CN114874951A - 一种新型鼠李糖乳杆菌菌株及其应用 - Google Patents
一种新型鼠李糖乳杆菌菌株及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及功能微生物筛选与应用技术领域，具体提供了一种新型鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）及其应用。所述鼠李糖乳杆菌为鼠李糖乳杆菌YKSW（Lactobacillus rhamnosus YKSW），已于2022年3月29日保藏于中国武汉 武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2022337。该菌株对胃肠液耐受性强，抗氧化和抑菌作用显著，而且能高效清除胆固醇和高产胞外多糖，有利于改善菌群结构，维持肠道健康，提高机体免疫力，应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明涉及功能微生物筛选与应用技术领域，具体涉及一种新型鼠李糖乳杆菌菌株及其应用。
背景技术
乳酸菌是一类广泛存在于自然界中的微生物，能够利用葡萄糖发酵产生乳酸。 在自然界中分布广泛，常存在于人类以及动物的肠道、粪便以及营养丰富的食品中，植物中也含有丰富的乳酸菌。乳酸菌种类繁多，有18个属，200多个种，如乳杆菌属、双歧杆菌属和链球菌属等。乳酸菌菌体大多呈杆状或球状，多数喜在酸性环境中厌氧或兼性厌氧生长繁殖，期间不形成芽孢。乳酸菌可调节胃肠道微生物种群，提高机体免疫性能，激活机体代谢反应，预防和减轻各类疾病，如流行性病毒感冒、消化道疾病、传染病和过敏性疾病。食品工业中常见的乳酸菌种属包括乳球菌属（Lactococcus）、明串珠菌属（Leuconostoc）、片球菌属（Pediococcus）、链球菌属（Streptococcus）和乳杆菌属（Lacto⁃bacillus）。
乳酸菌依赖于能够定植于肠道的益生特性，通过自身发酵产生有机酸、抗菌素、氨基酸、维生素等多种物质，从而抵制有害菌滋生，稳定胃肠道微环境，维持机体基本的生理生化代谢。Cucick等研究证实，植物乳杆菌（Lb. planta⁃rum 16cv）和嗜热链球菌（St. thermophilus 361v）在适宜的培养条件下能产生大量的叶酸，而摄入足量的叶酸可有效维持肠粘膜稳态，保障机体的正常发育、生长和健康稳态。刘鹿等通过构造小鼠胃肠道损伤模型，证实了乳酸菌制剂能够减少肠道内炎性分子释放，可有效治疗胃肠道炎症，促进胃肠道修复。
乳酸菌在代谢过程中会产生细菌素、过氧化氢、有机酸等多种具有抑菌活性的化合物，可降低病原菌胞内pH，影响其正常的生理代谢，达到抑菌的效果。Macaluso等从西西里奶酪中分离出699株乳酸菌，其中有37株菌能代谢出细菌素类物质，此类物质能明显抑制李斯特氏菌的生长，另将代谢物细菌素添加到乳制品中，可提高乳制品的质量和安全性能。Ren等从发酵食品中筛选了7株抑菌性能良好的乳酸杆菌，其中植物乳杆菌T8（L. plantarum T8）对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌的抑菌长度均达到13mm左右，由此表明T8具有良好的广谱抑菌效果。
乳酸菌能够恢复免疫失调后的肠道内环境稳态，改善粘膜屏障功能以及下调炎症反应，因而可用于减轻和治疗结肠炎、粘膜炎甚至结肠癌等疾病。研究表明，鼠李糖乳杆菌经发酵产生的代谢物对肠道上皮感染和病原体引起的损伤有潜在的保护作用。
乳酸菌对人体有特殊的生理作用，是机体内必不可少的正常生理菌群，拓展菌种来源，选育既有优良发酵特性，又有特殊保健功能的活菌数高、优良、安全的乳酸菌菌种；应用分子生物技术开发食品级乳酸菌菌株和工程菌菌株，将为人类带来巨大的经济效益、社会效益和生态效益。
发明内容
本发明为解决现有技术问题，提供了一种新型鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）及其应用。所述鼠李糖乳杆菌对胃肠液耐受性强，抗氧化和抑菌作用显著，而且能高产胞外多糖，有利于改善菌群结构，维持肠道健康，提高机体免疫力，应用前景广阔。
