1）中，所述保护剂按照一定的添加顺序加入到菌体中，所述添加顺序包括：组分一组分二组分三、组分二组分一组分三、组分一组分三组分二中的任意一种。
其中，顺序为组分一组分二组分三指的是：向菌体中先加入组分一混匀、再加入组分二混匀、最后加入组分三混匀。其中，顺序为组分二组分一组分三指的是：向菌体中先加入组分二混匀、再加入组分一混匀、最后加入组分三混匀。其中，顺序为组分一组分三组分二指的是：向菌体中先加入组分一混匀、再加入组分三混匀、最后加入组分二混匀。优选地，所述最佳保护剂添加顺序为组分一组分二组分三，即先添加组分一再添加组分二最后添加组分三，得到乳化液。
其中，步骤（1）中，所述保护剂中的各组分在搅拌下加入，所述搅拌的转速为300-600 rpm，例如可以是300 rpm、350 rpm、400 rpm、450 rpm、500 rpm、550 rpm、600 rpm等，且每加入一个组分所需搅拌的时间各自独立地为2-8 min，例如可以是2 min、3 min、4min、5 min、6 min、7 min、8 min等。
在本发明中，步骤（1）中，所述菌体、组分一、组分二和组分三的质量比为1:(0.1-0.4):(0.2-0.5):(0.2-0.5)，例如可以是1:0.1:0.2:0.2、1:0.2:0.2:0.2、1:0.3:0.2:0.2、1:0.4:0.2:0.2、1:0.1:0.2:0.2、1:0.2:0.3:0.2、1:0.3:0.4:0.2、1:0.4:0.5:0.2、1:0.1:0.2:0.3、1:0.3:0.2:0.4、1:0.4:0.2:0.5等。
优选地，所述组分一按质量百分含量计由以下组分组成：海藻糖10-25%、甜菜碱0.1-1%和山梨糖醇0.5-5%，余量为水。
以组分一的质量百分含量为100%计，所述海藻糖的添加量为10-25%，例如可以是10%、12%、14%、16%、18%、20%、22%、24%、25%等。
以组分一的质量百分含量为100%计，所述甜菜碱的添加量为0.1-1%，例如可以是0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%等。
以组分一的质量百分含量为100%计，所述山梨糖醇的添加量为0.5-5%，例如可以是0.5%、0.7%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%等。
优选地，所述组分二按质量百分含量计由以下组分组成：大豆卵磷脂0.5-2%，余量为水。
以组分二的质量百分含量为100%计，所述大豆卵磷脂的添加量为0.5-2%，例如可以是0.5%、0.6%、0.8%、1%、1.2%、1.5%、1.8%、2%等。
优选地，所述组分三按质量百分含量计由以下组分组成：邻苯二甲酸二丁酯0.1-1%、大豆蛋白5-10%和羟乙基淀粉1-5%，余量为水。
以组分三的质量百分含量为100%计，所述邻苯二甲酸二丁酯的添加量为0.1-1%，例如可以是0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%等。
以组分三的质量百分含量为100%计，所述大豆蛋白的添加量为5-10%，例如可以是5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%、10%等。
以组分三的质量百分含量为100%计，所述羟乙基淀粉的添加量为1-5%，例如可以是1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%等。
在本发明中，步骤（2）中，所述乳化液和包埋壁材的质量比为1:(1-3)，例如可以是1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3等。
在本发明中，所述包埋壁材选自酪朊酸钠、蛋白胨、低聚果糖、菊粉、低聚异麦芽糖、葡萄糖或蔗糖中的任意一种或至少两种的组合。
以所述包埋壁材的质量为100%计，所述酪朊酸钠的含量为5-15%，例如可以是5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%等。
以所述包埋壁材的质量为100%计，所述蛋白胨的含量为5-20%，例如可以是5%、6%、8%、10%、12%、14%、16%、18%、20%等。
以所述包埋壁材的质量为100%计，所述低聚果糖的含量为5-20%，例如可以是5%、6%、8%、10%、12%、14%、16%、18%、20%等。
以所述包埋壁材的质量为100%计，所述菊粉的含量为1-10%，例如可以是1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%等。
