CN113230284B - 一种基于多维交联的合生素微囊化制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种基于多维交联的合生素微囊化制剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于多维交联的合生素微囊化制剂及其制备方法和应用，所述制备方法通过微胶囊芯材与外壁交联获得低聚壳聚糖‑褐藻酸交联致密层的合生素微囊化制剂。本发明提供的制备方法制得的多维交联的合生素微囊化制剂克服了壳聚糖‑褐藻酸盐胶囊释放效率差的缺陷，所述基于多维交联的合生素微囊化制剂的益生菌和益生元的载率均超过90%。提高了益生元与益生菌的高效运载和定向释放能力，最大限度发挥了合生素的协同作用优势；解决了钙离子‑褐藻酸盐微胶囊的结构性缺陷，有效提高了益生菌对环境不良因素的耐受能力，有效防止使用与储存过程中益生菌活性的降低；所述合生素微囊化制剂可以有效调节肠道菌群平衡、改善机体免疫力。

Description

一种基于多维交联的合生素微囊化制剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种基于多维交联的合生素微囊化制剂及其制备方法和应用。
背景技术
合生素(Probiotics)是指益生菌(Probiotics)与益生元(Prebiotics)结合使用的生物制剂，其特点是同时发挥益生菌和益生元的作用，能够提高外源性活菌的生存率，延长作用时间；能使外源性活菌以更大的数量到达体内；刺激肠道内外源性及内源性细菌的定植和生长；改善肠道内菌群结构，增加有益菌的代谢；吸附肠道病原菌，对动物起保健作用；诱导肠腔内系统性免疫，改善宿主体质。合生素在营养界中具有很重要的地位，但是关于合生素的应用研究还很少。
现有技术中，微胶囊化合生素制剂报道较少。中国专利文献CN108606329A公开了一种益生元、益生菌复合微生态制剂及其制备方法。该发明将开菲尔粒与枯草芽孢杆菌按照3∶1比例混合发酵培养，添加益生元，同时加入甘油作等保护剂，混合均匀后进行低温喷雾干燥制得微生态制剂。但用该方法制备的微胶囊囊壁致密性不好，影响产品的质量及货架期；并且包埋率低，芯材可能粘附在微胶囊颗粒的表面从而影响产品的质量，所得微生态制剂不能有效抵御胃酸侵蚀、避免胆汁破坏，定向缓释控释效果欠佳，对调节肠道菌群的作用欠佳。中国专利文献CN105595359A公开了一种缓释微囊益生菌及其制备方法；该发明定位缓释微囊益生菌由内至外依次包括菌体层、酸性包埋吸附层以及复合离子层；菌体层包括益生菌和益生元，酸性包埋吸附层包括酸性物质，复合离子层包括碱性物质；该发明采用酸性和碱性物质，它们会与益生菌接触，从而会影响益生菌的生物活性，从而影响益生菌的包埋效果。CN104435283B本发明公开了一种添加益生元的益生菌微胶囊，该发明采用海藻酸钠与大豆蛋白或乳清蛋白为壁材，可以提高益生菌对胃酸等的耐受能力，大大提高进入肠道的活菌数。但发明采用CaCl2为交联剂，实质上通过海藻酸钙网状结构形成隔绝层，但钙离子-藻酸盐网状结构的多孔性会导致消化液渗入微胶囊内部或菌体泄露，从而造成益生菌的活性损失。为此，CN109674061A提供一种双层微囊化的益生元、益生菌组合物及其制备方法，该发明增加一层聚-L-精氨酸及益生元为内壁材为益生菌提供双重保护，有效防止使用及储存过程中益生菌活性的降低，最大限度保持组合物的稳定性、活性和有效定植率。但该发明仍未克服微胶囊在模拟胃液中崩解的现象，对益生菌保护作用有限；且亦未克服钙离子-藻酸盐网状结构缺陷，内壁材与芯材以及外壁材之间不存在化学交联，降低了微胶囊稳定性。此外，合生素发挥其优势作用效果的前提是益生菌和益生元的同时作用，当前报道的技术方案均以益生菌的包埋和释放为重点，忽略了另一重要成分——益生元的包埋与释放效率。同时，益生元能发挥其作用的前提是其在肠中被释放，才能与益生菌协同发挥作用。