本发明一方面提供了一种鼠李糖乳杆菌YKSW（Lactobacillus rhamnosus YKSW），已于2022年3月29日保藏于中国武汉 武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2022337。
所述鼠李糖乳杆菌的16s rDNA序列如SEQ ID NO：1所示。
所述鼠李糖乳杆菌在制备具有降低胆固醇功能的制品中的应用。
所述鼠李糖乳杆菌在制备具有抗氧化功能的制品中的应用。
所述鼠李糖乳杆菌在制备具有预防或治疗腹泻功能的制品中的应用。
所述的制品为药品、保健品或食品。
本发明还提供了一种乳酸菌饮料，是通过将上述鼠李糖乳杆菌进行发酵制备的。
所述乳酸菌饮料中鼠李糖乳杆菌的活菌数超过10亿/mL。
本发明还提供了上述乳酸菌饮料的制备方法，具体步骤包括：
（1）配制液体发酵培养基，灭菌；
（2）按发酵量的2-5%将发酵乳杆菌接种至液体发酵培养基中；
（3）发酵温度36～40℃，发酵时间为15～18h；
（4）将发酵液进行无菌灌装，包装，即得乳酸菌饮料。
所述的液体发酵培养基为复原脱脂乳，浓度为120 g/L。
有益效果
本发明筛选到的鼠李糖乳杆菌YKSW对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和幽门螺旋杆菌均有显著的抑制作用，尤其对大肠杆菌和幽门螺旋杆菌的抑制作用最强，抑菌圈直径超过30mm。
鼠李糖乳杆菌YKSW具有非常强的耐胃酸、耐胆汁盐能力。该菌株在人工胃酸和肠液中3h时的存活率分别高达197.40%和90.45%，远远高于对照菌；而且，与2h时的存活率相比，该菌株在人工胃液中3h时的存活率得到明显提高，说明鼠李糖乳杆菌YKSW在胃酸中不但能够有效存活，而且还实现了增殖，取得了意料不到的效果。
鼠李糖乳杆菌YKSW能高效去除胆固醇，去除率高达89.83%，显著高于对照菌株，取得了意料不到的技术效果。
鼠李糖乳杆菌YKSW具有很强的抗氧化能力，能高效清除DPPH自由基和羟基自由基，而且其发酵上清液的清除效果要明显高于无细胞提取物。其中，该菌株发酵液上清液和无细胞提取物对DPPH·自由基的清除率分别高达78.62%和61.2%，对羟基自由基的清除率分别高达80.15%和60.33%。从而说明鼠李糖乳杆菌YKSW生长期间的代谢产物对自由基的清除发挥更重要的作用，抗氧化能力更强。此外，该菌株具有很强的抗脂质过氧化能力，其发酵上清液对脂质氧化的抑制率高达69.55%，远远高于对照菌，取得了意料不到的技术效果。
鼠李糖乳杆菌YKSW能高产胞外多糖，产量达689.4 mg/L，远远高于对照菌，取得了意料不到的技术效果。
鼠李糖乳杆菌YKSW对四环素、氨苄西林等常见抗生素较敏感，生物安全性良好，可以作为一种食品原料来源使用，长期服用不会有副作用及过量的风险。发酵该菌株制备得到的乳酸菌饮料能明显提高人体肠道内乳酸菌和双歧杆菌的数量，有助于改善菌群结构，维持肠道健康，提高机体免疫力，效果显著。
附图说明
图1为鼠李糖乳杆菌YKSW的菌落形态图。
具体实施例
本发明提供的鼠李糖乳杆菌YKSW（Lactobacillus rhamnosus YKSW）为一株新发现的鼠李糖乳杆菌菌株，能有效抑制多种致病菌，高产胞外多糖，可以作为一种食品原料来源使用，长期服用不会有副作用及过量的风险，具有重要的应用价值。
申请人于2022年3月29日将所述鼠李糖乳杆菌YKSW保藏于中国武汉 武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2022337。
除了本发明筛选出的菌株外，实施本发明所用的各种原料、生产设备均可选自市售的任意一种，并没有特殊的限定。
以下实施例是为了更好地说明阐述本发明内容，本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，本发明的保护和权利要求范围不限于所提供的案例。
实施例1 菌株的分离筛选
1、初筛：