以所述包埋壁材的质量为100%计，所述低聚异麦芽糖的含量为2-15%，例如可以是2%、4%、6%、8%、10%、12%、15%等。
以所述包埋壁材的质量为100%计，所述葡萄糖的含量为3-10%，例如可以是3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%等。
以所述包埋壁材的质量为100%计，所述蔗糖的含量为5-20%，例如可以是5%、6%、8%、10%、12%、14%、16%、18%、20%等。
优选地，所述包埋壁材按质量百分含量计由以下组分组成：酪朊酸钠5-15%（例如可以是5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%等）和低聚果糖5-20%（例如可以是5%、6%、8%、10%、12%、14%、16%、18%、20%等），余量为水。
优选地，所述低聚果糖的分子量为100-500 g/mol，例如可以是100 g/mol、120 g/mol、140 g/mol、160 g/mol、180 g/mol、200 g/mol、250 g/mol、300 g/mol、350 g/mol、400g/mol、450 g/mol、500 g/mol等。
优选地，所述低聚异麦芽糖的分子量为300-500 g/mol，例如可以是300 g/mol、320 g/mol、340 g/mol、360 g/mol、380 g/mol、400 g/mol、420 g/mol、440 g/mol、460 g/mol、480 g/mol、500 g/mol等。
优选地，在步骤（2）乳化液和包埋壁材混合前，所述包埋壁材还需调节pH至7-9，例如可以是7、7.5、7.8、8、8.2、8.5、9等，优选为8。
优选地，在步骤（2）乳化液和包埋壁材混合前，所述包埋壁材还需进行灭菌处理，所述灭菌条的件为90-121℃（例如可以是90℃、95℃、100℃、105℃、110℃、115℃、120℃、121℃等）灭菌10-60 min（例如可以是10 min、15 min、20 min、25 min、30 min、35 min、40min、45 min、50 min、55 min、60 min等。）
在本发明中，步骤（2）中，所述微包埋处理在搅拌下进行，所述搅拌的转速为400-600 rpm，例如可以是400 rpm、450 rpm、500 rpm、550 rpm、600 rpm等，所述搅拌的时间为10-15 min，例如可以是10 min、11 min、12 min、13 min、14 min、15 min等。
在本发明中，步骤（3）中，所述静电喷雾干燥采用喷嘴式喷雾干燥器进行，具体条件参数为：进风温度为40-60℃（例如可以是40℃、45℃、50℃、55℃、60℃等），进风流量为15-25 Nm3/h（例如可以是15 Nm3/h、16 Nm3/h、18 Nm3/h、20 Nm3/h、22 Nm3/h、25 Nm3/h等），出风温度为20-30℃（例如可以是20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃等），雾化温度为30-46℃（例如可以是30℃、35℃、40℃、42℃、44℃、46℃等），雾化压力为100-350 kPa（例如可以是100 kPa、150 kPa、200 kPa、250 kPa、300 kPa、350 kPa等），静电电压为15-30 kV（例如可以是15 kV、16 kV、18 kV、20 kV、22 kV、25 kV、28 kV、30 kV等）。
在本发明中，步骤（3）中，所述保持功效递送的动物双歧杆菌乳亚种菌剂采用铝薄袋进行抽真空贮存。
通过以上方法制备的益生菌菌粉，贮存两年仍能保持其初始的功效。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
（1）本发明通过在线光密度检测仪及在线活细胞测试仪进行实时在线检测，能及时准确的反应培养过程中菌体的生长状态，快速及时的对其进行处理，以保证菌体的活性处于最佳状态；
（2）本发明通过以特定顺序添加保护剂的方式以及特定的保护剂配方进一步提升了菌体的贮存存活率，使其能在常温条件进行贮存两年以上仍能保持其初始的功效；
（3）本发明通过微包埋处理的方式提升菌体的耐酸耐胆盐及对外界不良环境的抗逆性，同时能在肠道内精准释放；
（4）本发明通过低温静电喷雾干燥，降低了菌体因高温或者低温干燥对其菌体造成的损伤；并采用真空铝薄袋进行包装贮存，进一步隔绝了菌体与氧气的接触，进一步提升了菌体的贮存存活率，同时能在常温条件进行贮存。
附图说明
