CN109453207B - 一种硒化海藻酸钠与硒化壳聚糖包覆的益生菌双层微胶囊、制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种硒化海藻酸钠与硒化壳聚糖包覆的益生菌双层微胶囊、制备方法及其应用，本发明的制备方法包括以下步骤：用亚硒酸钠处理海藻酸钠与壳聚糖制得硒化海藻酸钠与硒化壳聚糖；用硒化海藻酸钠与硒化壳聚糖包埋益生菌；使用Ca2+交联，获得益生菌双层微胶囊。本发明既能发挥益生菌定殖的作用，改善肠道微生态，又能补充人体必需的硒元素，提高机体免疫力，进一步强化了益生菌对人体的增益效果。

Description

一种硒化海藻酸钠与硒化壳聚糖包覆的益生菌双层微胶囊、 制备方法及其应用
技术领域
本发明属于医药生物技术领域，特别涉及一种硒化海藻酸钠与硒化壳聚糖包覆的益生菌双层微胶囊、制备方法及其应用。
背景技术
益生菌是通过定殖作用改变宿主某一部位菌群的组成，从而产生有利于宿主健康作用的单一或组成明确的混合微生物。肠道作为人体微生物菌群丰度最高的器官，适当补充益生菌，可改善肠道功能，对维持人体健康有积极意义。然而，人体消化道存在胃酸、胆盐等消化液，有强烈的抑菌杀菌作用，这给口服益生菌的定殖造成巨大障碍。
海藻酸钠是一种藻源性海洋多糖，分子表面存在很多羧酸根离子，带负电，有良好的耐酸性，可保持所负载的药物在经过胃部时活性不受影响。壳聚糖是具有阳离子电荷的几丁质的脱乙酰化衍生物，除良好的生物相容性和生物降解性外，还具有良好的生物黏附性，有助于载药微胶囊靶向达到肠道。中国发明专利201310337653.4公开了一种壁材为海藻酸钠与壳聚糖的可悬浮乳酸杆菌湿胶囊的制备方法，具有低耗能等特点。中国发明专利200610070563.3利用海藻酸钠与氯化钙发生离子交换形成海藻酸钙包被,再利用海藻酸钙与壳聚糖等电点不同使壳聚糖在海藻酸钙表面形成二次包被,低温冷冻干燥后制成多层包被益生菌微胶囊。两个专利的方法皆有效提高了益生菌的活性。
硒是人体必需的微量元素，有增强免疫力的功效，已被广泛用于保健食品、辅助治疗制剂等领域。联合多糖有机硒与益生菌，将有望提高益生菌改善肠道微生态的效果。
然而，肠道微生态的改善是一个复杂系统的工程，除益生菌定植外，往往需要添加功能分子、增强免疫力等辅助手段，以起到协同效果。目前公开的益生菌包覆物及其制剂并无此功能。因此研究出一种硒化海藻酸钠与硒化壳聚糖包覆的益生菌双层微胶囊成为当前亟待解决的问题。
发明内容
本发明的首要目的在于提供一种硒化海藻酸钠与硒化壳聚糖包覆的益生菌双层微胶囊。
本发明另一目的在于提供上述双层微胶囊制备方法。
本发明再一目的在于提供上述双层微胶囊应用。
本发明所采取的技术方案是：
一种双层微胶囊，包括硒化海藻酸钠、硒化壳聚糖和益生菌。
进一步的，所述的益生菌为嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、乳双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、双歧杆菌、短乳杆菌、植物乳杆菌。
上述所述的双层微胶囊的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将亚硒酸钠缓慢加入到海藻酸钠，过滤取滤液，加乙醇醇析，抽滤烘干得硒化海藻酸钠；
1)将亚硒酸钠缓慢加入到壳聚糖，过滤取滤液，加乙醇醇析，抽滤烘干得硒化壳聚糖；
2)将硒化海藻酸钠和硒化壳聚糖灭菌并充氮除氧，制得无菌硒化海藻酸钠以及无菌硒化壳聚糖；