依据2019版《人类遗传资源库伦理规范》，与样本提供者签订项目承诺书和知情同意书后，按照生物样本库标准操作规范，选择半年内未进食益生菌制剂的健康志愿者，收集新鲜粪便。
（1）将新鲜粪便置于有玻璃珠的灭菌三角瓶中，加入10倍重量pH7.0的PBS缓冲液，置于摇床中震荡30min；然后收集到离心管中，2000g离心5min，收集上清；
（2）将上述上清5000g离心10min，收集沉淀，用PBS缓冲液反复洗涤两次，收集沉淀；
（3）向上述收集沉淀的离心管中加入原上清等体积的人工胃液，充分悬浮沉淀，37℃水浴30min；
（4）将上述悬液5000g离心10min收集沉淀，用PBS缓冲液反复洗涤两次，收集沉淀；
（5）向上述收集沉淀的离心管中加入原上清等体积的人工肠液，充分悬浮沉淀，37℃水浴30min；
（6）将上述悬液5000g离心10min，收集沉淀，用PBS缓冲液反复洗涤两次，收集沉淀，最后用少量PBS缓冲液充分悬浮沉淀；
（7）将上述悬液后涂布于MRS培养基上（葡萄糖20g，牛肉膏10g，酵母浸膏5g，蛋白胨10g，无水醋酸钠5g，碳酸钙1g，吐温-80 1mL，K2HPO4 2g，琼脂15-20g，盐液A 5mL，蒸馏水1000mL，pH6.5），37℃培养24～48h，挑取平板上带有透明圈的菌落分别划线接种到MRS培养基上，37℃培养24～48h。重复操作几次，得到纯菌种。
进一步通过镜检，挑选出形状为杆菌的乳酸菌，共13株，分别命名为Y1，Y2，……，Y13。
2、抑菌型乳酸菌复筛
（1）乳酸菌菌液制备：
将初筛得到的23株乳酸杆菌分别接种于100mL MRS液体培养基中，37℃静置培养48h；
（2）致病菌菌液制备：
分别将大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和幽门螺旋杆菌（四种致病菌均由山东大学赠送）接种于营养肉汤培养基，37℃摇床培养过夜；
（3）抑菌实验—双层平板，牛津杯法：
每5mL灭菌营养琼脂培养基（50℃左右）加100μL致病菌菌液（菌量106数量级），混匀后倾倒至营养琼脂平板做成双层平板，凝固后在培养基上放置牛津杯，向牛津杯中添加200μL培养好的乳酸杆菌菌液，待菌液扩散后放入37℃培养箱中培养20h，观察抑菌圈直径。
结果显示，初筛获得的23株乳酸杆菌中对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和幽门螺旋杆菌的抑菌圈直径均超过20mm的菌株共4株，分别为Y3、Y8、Y18和Y19。其中Y3菌株对大肠杆菌和幽门螺旋杆菌的抑制作用最强。
表1 乳酸杆菌Y3对致病菌的抑制作用
| 致病菌 | 大肠杆菌 | 沙门氏菌 | 金黄色葡萄球菌 | 幽门螺旋杆菌 |
| 抑菌圈直径 | 30mm | 23 mm | 26mm | 31 mm |
从表1的数据可以看出，本发明筛选出的乳酸杆菌Y3对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和幽门螺旋杆菌均有显著的抑制作用，尤其对大肠杆菌和幽门螺旋杆菌的抑制作用最强，抑菌圈直径超过30mm。
实施例2 Y3菌株鉴定
1、菌落形态鉴定
将Y3菌株接种于MRS琼脂培养基上，37℃培养48h，菌落如图1所示。
Y3菌株菌落直径在1.5-2.5mm，呈圆形，乳白色，表面有光泽、湿润，边缘整齐；在显微镜下观察，Y3菌体呈短杆状。
2、碳源代谢鉴定
对Y3菌株进行碳源代谢试验，具体结果见表2。
表2 Y3菌株的碳源代谢结果表
| 纤维二糖 | 蜜二糖 | 龙胆二糖 | 甘露醇 | 苦杏仁苷 |
| + | - | + | - | + |
| 乳糖 | 麦芽糖 | 甘露糖 | 水杨苷 | 海藻糖 |
| - | + | + | + | + |
| 松三糖 | 棉子糖 | 山梨糖醇 | 木糖 | 鼠李糖 |
| + | - | + | - | + |
| 蔗糖 | 半乳糖 | 阿拉伯糖 | 葡萄糖酸钠 | 菊粉 |
| + | + | + | + | - |
| 果糖 | D-塔格糖 | 土伦糖 | 糖原 | 甘油 |
| + | + | - | - | + |
注：“+”为阳性反应； “-”为阴性反应。
3、16s rDNA 基因序列分析