图1为制备例1提供的OD值与在线光密度检测线性关系图。
图2为制备例1提供的活菌数与在线活细胞检测线性关系图。
图3为制备例1提供的动物双歧杆菌乳亚种在线检测结果图。
图4为动物双歧杆菌乳亚种菌剂对小鼠便秘的效果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
应当说明的是，下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
I. 本发明采用的动物双歧杆菌乳亚种为动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalissubsp.lactis BLa80菌株，保藏编号为CGMCC No.15410，保藏日期为2018年03月05日；保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
II. 本发明采用的常见试剂的配方如下，在后续实施例中不再赘述。
① MRS培养基：将蛋白胨10.00 g、牛肉膏10.00 g、酵母膏5.00 g、柠檬酸氢二铵2.00 g、葡萄糖20.00 g、吐温-80 1 mL、磷酸氢二钾2.00 g、硫酸锰0.58 g和硫酸镁0.28 g溶于1 L蒸馏水，调节pH值至6.4。② MRS固体培养基：在MRS液体培养基的基础上添加2wt%琼脂粉。
制备例1
本制备例提供一种动物双歧杆菌乳亚种菌体的制备方法，所述动物双歧杆菌乳亚种菌体的制备方法包括以下步骤：
（a）将动物双歧杆菌乳亚种BLa80划线接种至MRS固体培养基中，在37℃条件下厌氧培养60 h得到单菌落，将制备得到的单菌落接种至MRS液体培养基中，在37℃条件下培养10 h进行活化，得到活化2代后的菌液；
（b）将活化2代后的菌液以2%（v/v）的接种量接种至1 L的MRS液体培养基中，振荡混匀后于厌氧培养箱中37℃培养，过程中通过在线光密度检测仪及在线活细胞检测仪，对菌体的光密度及菌体活性进行直接在线检测（其中，图1为OD值与在线光密度检测线性关系图，y=3.3644x-1.1088，R2=0.9992；图2为活菌数与在线活细胞检测线性关系图，y=0.019x-0.005，R2=0.9968），至对数期后期稳定期初期10 h（如图3），使菌体处于生长较为旺盛、活性较高的状态能及时进行处理，在7500 rpm，4℃的条件下离心15 min，去上清液后，用无菌生理盐水进行清洗2次，同样以在7500 rpm，4℃的条件下离心15 min，去上清液后备用，制成动物双歧杆菌乳亚种菌体备用。
对比制备例1
本制备例提供一种动物双歧杆菌乳亚种菌体的制备方法，所述动物双歧杆菌乳亚种菌体的制备方法包括以下步骤：
（a）将动物双歧杆菌乳亚种BLa80划线接种至MRS固体培养基中，在37℃条件下厌氧培养60 h得到单菌落，将制备得到的单菌落接种至MRS液体培养基中，在37℃条件下培养10 h进行活化，得到活化2代后的菌液；
（b）将活化2代后的菌液以2%（v/v）的接种量接种至1 L的MRS液体培养基中，振荡混匀后于厌氧培养箱中37℃培养8 h后，在7500 rpm，4℃的条件下离心15 min，去上清液后，用无菌生理盐水进行清洗2次，同样以在7500 rpm，4℃的条件下离心15 min，去上清液后备用，制成动物双歧杆菌乳亚种菌体备用。
对比制备例2
本制备例提供一种动物双歧杆菌乳亚种菌体的制备方法，所述动物双歧杆菌乳亚种菌体的制备方法包括以下步骤：
（a）将动物双歧杆菌乳亚种BLa80划线接种至MRS固体培养基中，在37℃条件下厌氧培养60 h得到单菌落，将制备得到的单菌落接种至MRS液体培养基中，在37℃条件下培养10 h进行活化，得到活化2代后的菌液；
（b）将活化2代后的菌液以2%（v/v）的接种量接种至1 L的MRS液体培养基中，振荡混匀后于厌氧培养箱中37℃培养24 h后，在7500 rpm，4℃的条件下离心15 min，去上清液后，用无菌生理盐水进行清洗2次，同样以在7500 rpm，4℃的条件下离心15 min，去上清液后备用，制成动物双歧杆菌乳亚种菌体备用。
实施例1
本实施例提供一种保持功效递送的动物双歧杆菌乳亚种菌剂的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
（1）向制备例1提供的动物双歧杆菌乳亚种菌体中先加入组分一，以500 rpm的转速混合搅拌5 min；再添加组分二以500 rpm的转速混合搅拌5 min；最后加入组分三以500rpm的转速混合搅拌5 min，得到乳化液；