3)将益生菌用PBS缓冲液重悬、离心、取菌体；再用PBS缓冲液重悬得菌悬液；
4)将步骤4)制得的菌悬液与步骤3)的无菌硒化海藻酸钠按体积比为1：(2～10)混合均匀，得海藻酸钠菌悬液；
5)将海藻酸钠菌悬液与步骤3)的无菌硒化壳聚糖溶液按体积比为1：(1～5)混合得到海藻酸钠壳聚糖混合菌悬液；
6)将海藻酸钠壳聚糖混合菌悬液滴到2～5％的无菌氯化钙，静置得包覆益生菌的双层微胶囊。
进一步的，步骤1)所述的海藻酸钠分子量为2～40万；步骤2)所述的壳聚糖分子量为1～20万。
进一步的，步骤1)所述的亚硒酸钠与海藻酸钠的质量比为1:10～50；步骤2)所述的亚硒酸钠与壳聚糖的质量比为1:10～50。
进一步的，步骤1)将亚硒酸钠在pH为1～2的条件下缓慢加入到海藻酸钠；步骤2)将亚硒酸钠在pH为1～2的条件下缓慢加入到壳聚糖。
进一步的，步骤3)硒化海藻酸钠质量浓度为1～5％，硒化壳聚糖质量浓度为0.5～2％。进一步的，步骤4)将益生菌用PBS缓冲液按质量比为1：(3～10)重悬、离心、取菌体；再用PBS缓冲液按体积比为1：(1～2)重悬得菌悬液。
进一步的，步骤4)所述的益生菌为嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、乳双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、双歧杆菌、短乳杆菌、植物乳杆菌。
上述双层微胶囊在制备耐胃酸的口服益生菌制剂中的应用。
本发明的有益效果是：
基与现有技术和制剂的特点，本发明既可保护益生菌免收胃液、胆盐等影响保持活性，发挥益生菌定殖的作用；又能同时补充人体必需的硒元素，提高机体免疫力，进一步强化益生菌对人体的增益效果。
(1)海藻酸钠、壳聚糖、氯化钙等材料具有良好的生物安全性及生物相容性，使得整个益生菌微胶囊的生物安全性得到保障。
(2)硒化多糖微胶囊包覆效果更致密，能很好包埋益生菌；抗酸性更好，能抵抗胃酸、的侵袭，显著提高益生菌存活率，而且能改善微生态，又能补充人体必需的硒元素。
(3)原料易得，成本低；包埋量大，工艺相对方便。
具体实施方式
实施例1
1.取0.3g亚硒酸钠溶于少量水中，缓慢地加入到重均分子量为2万的海藻酸钠水溶液中，过滤取滤液，加入浓度为70％乙醇溶液醇析过夜，抽滤，用无水乙醇反复冲洗，低温下烘干、粉碎，即得硒化海藻酸钠。
2.取0.3g亚硒酸钠溶于少量水中，缓慢地加入到重均分子量为1万的壳聚糖水溶液中，过滤取滤液，加入浓度为70％乙醇溶液醇析过夜，抽滤，用无水乙醇反复冲洗，低温下烘干、粉碎，即得硒化壳聚糖。
3.配制质量浓度为1％的硒化海藻酸钠、0.5％硒化壳聚糖溶液，115℃灭菌30分钟，充氮除氧，得到无菌硒化海藻酸钠溶液和无菌硒化壳聚糖溶液。
4.将嗜热链球菌菌株经无氧发酵、离心、收集菌体后，与PBS缓冲液(pH＝6.5，含0.1％蛋白胨)按质量比为1：3混合，重悬菌体并离心，重复2次。再将嗜热链球菌菌体：PBS(pH＝6.5，含0.1％蛋白胨)缓冲液按照1：1的体积比重悬，得到嗜热链球菌菌悬液。
5.将步骤4所得的菌悬液与步骤3所得的无菌硒化海藻酸钠溶液按1：2的体积比混合均匀，得到海藻酸钠菌悬液；
6.将海藻酸钠菌悬液，和步骤3的无菌硒化壳聚糖溶液按照1：1的比例混合，得到海藻酸钠壳聚糖混合菌悬液；
7.将海藻酸钠壳聚糖混合菌悬液用1ml医用注射器缓慢滴入到2％的无菌氯化钙溶液，静置15min，得到益生菌微胶囊，置入PBS缓冲液，4℃保存备用。