提取Y3菌株的基因组DNA。以基因组DNA为模板，利用下述引物进行PCR扩增，反应体系如表3所示。
27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCA；
1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT。
表3 PCR扩增体系表（50μL）
| 组成成分 | 反应体积 |
| 10×PCR buffer | 5μL |
| dNTPs | 4μL |
| 27F | 2μL |
| 1492R | 2μL |
| DNA | 2.5μL |
| rTaq | 0.5μL |
| ddH<sub>2</sub>O | 34μL |
将PCR扩增产物进行电泳检测分析，结果显示：扩增产物为1500bp左右，符合要求。
将PCR扩增产物进行测序，获得Y3菌株的16s rDNA序列SEQ ID NO:1。将测序结果在GenBank核酸数据库中进行BLAST比对发现，SEQ ID NO:1与鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）的序列相似度高于99%。因此，初步确定Y3菌株为鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）。
SEQ ID NO:1：
gctccctaaaagggttacgccaccggcttcgggtgttacaaactctcatggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcgtgctgatccgcgattactagcgattccgacttcgtgtaggcgagttgcagcctacagtccgaactgagaatggctttaagagattagcttgacctcgcggtctcgcaattcgttgtaccatccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtcttattagagtgcccaactaaatgctggcaactagtcataagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgaaacgagctgacgagaaccatacaccacctgtcattttgcccccgaaggggaaacctgatctctcaggtgatcaaaagatgtcaagacctggaaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcaaccttgcggtcgtactccccaggcggaatgcttaatgcgttagctgcggcaatgaagggcggaaaccctccaacacctagcattcatcgtttacggcatggactaccagggtatctaatcctgttcgctaaccatgctttcgagcctcagcgtaagttacagaccagacagccgccttcgccactggtgttcttccatatatctacgcatttcaccgctacacatggagttccactgtcctcttctgcactcaagtttcccagtttccgatgcacttcctcggttaagccgagggctttcacatcagacttaaaaaaccgccttcgctcgctttacgcccaataaattcggataacgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtggctttctggttggataccgtcacgccgacaacagttactctgccgaccattcttctccaacaacagagttttacgacccgaaagccttcttcactcacgcggcgttgctccatcagacttgcgtccattgtggaagatttcctactgctgcctcccgtaggagtttgggccgtgtctcagtcccaatgtggccgatcaacctctcagttcggctacgtatcattgccttggtgagccgttacctcaccaactagctaatacgccgcgggtccatccaaaagcgatagcttacgccatctttcagccaagaaccatgcggttcttggatttatgcggtattagcatctgtttccaaatgttatcccccacttaagggcaggttaaccacgtgttactcacccgtccgccactcgttcaaaattaaatcaagatgcaagcacctttcaataatcagaactcgttcgact。