其中，菌体、组分一、组分二和组分三的质量比为1:0.3:0.3:0.4；组分一按质量百分含量计由以下组分组成：海藻糖20%、甜菜碱0.5%、山梨糖醇2%，余量为水；组分二按质量百分含量计由以下组分组成：大豆卵磷脂1%，余量为水；组分三按质量百分含量计由以下组分组成：邻苯二甲酸二丁酯0.5%、大豆蛋白8%、羟乙基淀粉3%，余量为水；
（2）将步骤（1）得到的乳化液和包埋壁材混合，以500 rpm的转速搅拌10 min完成微包埋处理，得到包埋混合物；
其中，所述乳化液和包埋壁材的质量比为1:1，所述包埋壁材按质量百分含量计由以下组分组成：酪朊酸钠10%和低聚果糖（分子量为180 g/mol）15%，余量为水；pH 8.0，灭菌条件：115℃灭菌40 min；
（3）将步骤（2）得到的包埋混合物进行静电喷雾干燥，得到所述保持功效递送的动物双歧杆菌乳亚种菌剂，最后采用铝薄袋进行抽真空贮存；
其中，干燥条件为：进风温度为50℃，进风流量为20 Nm3/h，出风温度25℃，雾化温度为40℃，雾化压力为250 kPa，静电电压20 kV。
实施例2
本实施例提供一种保持功效递送的动物双歧杆菌乳亚种菌剂的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
（1）向制备例1提供的动物双歧杆菌乳亚种菌体中先加入组分一，以500 rpm的转速混合搅拌4 min；再添加组分二以500 rpm的转速混合搅拌5 min；最后加入组分三以500rpm的转速混合搅拌3 min，得到乳化液；
其中，菌体、组分一、组分二和组分三的质量比为1:0.3:0.3:0.4；组分一按质量百分含量计由以下组分组成：海藻糖10%、甜菜碱1%、山梨糖醇5%，余量为水；组分二按质量百分含量计由以下组分组成：大豆卵磷脂0.5%，余量为水；组分三按质量百分含量计由以下组分组成：邻苯二甲酸二丁酯1%、大豆蛋白10%、羟乙基淀粉1%，余量为水；
（2）将步骤（1）得到的乳化液和包埋壁材混合，以500 rpm的转速搅拌15 min完成微包埋处理，得到包埋混合物；
其中，所述乳化液和包埋壁材的质量比为1:1，所述包埋壁材按质量百分含量计由以下组分组成：酪朊酸钠10%和低聚果糖（分子量为180 g/mol）15%，余量为水；pH 8.0，灭菌条件：115℃灭菌40 min；
（3）将步骤（2）得到的包埋混合物进行静电喷雾干燥，得到所述保持功效递送的动物双歧杆菌乳亚种菌剂，最后采用铝薄袋进行抽真空贮存；
其中，干燥条件为：进风温度为50℃，进风流量为20 Nm3/h，出风温度25℃，雾化温度为40℃，雾化压力为250 kPa，静电电压20 kV。
实施例3
本实施例提供一种保持功效递送的动物双歧杆菌乳亚种菌剂的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
（1）向制备例1提供的动物双歧杆菌乳亚种菌体中先加入组分一，以500 rpm的转速混合搅拌6 min；再添加组分二以500 rpm的转速混合搅拌4 min；最后加入组分三以500rpm的转速混合搅拌3 min，得到乳化液；
其中，菌体、组分一、组分二和组分三的质量比为1:0.3:0.3:0.4；组分一按质量百分含量计由以下组分组成：海藻糖25%、甜菜碱0.1%、山梨糖醇0.5%，余量为水；组分二按质量百分含量计由以下组分组成：大豆卵磷脂2%，余量为水；组分三按质量百分含量计由以下组分组成：邻苯二甲酸二丁酯0.1%、大豆蛋白5%、羟乙基淀粉5%，余量为水；
（2）将步骤（1）得到的乳化液和包埋壁材混合，以500 rpm的转速搅拌15 min完成微包埋处理，得到包埋混合物；
其中，所述乳化液和包埋壁材的质量比为1:1，所述包埋壁材按质量百分含量计由以下组分组成：酪朊酸钠10%和低聚果糖（分子量为180 g/mol）15%，余量为水；pH 8.0，灭菌条件：115℃灭菌40 min；
（3）将步骤（2）得到的包埋混合物进行静电喷雾干燥，得到所述保持功效递送的动物双歧杆菌乳亚种菌剂，最后采用铝薄袋进行抽真空贮存；
其中，干燥条件为：进风温度为50℃，进风流量为20 Nm3/h，出风温度25℃，雾化温度为40℃，雾化压力为250 kPa，静电电压20 kV。
实施例4
本实施例提供一种保持功效递送的动物双歧杆菌乳亚种菌剂的制备方法，与实施例1的区别仅在于，保护剂中各组分的加料顺序不同：先加入组分一，以500 rpm的转速混合搅拌5 min；再添加组分三以500 rpm的转速混合搅拌5 min；最后加入组分二以500 rpm的转速混合搅拌5 min，得到乳化液。
实施例5
本实施例提供一种保持功效递送的动物双歧杆菌乳亚种菌剂的制备方法，与实施例1的区别仅在于，保护剂中各组分的加料顺序不同：先加入组分二，以500 rpm的转速混合搅拌5 min；再添加组分一以500 rpm的转速混合搅拌5 min；最后加入组分三以500 rpm的转速混合搅拌5 min，得到乳化液。