发明内容
针对上述技术问题，本发明提供了一种基于多维交联的合生素微囊化制剂及其制备方法和应用。
为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种基于多维交联的合生素微囊化制剂，所述基于多维交联的合生素微囊化制剂的益生菌和益生元的载率均大于等于90％；
所述基于多维交联的合生素微囊化制剂的制备方法包括以下步骤：
(1)芯材的制备：将益生菌菌体、益生元、海藻提取物混合，加入无菌生理盐水混匀，得到所述芯材；
(2)微胶囊的制备：制备褐藻酸盐溶液，加入所述步骤(1)得到的芯材充分混匀，雾化，用钙离子溶液固化；固化后过滤收集微胶囊，除去过量的金属离子，过滤收集微胶囊；
(3)微胶囊外壁交联制备：制备低聚壳聚糖溶液，加入所述步骤(2)得到的微胶囊，搅拌，使低聚壳聚糖交联，形成低聚壳聚糖-褐藻酸交联致密层，除去钙离子，过滤收集微胶囊，然后经干燥获得所述基于多维交联的合生素微囊化制剂。
进一步的，所述步骤(1)中益生菌菌体的制备方法为：将益生菌菌体各自接种、发酵培养，发酵液，离心收集菌体，用无菌生理盐水洗涤，调节活菌浓度至1×108CFU/mL～1×1010CFU/mL，获得菌液；将所述菌液混合，离心后得到沉淀为所述益生菌菌体。
进一步的，所述步骤(1)为将80-90份益生菌菌体、5-10份复合益生元、5-10份海藻提取物混合，以重量份计。
进一步的，所述步骤(1)中的益生菌菌体为长双歧杆菌、动物双歧杆菌、两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、鼠李乳杆菌、瑞士乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、唾液乳杆菌、嗜酸乳杆菌中的至少一种。
进一步的，所述步骤(1)中的海藻提取物为褐藻提取物、红藻提取物、绿藻提取物、螺旋藻提取物的至少一种。
进一步的，所述步骤(1)中益生元含有组分及重量份数为：菊粉5～40份、低聚果糖5～30份、低聚木糖5～20份、低聚异麦芽糖0～30份、大豆低聚糖0～30份、壳寡糖5～10份。
进一步的，所述步骤(2)中的褐藻酸盐为褐藻酸钠、褐藻酸钾、褐藻酸镁中的至少一种。
进一步的，所述步骤(2)中褐藻酸盐溶液的质量浓度为0.1％～3％，所述芯材与褐藻酸盐溶液的质量比为1∶10～5∶10。
进一步的，所述步骤(2)中钙离子溶液中钙离子的浓度为0.5％～15％，固化时间10～50min。
进一步的，所述步骤(3)中的低聚壳聚糖分子量小于5000Da。
进一步的，所述步骤(3)中低聚壳聚糖溶液的质量浓度为0.1％～10.0％。
进一步的，所述步骤(3)中加入所述步骤(2)得到的微胶囊的质量分数为5～20％.
进一步的，所述步骤(3)中的搅拌时间为10～60min。
本发明还提供了所述的制备方法制得的基于多维交联的合生素微囊化制剂。
进一步的，所述基于多维交联的合生素微囊化制剂的益生菌和益生元的载率均大于等于90％。
本发明还提供了所述基于多维交联的合生素微囊化制剂在制备调节肠道菌群和补充益生菌的合生素微囊制剂中的应用。
与现有技术相比，本发明的优点和有益效果是：
1、本发明提供的合生素微囊化制剂的制备方法，利用壳寡糖的正电荷性与复合益生元及内壁材褐藻酸盐负电荷性，实现芯材与壁材之间的交联，提高微胶囊内部结构的致密性和稳定性，提高微胶囊对复合益生元的运载效率，益生元的平均载率≥90％。
2、本发明提供的合生素微囊化制剂的制备方法，利用可溶性低聚壳聚糖作为外壁材，将微胶囊表层钙离子-褐藻酸盐网状结构置换为更为致密的低聚壳聚糖-褐藻酸交联结构；解决了钙离子-褐藻酸盐胶囊的结构性缺陷；有效克服了外界环境及不良因素(如光、温度、湿度、胃液、胆汁等)对益生菌的影响；内、外壁材为不稳定的益生菌提供双重保护；内、外壁材中均加入益生元，生物相容性较好，其不仅对包埋产率和效率具有重要的影响；提高了微胶囊对胃酸的耐受能力，能够更好的保护益生菌抵御低pH胃酸侵蚀，避免胆汁破坏，最大限度保持合生素微胶囊的稳定性和活性；低聚壳聚糖的良好水溶性保证了益生元与益生菌的高效定向释放能力。