综上，结合Y3菌株的菌落形态特征、生理生化特征和分子生物学鉴定结果，可以得出结论，本发明提供的Y3菌株为一株新的鼠李糖乳杆菌，并将其命名为鼠李糖乳杆菌YKSW（Lactobacillus rhamnosus YKSW），并于2022年3月29日保藏于中国武汉 武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO: M2022337。
实施例3鼠李糖乳杆菌YKSW对抗生素的耐受性实验
分别配制氨苄西林、四环素、红霉素、庆大霉素、链霉素、克林霉素2048 μg/mL的贮存液，-20℃保存备用。使用时将贮存液用BSM液体培养基进行2倍系列梯度稀释成使用液，梯度稀释浓度为1~1024μg /mL共11个梯度。
将鼠李糖乳杆菌YKSW接种于MRS液体培养基中，37℃培养24h；将新鲜菌液5000rpm离心5 min，用无菌生理盐水洗一次，再用同体积生理盐水重悬菌体后稀释50倍，作为接种液。
采用微量肉汤稀释法测定抗生素对鼠李糖乳杆菌YKSW的最小抑菌浓度MIC值。
具体结果见表4。
表4 鼠李糖乳杆菌YKSW的抗生素MIC值（μg/mL）
从表4的结果可以看出，本发明提供的鼠李糖乳杆菌YKSW对四环素、氨苄西林等常见抗生素较敏感，生物安全性良好。
实施例4 鼠李糖乳杆菌YKSW耐胃酸、耐胆盐实验
1、耐胃酸性能检测方法：
取活化后的鼠李糖乳杆菌YKSW菌悬液40ml加入50ml离心管中，离心（5000g、5min）收集菌体，用PBS缓冲液洗涤两次后向离心管中加入40ml人工胃液（取稀盐酸16.4ml加水摇匀稀释至1000ml，用浓盐酸或10%的NaOH调整pH为2.0，于121℃灭菌30min，在无菌室以1g/100ml比例加胃蛋白酶），37℃水浴培养3h，每隔30min摇匀一次，于0h、2h和3h分别取样作活菌计数，以0h样品为对照，分别计算2h和3h样品菌体的存活率。
2、耐胆汁盐性能检测方法：
取活化后的鼠李糖乳杆菌YKSW菌悬液40ml加入50ml离心管中，离心（5000g、5min）收集菌体，用PBS缓冲液洗涤两次后向离心管中加入40ml人工肠液（配制方法：取KH2PO46.8g，加蒸馏水500ml溶解，用0.4%（w/v）的NaOH溶液调节pH值至6.8，加水至1000ml，每100ml溶液中加0.3g禽胆盐，充分溶解后，于115℃灭菌15min），37℃水浴培养2h，每隔30min摇匀一次，于0h、2h和3h分别取样作活菌计数，以0h样品为对照，分别计算2h和3h样品菌体的存活率。
存活率=（2h或3h时的活菌数/0h时的活菌数）×100%。
同时，以鼠李糖乳杆菌CGMCC1.552作为对照，进行上述耐胃酸和耐胆汁盐性能检测。具体结果见表5。
表5鼠李糖乳杆菌YKSW耐胃酸、耐胆汁盐性能检测结果
从表5中的数据可以看出，本发明筛选到的鼠李糖乳杆菌YKSW具有非常强的耐胃酸、耐胆汁盐能力。该菌株在人工胃酸和肠液中3h时的存活率分别高达197.40%和90.45%，远远高于对照菌；而且，与2h时的存活率相比，该菌株在人工胃液中3h时的存活率得到明显提高，说明鼠李糖乳杆菌YKSW在胃酸中不但能够有效存活，而且还实现了增殖，取得了意料不到的效果。
实施例5鼠李糖乳杆菌YKSW对胆固醇的去除效果
本实验参照Brashears等( 1998)的方法，并略有改进。
将鼠李糖乳杆菌YKSW菌株活化后接种于MRS 培养基，37℃培养过夜，作为种子液。