实施例2
1.取0.6g亚硒酸钠溶于少量水中，缓慢地加入到重均分子量为40万的海藻酸钠，反应2h后，过滤取滤液，加入浓度为100％乙醇溶液醇析过夜，抽滤，用无水乙醇反复冲洗，低温下烘干、粉碎，即得硒化海藻酸钠。
2.取0.6g亚硒酸钠溶于少量水中，缓慢地加入到重均分子量为20万壳聚糖溶液，反应2h后，过滤取滤液，加入浓度为100％乙醇溶液醇析过夜，抽滤，用无水乙醇反复冲洗，低温下烘干、粉碎，即得硒化壳聚糖。
3.配制质量浓度为5％的硒化海藻酸钠、2％硒化壳聚糖溶液，115℃灭菌30分钟，充氮除氧，得到无菌硒化海藻酸钠溶液和无菌硒化壳聚糖溶液。
4.将保加利亚乳酸杆菌菌株经无氧发酵、离心、收集菌体后，与PBS缓冲液(pH＝6.5，含0.1％peptone)按质量比为1：3混合，重悬菌体并离心，重复2次。保加利亚乳酸杆菌菌株菌体：PBS缓冲液(pH＝6.5，含0.1％蛋白胨)按照1：1比例重悬，得到保加利亚乳酸杆菌菌悬液。
5.将步骤4所得的菌悬液与步骤3所得的无菌硒化海藻酸钠溶液1：10的比例混合均匀，得到海藻酸钠菌悬液；
6.将海藻酸钠菌悬液和步骤3的无菌硒化壳聚糖溶液按照1：5的比例混合，得到海藻酸钠壳聚糖混合菌悬液；
7.将海藻酸钠壳聚糖混合菌悬液用1ml医用注射器缓慢滴入到5％的无菌氯化钙溶液，静30min，得到益生菌微胶囊，加入到PBS缓冲液，4℃保存备用。
实施例3
1.取0.4g亚硒酸钠溶于少量水中，缓慢地加入到重均分子量为10万的海藻酸钠，反应1.5h后过滤取滤液，加入浓度为95％乙醇溶液醇析过夜，抽滤，用无水乙醇反复冲洗，低温下烘干、粉碎，即得硒化海藻酸钠。
2.取0.4g亚硒酸钠溶于少量水中，缓慢地加入到重均分子量为10万壳聚糖溶液，反应1.5h后过滤取滤液，加入浓度为95％乙醇溶液醇析过夜，抽滤，用无水乙醇反复冲洗，低温下烘干、粉碎，即得硒化壳聚糖。
3.配制质量浓度为3％的硒化海藻酸钠、1.5％硒化壳聚糖溶液，115℃灭菌30分钟，充氮除氧，得到无菌硒化海藻酸钠溶液和无菌硒化壳聚糖溶液。
4.将双歧杆菌菌株经无氧发酵、离心、收集菌体后，与PBS缓冲液(pH＝6.5，含0.1％peptone)按质量比为1：7混合，重悬菌体并离心，重复3次。将双歧杆菌菌体：PBS缓冲液(pH＝6.5，含0.1％蛋白胨)按照1：1比例重悬，得到双歧杆菌菌悬液。
5.将步骤4所得的菌悬液与步骤3所得的无菌硒化海藻酸钠溶液1：5的比例混合均匀，静置得到海藻酸钠菌悬液；
6.将海藻酸钠菌悬液和步骤3的无菌硒化壳聚糖溶液按照1：3的比例混合，海藻酸钠壳聚糖混合菌悬液；
7.将海藻酸钠壳聚糖混合菌悬液用1ml医用注射器缓慢滴加到3％的无菌氯化钙溶液，静置25min，得到益生菌微胶囊，加入到PBS缓冲液，4℃保存备用。
实施例4
1.取0.4g亚硒酸钠溶于少量水中，缓慢地加入到重均分子量为10万的海藻酸钠，反应1.5h后过滤取滤液，加入浓度为95％乙醇溶液醇析过夜，抽滤，用无水乙醇反复冲洗，低温下烘干、粉碎，即得硒化海藻酸钠。
2.取0.4g亚硒酸钠溶于少量水中，缓慢地加入到重均分子量为1万壳聚糖溶液，反应1.5h后过滤取滤液，加入浓度为95％乙醇溶液醇析过夜，抽滤，用无水乙醇反复冲洗，低温下烘干、粉碎，即得硒化壳聚糖。
3.配制质量浓度为3％的硒化海藻酸钠、1.5％硒化壳聚糖溶液，115℃灭菌30分钟，充氮除氧，得到无菌硒化海藻酸钠溶液和无菌硒化壳聚糖溶液。