3、本发明提供的多位交联合生素微囊化制剂，其益生菌和复合益生元的平均载率均≥90％，经储存和胃肠液后益生菌和复合益生元的有效释放率≥85％；即本发明制得的多位交联合生素微囊化制剂能够有效实现高效运载和定向控释效果，并有效防止使用与储存过程中益生菌活性的降低。
4、本发明提供的多位交联合生素微囊化制剂为多种益生菌与多种益生元的有机组合，配合高运载能力和定向释放能力的微胶囊制剂，最大限度发挥了合生素的协同作用优势；经实验验证，同等条件下本发明益生菌补充量只需107即可达到1011级益生菌补充剂量所发挥的效果。
5、本发明提供的合生素微囊化制剂能够有效调节肠道菌群平衡、改善机体免疫力；其复合益生元和海藻提取物，对多种肠道内源性益生菌具有促进作用，抑制有害菌的生长，有助于肠道菌群结构调节，亦可调节肠道正常蠕动；有效补充多种外源性益生菌，在复合益生元的协助下快速定植并生长，高效发挥作用。
附图说明
图1是多维交联合生素微胶囊与钙-褐藻酸盐胶囊的扫描电镜图；其中：(a)为本发明多维交联微胶囊；(b)为实施例5制得的钙-褐藻酸盐胶囊；(c)为本发明微胶囊的表面；(d)为实施例5制得的钙-褐藻酸盐胶囊的表面。
具体实施方式
下述实施方式更好地说明本发明内容。但本发明不限于下述实施例。
实施例1：复合益生菌微囊化制剂1的制备
复合双歧杆菌和鼠李乳杆菌微胶囊(复合益生菌微囊化制剂1)的制备：
(1)将长双歧杆菌、动物双歧杆菌、短双歧杆菌、婴儿双歧杆菌和鼠李乳杆菌种子液按1％的接种量分别接种发酵培养基(上述菌种采用市售菌种)，在37℃条件下，培养48h后，分别离心收集菌体，用无菌生理盐水洗涤两次，调节活菌浓度至1×1010CFU/mL，获得各自菌液；将上述5种菌液等量混合，离心后得到沉淀为混合的益生菌菌体，加入2倍体积的无菌生理盐水混匀。
(2)取100g褐藻酸钠，加入10L蒸馏水，混匀均质制备成1％的褐藻酸钠均匀水溶液。取2L芯材加入到1％的褐藻酸钠水溶液中，充分搅拌混匀。采用高压雾化器将芯材、褐藻酸钠混合液雾化，液滴浸入5％CaCl2溶液中，搅拌固化30min，过滤收集微胶囊，用无菌生理盐水洗涤以除去过量的金属离子，再次过滤收集微胶囊。
(3)取分子量在3000-5000Da之间的低聚壳聚糖200g，加入蒸馏水20L蒸馏水中充分溶解配置成1.0％的低聚壳聚糖水溶液；加入微胶囊，缓慢搅拌30min，使低聚壳聚糖充分交联；然后过滤收集微胶囊，用无菌生理盐水洗涤以除去钙离子，再次过滤收集微胶囊，然后经冷冻干燥获得复合益生菌微囊化制剂1。
实施例2：多维交联的合生素微囊化制剂1的制备
含复合益生元和海藻提取物的复合双歧杆菌和鼠李乳杆菌合生素微胶囊(多维交联的合生素微囊化制剂1)的制备：
(1)将长双歧杆菌、动物双歧杆菌、短双歧杆菌、婴儿双歧杆菌和鼠李乳杆菌种子液按1％的接种量分别接种发酵培养基，在37℃条件下，培养48h后，分别离心收集菌体，用无菌生理盐水洗涤两次，调节活菌浓度至1×1010CFU/mL，获得各自菌液；将上述5种菌液等量混合，离心后得到沉淀为混合的益生菌菌体。
取菊粉40g、低聚果糖25g、低聚木糖10g、大豆低聚糖20g、壳寡糖5g，混匀，配制成复合益生元。取褐藻提取物50g和红藻提取物50g混合均匀，配制成海藻提取物。将85份混合的益生菌菌体、5份复合益生元、10份海藻提取物混合后，加入2倍体积的无菌生理盐水混匀。
(2)取100g褐藻酸钠，加入10L蒸馏水，混匀均质制备成1％的褐藻酸钠均匀水溶液。取2L芯材加入到1％的褐藻酸钠水溶液中，充分搅拌混匀。采用高压雾化器将芯材、褐藻酸钠混合液雾化，液滴浸入5％CaCl2溶液中，搅拌固化30min，过滤收集微胶囊，用无菌生理盐水洗涤以除去过量的金属离子，再次过滤收集微胶囊。