配制含5%（v/v）蛋黄液的MRS 培养基，取其中2 ml培养基，5000 r/min离心7min，取1ml上清液置于离心管中，加入9ml无水乙醇，振荡处理5 min，10000 r /min离心10min，取2 ml上清液加入2 ml P-Fe-S 试剂，冰浴混匀反应30 min，测OD550，计算培养基中胆固醇的初始含量。
然后，将鼠李糖乳杆菌YKSW的种子液接种至上述MRS培养基中，在37℃条件下培养24 h后，再次测定培养基中胆固醇的最终含量，计算鼠李糖乳杆菌YKSW对胆固醇的去除率。同时以鼠李糖乳杆菌CGMCC1.552作为对照菌株，采用上述同样的操作，计算该菌对胆固醇的去除率。具体结果见表6。
胆固醇去除率=（初始含量－最终含量）/初始含量×100%。
表6鼠李糖乳杆菌YKSW对胆固醇的去除效果
| 菌 株 | 胆固醇去除率 |
| 鼠李糖乳杆菌YKSW | 89.38% |
| 对照菌鼠李糖乳杆菌CGMCC1.552 | 26.27% |
从表6的结果可知，本发明提供的鼠李糖乳杆菌YKSW能高效去除胆固醇，去除率高达89.83%，显著高于对照菌株，取得了意料不到的技术效果。
实施例6 鼠李糖乳杆菌YKSW的抗氧化能力测定
将鼠李糖乳杆菌YKSW进行传代活化后，按5%的体积比接种于MRS液体培养基， 37℃静置培养24h，3 000 r /min，离心15 min，分别收集发酵上清和菌体。
制备无细胞提取物：用pH值为7.4的磷酸缓冲溶液( PBS) 洗涤菌体3次，重新悬浮于磷酸缓冲溶液中，调整菌数至109 cfu /ml；然后超声波冰浴破碎菌体，10000 r /min 离心10 min，上清液即为无胞提取物。
1、DPPH·自由基清除实验
DPPH·是一种很稳定的以氮为中心的自由基，若受试物能清除它，则表示受试物抗氧化效果显著。
DPPH·溶液；各取1 ml发酵上清液和无细胞提取物，分别加入1 ml浓度为0.2mmol /L的DPPH·，混匀，室温下静置30min后，在517 nm处测吸光度变化。
DPPH·的清除率( %) = ［1- ( A1 -A2) /A3］×100。
式中: A1表示未加样品的DPPH ·溶液的原始吸光度；
A2表示样品在测定波长时的本身吸光度；
A3表示加样后DPPH 溶液的吸光度。
结果显示：鼠李糖乳杆菌YKSW 的发酵上清液和无细胞提取物均能强力去除DPPH·，其清除率分别高达78.62%和61.2%。
2、羟基自由基清除实验
ROS自由基中，羟基自由基是最有活性的，在金属离子(如铜离子或铁离子)存在的条件下，超氧阴离子和过氧化氢能生成羟基自由基。羟基自由基是一种氧化性很强的自由基，会对生物细胞大分子造成损伤而影响细胞的正常功能。因此，对羟基自由基的清除能力是抗氧化性能的一个主要指标。
ESR法测定清除羟基自由基的能力：分别将50 µL鼠李糖乳杆菌YKSW 的发酵上清液和无细胞提取物各加入到50 µL浓度为0.3 mol/L的DMPO后，把反应的体系转入到密封的石英毛细管中，然后加50 µL浓度为10 mol/L的H2O2启动反应。反应2.5 min后，通过ER200D SRC ESR光谱仪分析。对照为0.05 mol/L的磷酸盐缓冲溶液（pH 7.4）。样品对•OH的清除作用以清除率表示。
清除率=（H0—H）/ H0×100%。
式中：H和H0分别表示样品与对照波谱信号强度，信号的相对强度用波谱信号的第二个峰值来表示。
结果显示：鼠李糖乳杆菌YKSW 的发酵上清液和无细胞提取物对羟基自由基的清除率分别高达80.15%和60.33%。
上述结果表明，本发明提供的鼠李糖乳杆菌YKSW具有很强的抗氧化能力，其发酵液上清液和无细胞提取物能高效清除自由基，而且发酵上清液的清除效果要明显高于无细胞提取物。从而说明鼠李糖乳杆菌YKSW生长期间的代谢产物对自由基的清除发挥更重要的作用，抗氧化能力更强。
3、菌株抗脂质过氧化实验
（1）亚油酸乳化液制备：0.1mL亚油酸，0.2mL Tween 20，19.7mL去离子水。
（2）0.5 mL的PBS溶液（pH 7.4）中加入1 mL亚油酸的乳化液，1 mL FeSO4（1%），再加入0.5 mL鼠李糖乳杆菌YKSW 的发酵上清液，37℃水浴1.5 h，混合液加入0.2 mL TCA（4%），2 mL TBA（0.8%），100 ℃水浴30 min，迅速冷却，4000 rpm/min离心15 min，收集上清液在532 nm下测吸光度即为A；对照组以0.5 mL蒸馏水代替样品即为A0。