实施例6
本实施例提供一种保持功效递送的动物双歧杆菌乳亚种菌剂的制备方法，与实施例1的区别仅在于，保护剂中各组分的加料顺序不同：先加入组分三，以500 rpm的转速混合搅拌5 min；再添加组分一以500 rpm的转速混合搅拌5 min；最后加入组分二以500 rpm的转速混合搅拌5 min，得到乳化液。
实施例7
本实施例提供一种保持功效递送的动物双歧杆菌乳亚种菌剂的制备方法，与实施例1的区别仅在于，保护剂中各组分的加料顺序不同：先加入组分二，以500 rpm的转速混合搅拌5 min；再添加组分三以500 rpm的转速混合搅拌5 min；最后加入组分一以500 rpm的转速混合搅拌5 min，得到乳化液。
实施例8
本实施例提供一种保持功效递送的动物双歧杆菌乳亚种菌剂的制备方法，与实施例1的区别仅在于，步骤（2）中，所述包埋壁材按质量百分含量计由以下组分组成：酪朊酸钠5%和低聚果糖（分子量为180 g/mol）5%，余量为水；灭菌条件：115℃灭菌20 min。
实施例9
本实施例提供一种保持功效递送的动物双歧杆菌乳亚种菌剂的制备方法，与实施例1的区别仅在于，步骤（2）中，所述包埋壁材按质量百分含量计由以下组分组成：酪朊酸钠8%和低聚果糖（分子量为180 g/mol）15%，余量为水；灭菌条件：115℃灭菌20 min。
实施例10
本实施例提供一种保持功效递送的动物双歧杆菌乳亚种菌剂的制备方法，与实施例1的区别仅在于，步骤（2）中，所述包埋壁材按质量百分含量计由以下组分组成：酪朊酸钠10%和低聚果糖（分子量为180 g/mol）20%，余量为水；灭菌条件：115℃灭菌20 min。
实施例11
本实施例提供一种保持功效递送的动物双歧杆菌乳亚种菌剂的制备方法，与实施例1的区别仅在于，步骤（2）中，所述包埋壁材按质量百分含量计由以下组分组成：酪朊酸钠10%和低聚果糖（分子量为180 g/mol）5%，余量为水；灭菌条件：115℃灭菌20 min。
实施例12
本实施例提供一种保持功效递送的动物双歧杆菌乳亚种菌剂的制备方法，与实施例1的区别仅在于，步骤（2）中，所述包埋壁材按质量百分含量计由以下组分组成：酪朊酸钠10%和低聚果糖（分子量为180 g/mol）15%，余量为水；灭菌条件：115℃灭菌20 min。
实施例13
本实施例提供一种保持功效递送的动物双歧杆菌乳亚种菌剂的制备方法，与实施例1的区别仅在于，步骤（2）中，所述包埋壁材按质量百分含量计由以下组分组成：酪朊酸钠10%和低聚果糖（分子量为180 g/mol）15%，余量为水；灭菌条件：115℃灭菌10 min。
实施例14
本实施例提供一种保持功效递送的动物双歧杆菌乳亚种菌剂的制备方法，与实施例1的区别仅在于，步骤（2）中，所述包埋壁材按质量百分含量计由以下组分组成：酪朊酸钠10%和低聚果糖（分子量为180 g/mol）15%，余量为水；灭菌条件：115℃灭菌60 min。
实施例15
本实施例提供一种保持功效递送的动物双歧杆菌乳亚种菌剂的制备方法，与实施例1的区别仅在于，与实施例1的区别仅在于，所述包埋壁材中不添加酪朊酸钠，低聚果糖（分子量为180 g/mol）含量增至20%。
实施例16
本实施例提供一种保持功效递送的动物双歧杆菌乳亚种菌剂的制备方法，与实施例1的区别仅在于，与实施例1的区别仅在于，所述包埋壁材中不添加低聚果糖（分子量为180 g/mol），酪朊酸钠含量增至20%。
对比例1
本对比例提供一种动物双歧杆菌乳亚种菌剂的制备方法，与实施例1的区别仅在于，将步骤（1）中，制备例1提供的动物双歧杆菌乳亚种菌体中替换为等质量的对比制备例1提供的动物双歧杆菌乳亚种菌体。
对比例2
本对比例提供一种动物双歧杆菌乳亚种菌剂的制备方法，与实施例1的区别仅在于，将步骤（1）中，制备例1提供的动物双歧杆菌乳亚种菌体中替换为等质量的对比制备例2提供的动物双歧杆菌乳亚种菌体。
对比例3
本对比例提供一种动物双歧杆菌乳亚种菌剂的制备方法，与实施例1的区别仅在于，不添加组分一。
对比例4
本对比例提供一种动物双歧杆菌乳亚种菌剂的制备方法，与实施例1的区别仅在于，不添加组分二。
对比例5
本对比例提供一种动物双歧杆菌乳亚种菌剂的制备方法，与实施例1的区别仅在于，不添加组分三。
对比例6
本对比例提供一种动物双歧杆菌乳亚种菌剂的制备方法，与实施例1的区别仅在于，步骤（1）同时进行添加组分一、组分二和组分三，具体为：先将组分一、组分二和组分三混合，得到保护剂复合液，再将其添加到制备例1提供的动物双歧杆菌乳亚种菌体中，以500rpm的转速混合搅拌20 min，得到乳化液。