(3)取分子量在3000-5000Da之间的低聚壳聚糖200g，加入蒸馏水20L蒸馏水中充分溶解配置成1.0％的低聚壳聚糖水溶液；加入微胶囊，缓慢搅拌30min，使低聚壳聚糖充分交联；然后过滤收集微胶囊，用无菌生理盐水洗涤以除去钙离子，再次过滤收集微胶囊，然后经冷冻干燥获得基于多维交联的合生素微囊化制剂1。
实施例3：多维交联的合生素微囊化制剂2的制备
含复合益生元和海藻提取物的复合乳杆菌和婴儿双歧杆菌合生素微胶囊(多维交联的合生素微囊化制剂2)的制备：
(1)将瑞士乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、唾液乳杆菌、嗜酸乳杆菌和婴儿双歧杆菌种子液按1％的接种量分别接种发酵培养基，在37℃条件下，培养48h后，分别离心收集菌体，用无菌生理盐水洗涤两次，调节活菌浓度至1×1010CFU/mL，获得各自菌液；将上述6种菌液等量混合，离心后得到沉淀为混合的益生菌菌体。
取菊粉30g、低聚果糖25g、低聚木糖20g、低聚异麦芽糖15g、壳寡糖10g，混匀，配制成复合益生元。取褐藻提取物20g红藻提取物50g和绿藻提取物30g，混合均匀，配制成海藻提取物。将80份混合的益生菌菌体、10份复合益生元、10份海藻提取物混合后，加入2倍体积的无菌生理盐水混匀。
(2)取200g褐藻酸钾，加入10L蒸馏水，混匀均质制备成2％的褐藻酸钾均匀水溶液。取2L芯材加入到2％的褐藻酸钾水溶液中，充分搅拌混匀。采用高压雾化器将芯材、褐藻酸钾混合液雾化，液滴浸入质量浓度5％的CaCl2溶液中，搅拌固化20min，过滤收集微胶囊，用无菌生理盐水洗涤以除去过量的金属离子，再次过滤收集微胶囊。
(3)取分子量在500-1500Da之间的低聚壳聚糖1000g，加入蒸馏水20L蒸馏水中充分溶解配置成5.0％低聚壳聚糖水溶液；加入微胶囊，缓慢搅拌40min，使低聚壳聚糖充分交联；然后过滤收集微胶囊，用无菌生理盐水洗涤以除去钙离子，再次过滤收集微胶囊，然后经冷冻干燥获得基于多维交联的合生素微囊化制剂2。
实施例4：对比合生素微囊化制剂1的制备
含复合益生元、益生菌和海藻提取物的壳聚糖外壁材合生素微胶囊(对比合生素微囊化制剂1)的制备：
(1)将瑞士乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、唾液乳杆菌、嗜酸乳杆菌和婴儿双歧杆菌种子液按1％的接种量分别接种发酵培养基，在37℃条件下，培养48h后，分别离心收集菌体，用无菌生理盐水洗涤两次，调节活菌浓度至1×1010CFU/mL，获得各自菌液；将上述6种菌液等量混合，离心后得到沉淀为混合的益生菌菌体。
取菊粉35g、低聚果糖25g、低聚木糖25g、低聚异麦芽糖15g，混匀，配制成复合益生元。海藻提取物配比与实施例2相同。将80份混合的益生菌菌体、10份复合益生元、10份海藻提取物混合后，加入2倍体积的无菌生理盐水混匀。取200g褐藻酸钾，加入10L蒸馏水，混匀均质制备成2％的褐藻酸钾均匀水溶液。
(2)取2L芯材加入到2％的褐藻酸钾水溶液中，充分搅拌混匀。采用高压雾化器将芯材、褐藻酸钾混合液雾化，液滴浸入质量浓度5％的CaCl2溶液中，搅拌固化20min，过滤收集微胶囊，用无菌生理盐水洗涤以除去过量的金属离子，再次过滤收集微胶囊。
(3)取分子量＞10000Da的壳聚糖1000g，加入蒸馏水20L蒸馏水中充分溶解配置成5.0％的水溶液；加入微胶囊，缓慢搅拌40min，使壳聚糖充分交联；然后过滤收集微胶囊，用无菌生理盐水洗涤以除去钙离子，再次过滤收集微胶囊，然后经冷冻干燥获得对比合生素微囊化制剂1。
实施例5：对比合生素微囊化制剂2的制备
含复合益生元、益生菌和海藻提取物的无外壁材合生素微胶囊(对比合生素微囊化制剂2)的制备：