4.将乳双歧杆菌菌株经无氧发酵、离心、收集菌体后，与PBS缓冲液(pH＝6.5，含0.1％peptone)按质量比为1：10混合，重悬菌体并离心，重复3次。将乳双歧杆菌菌体：PBS缓冲液(pH＝6.5，含0.1％蛋白胨)按照1：1比例重悬，得到乳双歧杆菌菌悬液。
5.将步骤4所得的菌悬液与步骤3所得的无菌硒化海藻酸钠溶液1：5的比例混合均匀，静置得到海藻酸钠菌悬液；
6.将海藻酸钠菌悬液和步骤3的无菌硒化壳聚糖溶液按照1：3的比例混合，海藻酸钠壳聚糖混合菌悬液；
7.将海藻酸钠壳聚糖混合菌悬液用1ml医用注射器缓慢滴加到3％的无菌氯化钙溶液，静置15-30min，得到益生菌微胶囊，加入到PBS缓冲液，4℃保存备用。
实施例5
1.取0.4g亚硒酸钠溶于少量水中，缓慢地加入到重均分子量为10万的海藻酸钠，反应1.5h后过滤取滤液，加入浓度为95％乙醇溶液醇析过夜，抽滤，用无水乙醇反复冲洗，低温下烘干、粉碎，即得硒化海藻酸钠。
2.取0.4g亚硒酸钠溶于少量水中，缓慢地加入到重均分子量为1万壳聚糖溶液，反应1.5h后过滤取滤液，加入浓度为95％乙醇溶液醇析过夜，抽滤，用无水乙醇反复冲洗，低温下烘干、粉碎，即得硒化壳聚糖。
3.配制质量浓度为3％的硒化海藻酸钠、1.5％硒化壳聚糖溶液，115℃灭菌30分钟，充氮除氧，得到无菌硒化海藻酸钠溶液和无菌硒化壳聚糖溶液。
4.将嗜酸乳杆菌菌株经无氧发酵、离心、收集菌体后，与PBS缓冲液(pH＝6.5，含0.1％peptone)按质量比为1：7混合，重悬菌体并离心，重复3次。将嗜酸乳杆菌菌体：PBS缓冲液(pH＝6.5，含0.1％蛋白胨)按照1：1比例重悬，得到嗜酸乳杆菌菌悬液。
5.将步骤4所得的菌悬液与步骤3所得的无菌硒化海藻酸钠溶液1：5的比例混合均匀，静置得到海藻酸钠菌悬液；
6.将海藻酸钠菌悬液和步骤3的无菌硒化壳聚糖溶液按照1：3的比例混合，海藻酸钠壳聚糖混合菌悬液；
7.将海藻酸钠壳聚糖混合菌悬液用1ml医用注射器缓慢滴加到3％的无菌氯化钙溶液，静置15-30min，得到益生菌微胶囊，加入到PBS缓冲液，4℃保存备用。
实施例6
1.取0.4g亚硒酸钠溶于少量水中，缓慢地加入到重均分子量为10万的海藻酸钠，反应1.5h后过滤取滤液，加入浓度为95％乙醇溶液醇析过夜，抽滤，用无水乙醇反复冲洗，低温下烘干、粉碎，即得硒化海藻酸钠。
2.取0.4g亚硒酸钠溶于少量水中，缓慢地加入到重均分子量为13万壳聚糖溶液，反应1.5h后过滤取滤液，加入浓度为95％乙醇溶液醇析过夜，抽滤，用无水乙醇反复冲洗，低温下烘干、粉碎，即得硒化壳聚糖。
3.配制质量浓度为3％的硒化海藻酸钠、1.5％硒化壳聚糖溶液，115℃灭菌30分钟，充氮除氧，得到无菌硒化海藻酸钠溶液和无菌硒化壳聚糖溶液。
4.将干酪乳杆菌菌株经无氧发酵、离心、收集菌体后，与PBS缓冲液(pH＝6.5，含0.1％peptone)按质量比为1：7混合，重悬菌体并离心，重复3次。将干酪乳杆菌菌体：PBS缓冲液(pH＝6.5，含0.1％蛋白胨)按照1：1比例重悬，得到干酪乳杆菌菌悬液。
5.将步骤4所得的菌悬液与步骤3所得的无菌硒化海藻酸钠溶液1：5的比例混合均匀，静置得到海藻酸钠菌悬液；
6.将海藻酸钠菌悬液和步骤3的无菌硒化壳聚糖溶液按照1：3的比例混合，海藻酸钠壳聚糖混合菌悬液；
7.将海藻酸钠壳聚糖混合菌悬液用1ml医用注射器缓慢滴加到3％的无菌氯化钙溶液，静置15-30min，得到益生菌微胶囊，加入到PBS缓冲液，4℃保存备用。
实施例7
1.取0.4g亚硒酸钠溶于少量水中，缓慢地加入到重均分子量为10万的海藻酸钠，反应1.5h后过滤取滤液，加入浓度为95％乙醇溶液醇析过夜，抽滤，用无水乙醇反复冲洗，低温下烘干、粉碎，即得硒化海藻酸钠。