抑制率（%）＝(A0－A)/ A0×100%。
注： A为样品组吸光度；A0为对照组吸光度。
同时以鼠李糖乳杆菌CGMCC1.552作为对照菌株，采用上述同样的操作，测定对照菌的脂质过氧化抑制率。结果见表7。
表7 鼠李糖乳杆菌YKSW抗脂质过氧化能力
| 菌 株 | 脂质过氧化抑制率 |
| 鼠李糖乳杆菌YKSW | 69.55% |
| 对照菌鼠李糖乳杆菌CGMCC1.552 | 19.83% |
从表7的结果可知，本发明提供的鼠李糖乳杆菌YKSW具有很强的抗脂质过氧化能力，其发酵上清液对脂质氧化的抑制率高达69.55%，远远高于对照菌，取得了意料不到的技术效果。
实施例7 鼠李糖乳杆菌VHProbi O17产胞外多糖的制备
将鼠李糖乳杆菌YKSW菌株活化后，以5％（v/v）的接种量接种到MRS液体培养基中，37℃培养48 h；将发酵液10000g离心20 min，收集上清液；将上清液中加入3倍体积的预冷无水乙醇，4℃醇沉36h；10000g离心20 min，收集沉淀；用去离子水充分溶解沉淀后，向其中加入同等剂量的10%（m/v）三氯乙酸溶液，4℃放置过夜；再次以10000g离心20 min，去除蛋白，收集上清液。将得到的上清液再次醇沉过夜后离心，收集多糖沉淀。
将多糖沉淀用去离子水溶解后，装入透析袋(MW Cut-off 14 000 Da )；用去离子水透析2天，去除小分子杂质，即得到胞外粗多糖溶液。经过冷冻干燥，得到粉末状胞外粗多糖。将粗多糖加入同等剂量的去离子水后，采用苯酚-硫酸法测定并比较胞外多糖产量。
同时以鼠李糖乳杆菌CGMCC1.552作为对照菌株，采用上述同样的操作，测定对照菌胞外多糖的产量。
具体结果见表8。
表8 鼠李糖乳杆菌YKSW胞外多糖产量
| 菌 株 | 胞外多糖产量 |
| 鼠李糖乳杆菌YKSW | 689.4 mg/L |
| 对照菌鼠李糖乳杆菌CGMCC1.552 | 126.7 mg/L |
从表8的结果可知，本发明提供的鼠李糖乳杆菌YKSW能高产胞外多糖，产量达689.4 mg/L，远远高于对照菌，取得了意料不到的技术效果。
实施例8鼠李糖乳杆菌YKSW在生产乳酸菌饮料中的应用
在发酵罐中加入适量水和脱脂乳粉，配制成浓度为120 g/L的复原脱脂乳，150kg，采用95℃处理8～10min后，冷却至37～40℃。
按2-5%的体积比将鼠李糖乳杆菌YKSW的种子液接种于发酵罐中，搅拌15min，充分混匀后关闭搅拌；控制发酵温度为36～40℃，发酵时间为12～18h，冷水迅速降温至10℃以下，进行无菌灌装、包装，即得到乳酸菌饮料，其中鼠李糖乳杆菌YKSW活菌数约为2.5×109CFU/mL。
实施例9 乳酸菌饮料的效果评价
从健康人群中随机挑选成年男女各10名，每天收集其新鲜粪便，分别检测其中的乳酸菌和双歧杆菌数量，计算平均值。20名健康成年人每天早晚食用本发明所述乳酸菌饮料各50 ml，一周后，连续三天检测其新鲜粪便中乳酸菌及双歧杆菌数量，计算平均值。具体结果见表9。
表9 粪便中乳酸菌和双歧杆菌数量的变化
| 乳酸菌 | 双歧杆菌 | |
| 饮用前 | 1.58×10<sup>8</sup>CFU/g | 4.33×10<sup>9</sup>CFU/g |
| 饮用后 | 7.87×10<sup>9</sup>CFU/g | 2.22×10<sup>11</sup>CFU/g |
从表9的数据可知，利用本发明提供的鼠李糖乳杆菌YKSW制备得到的乳酸菌饮料能明显提高人体肠道内乳酸菌和双歧杆菌的数量，有助于改善菌群结构，维持肠道健康，提高机体免疫力，取得了意料不到的技术效果。
序列表
<110> 内蒙古一康健康发展有限责任公司
<120> 一种新型鼠李糖乳杆菌菌株及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1427
<212> DNA