(1)将瑞士乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、唾液乳杆菌、嗜酸乳杆菌和婴儿双歧杆菌种子液按1％的接种量分别接种发酵培养基，在37℃条件下，培养48h后，分别离心收集菌体，用无菌生理盐水洗涤两次，调节活菌浓度至1×1010CFU/mL，获得各自菌液；将上述6种菌液等量混合，离心后得到沉淀为混合的益生菌菌体。
取菊粉35g、低聚果糖25g、低聚木糖25g、低聚异麦芽糖15g，混匀，配制成复合益生元。海藻提取物配比与实施例3相同。将80份混合的益生菌菌体、10份复合益生元、10份海藻提取物混合后，加入2倍体积的无菌生理盐水混匀。
(2)取200g褐藻酸钾，加入10L蒸馏水，混匀均质制备成2％的褐藻酸钾均匀水溶液。取2L芯材加入到2％的褐藻酸钾水溶液中，充分搅拌混匀。采用高压雾化器将芯材、褐藻酸钾混合液雾化，液滴浸入质量浓度5％的CaCl2溶液中，搅拌固化20min，过滤收集微胶囊，用无菌生理盐水洗涤以除去过量的金属离子，再次过滤收集微胶囊，然后经冷冻干燥获得对比合生素微囊化制剂2。
图1显示了多位交联合生素微胶囊与对比合生素微囊的扫描电镜图，可以看出本发明的微胶囊表面光滑，益生菌完全包埋；实施例5制得的钙-褐藻酸盐胶囊-表面粗糙，益生菌裸露。
实施例6：微胶囊载率测定
解囊液：将NaHCO3溶于0.1mol/L PBS(phosphate buffer solution，磷酸盐缓冲液，pH＝7.0)中(NaHCO3的终浓度为0.2mol/L)，用0.22μm水相滤膜过滤除菌。
准确称取微胶囊样品1g，加入9mL解囊液中，振摇10min至完全解囊。取混合液5mL，10倍梯度稀释后涂布于MRS琼脂上，37℃厌氧培养48h并计数。取混合液1mL，采用PMP-HPLC法，测定混合液中半乳糖、果糖、葡萄糖、木糖、氨基葡萄糖含量。益生菌载率按照公式(1)计算；益生元载率按照公式(2)计算.
公式(1)：益生菌载率＝N/N0×100％(其中N是指包埋于微胶囊中的活菌总数，N0是指制备微胶囊时浓缩菌液中的活菌总数)。
公式(2)：益生元载率＝C/C0×100％(其中C是指PMP-HPLC法测得的微胶囊中半乳糖、果糖、葡萄糖、木糖、氨基葡萄糖含量总和；C0是指PMP-HPLC法测得的制备微胶囊时加入复合益生元中半乳糖、果糖、葡萄糖、木糖、氨基葡萄糖含量总和)。
表1各种微胶囊对益生菌和益生元的载率
Figure BDA0003066553350000071
Figure BDA0003066553350000081
由表1可知，实施例1对益生菌的载率显著优于实施例4和5，实施例2和3对益生菌和益生元的载率显著高于实施例4和实施例5。结果表明经多维交联制备的微胶囊制剂，显著提高了益生菌和复合益生元的载率，其益生菌和复合益生元的平均载率均≥90％，益生菌最高载率达到96.5％，复合益生元最高载率达到97.4％。
实施例7：经人工胃肠液处理效果评估：
模拟胃液：用浓盐酸将0.2％(w/v)NaCl溶液的pH调至2.0，再加入胃蛋白酶并使最终浓度达到0.3g/L，用0.22μm水相滤膜过滤除菌。
十二指肠模拟液：将1％(w/v)的胰蛋白酶和0.3％(w/v)的胆盐分别溶于MRS肉汤中，将pH值调节至5.0，用0.22μm水相滤膜过滤除菌。
小肠模拟液：用0.1mol/L的NaHCO3溶液将上述十二指肠模拟液的pH值调节至6.5，用0.22μm水相滤膜过滤除菌。
分别取各种微胶囊各1g，置于在37℃预热的10mL模拟胃液中，于37℃，150r/min的摇床中温育3h。取微胶囊与模拟胃液的均匀混合物各1mL，加入9mL解囊液中，振摇10min至完全解囊。将混合液梯度稀释后涂布于MRS琼脂上37℃厌氧培养48h并计数；计算益生菌存活率(益生菌存活率＝经浸泡后样品中的活菌数/浸泡前样品中的活菌数)。