对比例7
本对比例提供一种动物双歧杆菌乳亚种菌剂的制备方法，与实施例1的区别仅在于，步骤（1）同时进行添加组分一、组分二，具体为：向制备例1提供的动物双歧杆菌乳亚种菌体中先加入组分一和组分二的复合液，以500 rpm的转速混合搅拌5 min；再加入组分三以500 rpm的转速混合搅拌15 min，得到乳化液。
对比例8
本对比例提供一种动物双歧杆菌乳亚种菌剂的制备方法，与实施例1的区别仅在于，步骤（1）同时进行添加组分二、组分三，具体为：向制备例1提供的动物双歧杆菌乳亚种菌体中先加入组分一，以500 rpm的转速混合搅拌5 min；再添加组分二和组分三的混合液以500 rpm的转速混合搅拌15 min，得到乳化液。
对比例9
本对比例提供一种动物双歧杆菌乳亚种菌剂的制备方法，与实施例1的区别仅在于，组分一按质量百分含量计由以下组分组成：海藻糖20%、邻苯二甲酸二丁酯0.5%，余量为水；组分二按质量百分含量计由以下组分组成：大豆卵磷脂1%、山梨糖醇2%，余量为水；组分三按质量百分含量计由以下组分组成：甜菜碱0.5%、大豆蛋白8%、羟乙基淀粉3%，余量为水；其他制备方法与实施例1完全相同。
对比例10
本对比例提供一种动物双歧杆菌乳亚种菌剂的制备方法，与实施例1的区别仅在于，组分一按质量百分含量计由以下组分组成：海藻糖20%、甜菜碱0.5%、羟乙基淀粉3%、大豆卵磷脂1%，余量为水；组分二按质量百分含量计由以下组分组成：邻苯二甲酸二丁酯0.5%，余量为水；组分三按质量百分含量计由以下组分组成：大豆蛋白8%、山梨糖醇2%，余量为水；其他制备方法与实施例1完全相同。
测试例1
存活率测试
测试样品：实施例1-16提供的动物双歧杆菌乳亚种菌剂和对比例1-10提供的动物 双歧杆菌乳亚种菌剂；测试方法：分别测试上述各组动物双歧杆菌乳亚种菌剂的初始菌粉 活菌数、以及贮存2年结束时菌粉活菌数存活率（%）=
Figure 5139DEST_PATH_IMAGE001
；
其中贮存的具体温度如下表1所示，每组样品测试均测试5次，计算平均值；具体测试结果如表1所示：
表1
Figure 187858DEST_PATH_IMAGE002
由表1测试结果可知，作为本发明优选技术方案实施例1~3制备得到的动物双歧杆菌乳亚种菌剂贮存2年动物双歧杆菌乳亚种的冷冻低温（-18℃）下的存活率能达到96%以上，冷藏低温（4℃）下的存活率能达到87%以上，常温（25℃）下的存活率能达到84%以上。
由实施例1和实施例4~7的对比可知，所述保护剂按照一定的添加顺序加入到菌体中，且所述添加顺序优选为依次添加组分一、组分二、组分三，可以更好地对菌体形成保护，特别地使所述动物双歧杆菌乳亚种菌剂在常温下的存活时限和存活率大大得以提升。
由实施例1和实施例8~14的对比可知，灭菌条件：110-120℃灭菌35-45 min，可以更好地对菌体形成保护，特别地使所述动物双歧杆菌乳亚种菌剂在常温下的存活时限和存活率大大得以提升。
由实施例1和实施例15、16的对比可知，所述包埋壁材包括酪朊酸钠和低聚果糖，余量为水，二者相互配合，具有协同增效的作用，可以更好地对菌体形成保护，特别地使所述动物双歧杆菌乳亚种菌剂在常温下的存活时限和存活率大大得以提升。
由实施例1和对比例1、2的对比可知，对比制备例1培养时间较短，对比制备例2培养时间过长，因此导致提供添加菌体活性较差，继而导致述动物双歧杆菌乳亚种菌剂在各个温度下的存活时限和存活率下降明显。
由实施例1和对比例3~5的对比可知，提供缺少组分一/组分二/组分三中任一种，均无法对菌体形成保护，继而导致述动物双歧杆菌乳亚种菌剂在各个温度下的存活时限和存活率下降明显。
由实施例1和对比例6~8的对比可知，所述组分一、组分二和组分三分顺序加入到菌体中，即任意两组分不能同时加入到菌体中，若同时加入均无法对菌体形成保护，继而导致述动物双歧杆菌乳亚种菌剂在各个温度下的存活时限和存活率下降明显。
由实施例1和对比例9~10的对比可知，本发明所述组分一包括海藻糖、甜菜碱和山梨糖醇，所述组分二包括大豆卵磷脂，所述组分三包括邻苯二甲酸二丁酯、大豆蛋白和羟乙基淀粉，各组分相互配合，具有协同增效的作用，能够显著减少工艺生产过程对菌体细胞造成的损伤，使菌体的活性得到保持。
由此充分说明本发明通过在线光密度检测仪及在线活细胞测试仪进行实时在线检测，能及时准确的反应培养过程中菌体的生长状态，快速及时的对其进行处理，以保证菌体的活性处于最佳状态；同时本发明通过以特定顺序添加保护剂的方式以及特定的保护剂配方进一步提升了菌体的贮存存活率，使其能在常温条件进行贮存两年以上仍能保持其初始的功效。
测试例2
耐胃酸及肠道溶解性测试
测试样品：实施例1-16提供的动物双歧杆菌乳亚种菌剂和对比例1-10提供的动物双歧杆菌乳亚种菌剂；