2.取0.4g亚硒酸钠溶于少量水中，缓慢地加入到重均分子量为13万壳聚糖溶液，反应1.5h后过滤取滤液，加入浓度为95％乙醇溶液醇析过夜，抽滤，用无水乙醇反复冲洗，低温下烘干、粉碎，即得硒化壳聚糖。
3.配制质量浓度为3％的硒化海藻酸钠、1.5％硒化壳聚糖溶液，115℃灭菌30分钟，充氮除氧，得到无菌硒化海藻酸钠溶液和无菌硒化壳聚糖溶液。
4.将短乳杆菌菌株经无氧发酵、离心、收集菌体后，与PBS缓冲液(pH＝6.5，含0.1％peptone)按质量比为1：7混合，重悬菌体并离心，重复3次。将短乳杆菌菌体：PBS缓冲液(pH＝6.5，含0.1％蛋白胨)按照1：1比例重悬，得到短乳杆菌菌悬液。
5.将步骤4所得的菌悬液与步骤3所得的无菌硒化海藻酸钠溶液1：5的比例混合均匀，静置得到海藻酸钠菌悬液；
6.将海藻酸钠菌悬液和步骤3的无菌硒化壳聚糖溶液按照1：3的比例混合，海藻酸钠壳聚糖混合菌悬液；
7.将海藻酸钠壳聚糖混合菌悬液用1ml医用注射器缓慢滴加到3％的无菌氯化钙溶液，静置15-30min，得到益生菌微胶囊，加入到PBS缓冲液，4℃保存备用。
实施例8
1.取0.4g亚硒酸钠溶于少量水中，缓慢地加入到重均分子量为10万的海藻酸钠，反应1.5h后过滤取滤液，加入浓度为95％乙醇溶液醇析过夜，抽滤，用无水乙醇反复冲洗，低温下烘干、粉碎，即得硒化海藻酸钠。
2.取0.4g亚硒酸钠溶于少量水中，缓慢地加入到重均分子量为7万壳聚糖溶液，反应1.5h后过滤取滤液，加入浓度为95％乙醇溶液醇析过夜，抽滤，用无水乙醇反复冲洗，低温下烘干、粉碎，即得硒化壳聚糖。
3.配制质量浓度为3％的硒化海藻酸钠、1.5％硒化壳聚糖溶液，115℃灭菌30分钟，充氮除氧，得到无菌硒化海藻酸钠溶液和无菌硒化壳聚糖溶液。
4.将植物乳杆菌菌株经无氧发酵、离心、收集菌体后，与PBS缓冲液(pH＝6.5，含0.1％peptone)按质量比为1：7混合，重悬菌体并离心，重复3次。将植物乳杆菌菌体：PBS缓冲液(pH＝6.5，含0.1％蛋白胨)按照1：1比例重悬，得到植物乳杆菌菌悬液。
5.将步骤4所得的菌悬液与步骤3所得的无菌硒化海藻酸钠溶液1：5的比例混合均匀，静置得到海藻酸钠菌悬液；
6.将海藻酸钠菌悬液和步骤3的无菌硒化壳聚糖溶液按照1：3的比例混合，海藻酸钠壳聚糖混合菌悬液；
7.将海藻酸钠壳聚糖混合菌悬液用1ml医用注射器缓慢滴加到3％的无菌氯化钙溶液，静置
8.15-30min，得到益生菌微胶囊，加入到PBS缓冲液，4℃保存备用。
对比例1
1.重均分子量为10万的海藻酸钠，过滤取滤液，加入浓度为95％乙醇溶液醇析过夜，抽滤，用去离子水反复冲洗，低温下烘干、粉碎，即得海藻酸钠。
2.重均分子量为1万壳聚糖溶液，过滤取滤液，加入浓度为95％乙醇溶液醇析过夜，抽滤，用去离子水反复冲洗，低温下烘干、粉碎，即得壳聚糖。
3.配制质量浓度为0.5％的硒化海藻酸钠、3％硒化壳聚糖溶液，115℃灭菌30分钟，充氮除氧，得到无菌海藻酸钠溶液和无菌壳聚糖溶液。
4.将双歧杆菌菌株经无氧发酵、离心、收集菌体后，与生理盐水按质量比为1：1混合，重悬菌体并离心，重复3次。将双歧杆菌菌体：PBS缓冲液按照1：3比例重悬，得到嗜热链球菌菌悬液。
5.将步骤4所得的菌悬液与步骤3所得的无菌海藻酸钠溶液体积比为1：1混合均匀，得到海藻酸钠菌悬液；
6.将海藻酸钠菌悬液，和步骤3的无菌壳聚糖溶液按照1：10的体积比混合，得到海藻酸钠壳聚糖混合菌悬液；