分别取各种微胶囊各1g，置于在37℃预热的10mL模拟胃液液中，于37℃，150r/min的摇床中温育3h；以8000r/min离心1min，转移沉淀至10mL十二指肠模拟液于37℃，150r/min的摇床中温育0.5h；以8000r/min离心1min转移沉淀至10mL小肠模拟液于37℃，150r/min的摇床中温育；每隔5min取的均匀混合物，于光学显微镜下观察，记录微胶囊的完全崩解时间。取温育3h的微胶囊与模拟消化液混合液1mL，将混合液梯度稀释后涂布于MRS琼脂上，37℃厌氧培养48h并计数。取温育3h的混合液1mL，采用PMP-HPLC法，测定混合液中半乳糖、果糖、葡萄糖、木糖、氨基葡萄糖含量。益生菌释放率按照公式(3)计算；益生元释放率按照公式(4)计算。
公式(3)：益生菌释放率＝Nf/N×100％(其中Nf是指经处理后模拟消化液中的活菌总数，N是指1g微胶囊中的活菌总数)。
公式(4)：益生元释放率＝Cf/C×100％(其中Cf是指PMP-HPLC法测得的经处理后模拟消化液中半乳糖、果糖、葡萄糖、木糖、氨基葡萄糖含量总和；C是指PMP-HPLC法测得的1g微胶囊中半乳糖、果糖、葡萄糖、木糖、氨基葡萄糖含量总和)。
表2各种微胶囊经人工胃肠液处理微胶囊溶出效果
Figure BDA0003066553350000091
由表2可知，经人工胃液处理后，实施例1～3对益生菌存活率最高达到99.2％，显著高于实施例4和实施例5。实施例1～3利用壳寡糖的正电荷性与复合益生元及内壁材褐藻酸盐负电荷性，实现芯材与壁材之间的交联，又将微胶囊表层钙离子-褐藻酸盐网状结构置换为更为致密的低聚壳聚糖-褐藻酸交联结构；经外壁材交联包裹的微胶囊显著提高了其对益生菌的保护作用。无外壁材保护的实施例5钙离子-褐藻酸盐微胶囊因其结构性缺陷，其益生菌存活率最低，仅为56.5％。释放率方面，实施例1～3益生菌释放率最高可达到88.7％，实施例2和3益生元释放率最高可达到95.4％；而实施例4壳聚糖-褐藻酸盐微胶囊释放率仅为58.4，这与其较长的崩解时间有关。
实施例1～3获得的多维交联的微胶囊在小肠中完全崩解时间仅为3h，这与食物在小肠和结肠的停留时间相仿，而实施例4壳聚糖-褐藻酸盐微胶囊完全崩解时间延长至7h。上述结果表明，本发明的合生素微囊化制剂，解决了钙离子-褐藻酸盐胶囊的结构性缺陷；有效提高益生菌对胃液、胆汁等胃肠环境的耐受能力，最大限度保持合生素微胶囊制剂的稳定性和活性。同时验证了低聚壳聚糖的良好水溶性保证了益生元与益生菌的高效定向释放能力。
微胶囊储藏后活性收率评估：每种胶囊各取1g置于无菌玻璃葡萄糖瓶中，用胶塞和铝盖封口，储藏于25℃。分别于第7天、14天、21天和28天取出，添加9mL解囊液，振摇10min至完全解囊，计数。
表3储藏稳定性效果
Figure BDA0003066553350000101
由表3可知，经25℃储存后，实施例1～4经28天储存后活菌仍旧可达到8.8logCFU/g，而实施例5钙离子-褐藻酸盐微胶囊仅为5.9log CFU/g，已达不到相关国标对益生菌活菌量要求。表明经多维交联制备的微胶囊制剂显著提高活菌常温存储时间，有效克服了外界环境及不良因素(如光、温度、湿度)对益生菌的影响。
实施例8：微胶囊及对小鼠肠道菌群的调节效果评估
将45只8周龄健康成年雌性SPF小鼠(未禁食)随机分组，每组10只。分别用各种新鲜微胶囊的悬浮液灌胃，灌胃量为1×107CFU/kg·d持续21天；以1×1011CFU/kg·d益生菌灌胃为阳性对照；以生理盐水灌胃组为空白对照。在最后一次灌胃后24h处死小鼠，取结肠内容物。采用实时荧光定量PCR法测定结肠内容物中双歧杆菌属、乳杆菌属、肠球菌属和肠杆菌的含量。
表4微胶囊及对小鼠肠道菌群的调节效果
Figure BDA0003066553350000102