测试方法：（1）取上述样品制备所得到的动物双歧杆菌乳亚种包埋颗粒各两份，每份1 g，取在25℃贮存第1年、第2年时的包埋颗粒，分别进行胃溶性试验及肠溶性试验，考察其耐胃酸及肠道溶解性；
人工胃液：取胃蛋白酶1.0 g溶于100 mL蒸馏水，用1 mol/L盐酸调节pH值为1.2；人工肠液：取磷酸二氢钾0.68 g溶于100 mL蒸馏水，用1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.8，再加胰酶1 g，加水适量使其溶解，将两液混合后，加水定容至1000 mL；
分别取上述样品动物双歧杆菌乳亚种菌粉微颗粒1 g置于盛有50 mL、pH 1.2人工胃液的三角瓶中，再置于（37±1℃）恒温、转速为150 r/min的摇床上，微胶囊在人工胃液中透光率的变化情况及存活率情况、处理2 h处理液中透光率（OD600）变化情况如表2所示：
表2
Figure 498754DEST_PATH_IMAGE003
由表2测试结果可知，本发明所述动物双歧杆菌乳亚种菌剂在模拟胃液的环境条件下，微胶囊颗粒能耐受胃酸，菌体能保持较高的活性顺利通过胃酸。
（2）取动物双歧杆菌乳亚种菌粉微颗粒1 g置于盛有50 mL、pH6.8的人工肠液的三角瓶中，再置于（37±1℃）恒温、转速为150 r/min的摇床上，考察其微胶囊完全崩解的情况，结果如下表3所示：
表3
Figure 425122DEST_PATH_IMAGE004
由表3测试结果可知，实施例1-3提供的动物双歧杆菌乳亚种菌剂在模拟肠环境中初始状态下35-42 min释放动物双歧杆菌乳亚种，2年后36-44 min释放动物双歧杆菌乳亚种，在肠道中能顺利释放。
测试例3
调节肠道群菌测试
测试样品：实施例1提供的动物双歧杆菌乳亚种菌剂；
测试方法：BALB/c小鼠，SPF级，50只，雄性。检疫合格后，无菌取小鼠粪便进行微生物培养，计算出每克湿便中的菌数。随机分为阴性对照组（灌胃蒸馏水）、乳酸菌胶囊颗粒组，10只/组。各组药组小鼠分别灌胃给予相同剂量，阴性对照组给予生理盐水，1次/天，连续14D。每天观察并记录小鼠的日常情况，每周测量小鼠体重1次，末次给药24h,无菌取小鼠粪便进行微生物培养，计算出每克湿便中的菌数；
具体测试结果（动物双歧杆菌乳亚种微胶囊制剂对小鼠肠道5种菌群数量的影响（lgCFU·g-1，n=10））如下表4所示：
表4
Figure 6538DEST_PATH_IMAGE005
注：“*表示用药组灌胃前后自身比较有显著性差异（p<0.05），“**”表示用药组灌胃前后自身比较有极其显著性差异（p<0.01）
由表4测试结果可知，本发明实施例1提供的动物双歧杆菌乳亚种微胶囊颗粒能增加肠道中的乳杆菌、双歧杆菌的数量，具有调节肠道菌群平衡的作用，贮存不同时间后，其功能性仍然能保持初始所具有的功能性状态。
测试例4
缓解便秘测试
测试样品：实施例1提供的动物双歧杆菌乳亚种菌剂；
测试方法：取6周龄的健康雄性小鼠50只，适应环境1周，随机分为5组：对照组、模型组、动物双歧杆菌乳亚种BLa80（取贮存不同时间段的菌粉1g，加相同的水，制备菌悬液进行动物试验），每组含小鼠10只，灌胃菌悬液的初始剂量为2×109 CFU/mL，每天早上9点开始灌胃，每次0.2 mL。灌胃结束后，将小鼠单只放入垫有吸水纸的笼盒中，收集粪便，稳重即为湿重，烘干至恒重，即为干重，按照如下公式计算粪便含水量。粪便含水量（%）=(粪便湿重-粪便干重)/粪便湿重×100%。
测试结果：连续灌胃20天后，食物的摄入量、饮水量、粪粒数、粪便颗粒重量、粪便水分实验结果如图4所示。由图4可知，动物双歧杆菌乳亚种BLa80组相对于便秘模型组，灌胃动物双歧杆菌乳亚种BLa80后能显著降低粪粒数、提高粪便含水量，其中灌胃动物双歧杆菌乳亚种BLa80后粪便含水量最高可达正常组的96.30%，比便秘模型组提高了52.94%(p<0.01)，粪粒数基本达到正常组的水平，比便秘模型组降低了46.67%（p<0.01）；灌胃动物双歧杆菌乳亚种BLa80后在一定程度上增加了食物的摄入量及饮水量，能够很好地将便秘小鼠恢复至健康水平，具有优良的缓解便秘的效果。同时动物双歧杆菌乳亚种菌剂采用相同的添加重量，但使用贮存不同时间的动物双歧杆菌乳亚种菌剂，结果显示贮存两年，其缓解便秘的效果仍能达到初始的状态，具有良好的贮存功能性递送性能。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的保持功效递送的动物双歧杆菌乳亚种菌剂的制备方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (8)