7.将海藻酸钠壳聚糖混合菌悬液用1ml医用注射器缓慢滴入到10％的无菌氯化钙溶液，静置18min，得到益生菌微胶囊，置入PBS缓冲液，4℃保存备用。
对实施例作进一步的效果检测。
用1mL无菌生理盐水重悬重悬本发明所得的益生菌微胶囊制剂和对比例，加入到9mL pH＝1.5的人工胃液中，置于37℃水浴摇床中震荡培养，分别在0min、60min、120min时取样，梯度稀释(101-106)，涂布平板计数，测其活菌率。未被硒化海藻酸钠和硒化壳聚糖包覆的嗜热链球菌作为对照组。
从表1中显示，在未浸入胃液时(0min)，两组的菌株数大致相当，菌存活率为100％。60min之后，未被包覆的嗜热链球菌的数量下降4个数量级，而实施例1所得微胶囊中的嗜热链球菌的数量下降1个数量级。120min后，未被包覆的嗜热链球菌的存活率几乎为0，而实施例1所得微胶囊中的乳酸杆菌的存活率仍保持为8.1％。实验证实，本发明制备的微胶囊可有效保护益生菌的活性。
表1微胶囊稳定性试验结果
Figure BDA0001931920340000091
表1中可知，随着时间的增加，实施例的酵母菌可使益生菌免受消化液破坏，在人工胃液中持续时间比对照组长。而且本实施例的包埋效率比对比例高。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种双层微胶囊，包括硒化海藻酸钠、硒化壳聚糖和益生菌；
所述双层微胶囊的制备方法，包括以下步骤：
1)将亚硒酸钠在pH为1～2的条件下缓慢加入到海藻酸钠，过滤取滤液，加乙醇醇析，抽滤烘干得硒化海藻酸钠；
2)将亚硒酸钠在pH为1～2的条件下缓慢加入到壳聚糖，过滤取滤液，加乙醇醇析，抽滤烘干得硒化壳聚糖；
3)将硒化海藻酸钠和硒化壳聚糖灭菌并充氮除氧，制得无菌硒化海藻酸钠以及无菌硒化壳聚糖；
4)将益生菌用PBS缓冲液重悬、离心、取菌体；再用PBS缓冲液重悬得菌悬液；
5)将步骤4)制得的菌悬液与步骤3)的无菌硒化海藻酸钠按体积比为1：(2～10)混合均匀，得海藻酸钠菌悬液；
6)将海藻酸钠菌悬液与步骤3)的无菌硒化壳聚糖溶液按体积比为1：(1～5)混合得到海藻酸钠壳聚糖混合菌悬液；
7)将海藻酸钠壳聚糖混合菌悬液滴到2～5％的无菌氯化钙，静置得包覆益生菌的双层微胶囊；
步骤1)所述的亚硒酸钠与海藻酸钠的质量比为1:10～50；
步骤2)所述的亚硒酸钠与壳聚糖的质量比为1:10～50。
2.根据权利要求1所述的双层微胶囊，其特征在于，步骤1)所述的海藻酸钠分子量为2～40万；步骤2)所述的壳聚糖分子量为1～20万。
3.根据权利要求1所述的双层微胶囊，其特征在于，步骤3)硒化海藻酸钠质量浓度为1～5％，硒化壳聚糖质量浓度为0.5～2％。
4.根据权利要求1所述的双层微胶囊，其特征在于，步骤4)将益生菌先用PBS缓冲液按质量比为1：(3～10)重悬、离心、取菌体；再用PBS缓冲液按体积比为1：(1～2)重悬得菌悬液。
5.根据权利要求1所述的双层微胶囊，其特征在于，步骤4)所述的益生菌为嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、乳双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、双歧杆菌、短乳杆菌、植物乳杆菌。
6.权利要求1～5任一项所述的双层微胶囊在制备耐胃酸的口服益生菌制剂中的应用。
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