由表4可知，实施例1～3制得的多维交联的合生素微胶囊制剂对小鼠结肠内双歧杆菌和乳杆菌具有更好的促生长作用，有效提高了其含量，并对肠球菌和肠杆菌产生了一定的抑制作用；特别是添加复合益生元后的实施例2和3制得的制剂其效果明显高于仅复合菌微囊制剂的效果。由实施例4～5制得的壳聚糖-褐藻酸盐微胶囊和钙离子-褐藻酸盐微胶囊对上述菌群也产生作用，但其作用效果显著低于本发明，亦低于1×1011CFU/kg·d益生菌组。上述结果还表明本发明多维交联的合生素微胶囊制剂在小鼠体内对肠道菌群的调节效果略高于阳性对照益生菌补充效果。因此，多维交联的合生素微胶囊制剂可以调节肠道菌群、补充益生菌，最大限度发挥了合生素的协同作用优势。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (8)

1.一种基于多维交联的合生素微囊化制剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
（1）芯材的制备：将益生菌菌体、益生元、海藻提取物混合，加入无菌生理盐水混匀，得到所述芯材；
（2）微胶囊的制备：制备褐藻酸盐溶液，加入所述步骤（1）得到的芯材充分混匀，雾化，用钙离子溶液固化；固化后过滤收集微胶囊，除去过量的金属离子，过滤收集微胶囊；
（3）微胶囊外壁交联制备：制备低聚壳聚糖溶液，加入所述步骤（2）得到的微胶囊，搅拌，使低聚壳聚糖交联，形成低聚壳聚糖-褐藻酸交联致密层，除去钙离子，过滤收集微胶囊，然后经干燥获得所述基于多维交联的合生素微囊化制剂；
所述步骤（1）为将80~90份益生菌菌体、5~10份复合益生元、5~10份海藻提取物混合，以重量份计；所述海藻提取物为褐藻提取物、红藻提取物、绿藻提取物、螺旋藻提取物的至少一种。
2.根据权利要求1所述的基于多维交联的合生素微囊化制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中益生菌菌体的制备方法为：将益生菌菌体各自接种、发酵培养，发酵液，离心收集菌体，用无菌生理盐水洗涤，调节活菌浓度至1×108CFU/mL~1×1010 CFU/mL，获得菌液；将所述菌液混合，离心后得到沉淀为所述益生菌菌体。
3.根据权利要求1或2所述的基于多维交联的合生素微囊化制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中的益生菌菌体为长双歧杆菌、动物双歧杆菌、两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、鼠李乳杆菌、瑞士乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、唾液乳杆菌、嗜酸乳杆菌中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的基于多维交联的合生素微囊化制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中益生元含有以下组分，以重量份计：菊粉5~40份、低聚果糖5~30份、低聚木糖5~20份、低聚异麦芽糖0~30份、大豆低聚糖0~30份、壳寡糖5~10份。
5.根据权利要求1所述的基于多维交联的合生素微囊化制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中固化时间10~50min。
6.根据权利要求1所述的基于多维交联的合生素微囊化制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中褐藻酸盐溶液的质量浓度为0 .1％~3％，所述芯材与褐藻酸盐溶液的质量比为1:10~5:10。
7.权利要求1-6任一项所述的制备方法制得的基于多维交联的合生素微囊化制剂。
8.权利要求7所述基于多维交联的合生素微囊化制剂在制备调节肠道菌群和补充益生菌的合生素微囊制剂中的应用。
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