1.一种保持功效递送的动物双歧杆菌乳亚种菌剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
（1）将保护剂和生长特定时期的动物双歧杆菌乳亚种菌体混合，得到乳化液；
所述生长特定时期为菌体生长对数期后期和/或稳定期初期；所述保护剂包括组分一、组分二和组分三，所述组分一包括海藻糖、甜菜碱和山梨糖醇，所述组分二包括大豆卵磷脂，所述组分三包括邻苯二甲酸二丁酯、大豆蛋白和羟乙基淀粉，且所述组分一、组分二和组分三分顺序加入到菌体中；
（2）将步骤（1）得到的乳化液和包埋壁材混合，进行微包埋处理，得到包埋混合物；
（3）将步骤（2）得到的包埋混合物进行静电喷雾干燥，得到所述保持功效递送的动物双歧杆菌乳亚种菌剂；
步骤（1）中，所述保护剂按照一定的添加顺序加入到菌体中，所述添加顺序为组分一组分二组分三；其中，步骤（1）中，所述保护剂中的各组分在搅拌下加入，所述搅拌的转速为300-600 rpm，且每加入一个组分所需搅拌的时间各自独立地为2-8 min；
步骤（2）中，所述包埋壁材的灭菌条件：110-120℃灭菌35-45 min；所述乳化液和包埋壁材的质量比为1:(1-3)；其中，所述包埋壁材按质量百分含量计由以下组分组成：酪朊酸钠5-15%、低聚果糖5-20%，余量为水。
2.根据权利要求1所述的保持功效递送的动物双歧杆菌乳亚种菌剂的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述生长特定时期的动物双歧杆菌乳亚种菌体由以下步骤制备得到：
（a）将动物双歧杆菌乳亚种接种至MRS固体培养基中，在36-38℃下厌氧培养48-72 h得到单菌落，再将所述单菌落接种至MRS液体培养基中，在36-38℃下活化培养9-12 h，得到活化2代后的菌液；
（b）将步骤（a）得到的菌液以0.5-5 vol%的接种量接种至MRS液体培养基中，在36-38℃下厌氧培养，所述厌氧培养的过程中通过在线光密度检测仪和在线活细胞检测仪对菌体的光密度及菌体活性进行直接在线检测，直至菌体生长对数期后期和/或稳定期初期，收集得到菌体。
3.根据权利要求2所述的保持功效递送的动物双歧杆菌乳亚种菌剂的制备方法，其特征在于，步骤（b）中，所述直至菌体生长对数期后期和/或稳定期初期所需时间为10 h以上。
4.根据权利要求2所述的保持功效递送的动物双歧杆菌乳亚种菌剂的制备方法，其特征在于，步骤（b）中，所述收集的具体步骤为：将菌液以6500-8000 rpm、3-5℃的条件下离心10-20 min，弃去上清液，采用无菌生理盐水清洗菌体2次以上后，再将混合液以6500-8000rpm、3-5℃的条件下离心10-20 min，得到生长的特定时期的动物双歧杆菌乳亚种菌体。
5.根据权利要求1所述的保持功效递送的动物双歧杆菌乳亚种菌剂的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述菌体、组分一、组分二和组分三的质量比为1:(0.1-0.4):(0.2-0.5):(0.2-0.5)；
其中，所述组分一按质量百分含量计由以下组分组成：海藻糖10-25%、甜菜碱0.1-1%、山梨糖醇0.5-5%，余量为水；所述组分二按质量百分含量计由以下组分组成：大豆卵磷脂0.5-2%，余量为水；所述组分三按质量百分含量计由以下组分组成：邻苯二甲酸二丁酯0.1-1%、大豆蛋白5-10%、羟乙基淀粉1-5%，余量为水。
6.根据权利要求1所述的保持功效递送的动物双歧杆菌乳亚种菌剂的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述微包埋处理在搅拌下进行，所述搅拌的转速为400-600 rpm，所述搅拌的时间为10-15 min。
7.根据权利要求1所述的保持功效递送的动物双歧杆菌乳亚种菌剂的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述静电喷雾干燥采用喷嘴式喷雾干燥器进行，具体条件参数为：进风温度为40-60℃，进风流量为15-25 Nm3/h，出风温度为20-30℃，雾化温度为30-46℃，雾化压力为100-350 kPa，静电电压为15-30 kV。
8.根据权利要求1所述的保持功效递送的动物双歧杆菌乳亚种菌剂的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述保持功效递送的动物双歧杆菌乳亚种菌剂采用铝薄袋进行抽真空贮存。
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