<213> 鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)
<400> 1
gctccctaaa agggttacgc caccggcttc gggtgttaca aactctcatg gtgtgacggg 60
cggtgtgtac aaggcccggg aacgtattca ccgcggcgtg ctgatccgcg attactagcg 120
attccgactt cgtgtaggcg agttgcagcc tacagtccga actgagaatg gctttaagag 180
attagcttga cctcgcggtc tcgcaattcg ttgtaccatc cattgtagca cgtgtgtagc 240
ccaggtcata aggggcatga tgatttgacg tcatccccac cttcctccgg tttgtcaccg 300
gcagtcttat tagagtgccc aactaaatgc tggcaactag tcataagggt tgcgctcgtt 360
gcgggactta acccaacatc tcacgaaacg agctgacgag aaccatacac cacctgtcat 420
tttgcccccg aaggggaaac ctgatctctc aggtgatcaa aagatgtcaa gacctggaaa 480
ggttcttcgc gttgcttcga attaaaccac atgctccacc gcttgtgcgg gcccccgtca 540
attcctttga gtttcaacct tgcggtcgta ctccccaggc ggaatgctta atgcgttagc 600
tgcggcaatg aagggcggaa accctccaac acctagcatt catcgtttac ggcatggact 660
accagggtat ctaatcctgt tcgctaacca tgctttcgag cctcagcgta agttacagac 720
cagacagccg ccttcgccac tggtgttctt ccatatatct acgcatttca ccgctacaca 780
tggagttcca ctgtcctctt ctgcactcaa gtttcccagt ttccgatgca cttcctcggt 840
taagccgagg gctttcacat cagacttaaa aaaccgcctt cgctcgcttt acgcccaata 900
aattcggata acgcttgcca cctacgtatt accgcggctg ctggcacgta gttagccgtg 960
gctttctggt tggataccgt cacgccgaca acagttactc tgccgaccat tcttctccaa 1020
caacagagtt ttacgacccg aaagccttct tcactcacgc ggcgttgctc catcagactt 1080
gcgtccattg tggaagattt cctactgctg cctcccgtag gagtttgggc cgtgtctcag 1140
tcccaatgtg gccgatcaac ctctcagttc ggctacgtat cattgccttg gtgagccgtt 1200
acctcaccaa ctagctaata cgccgcgggt ccatccaaaa gcgatagctt acgccatctt 1260
tcagccaaga accatgcggt tcttggattt atgcggtatt agcatctgtt tccaaatgtt 1320
atcccccact taagggcagg ttaaccacgt gttactcacc cgtccgccac tcgttcaaaa 1380
ttaaatcaag atgcaagcac ctttcaataa tcagaactcg ttcgact 1427
Claims (10)
1.一种鼠李糖乳杆菌，其特征在于，所述鼠李糖乳杆菌的保藏编号为CCTCC NO：M2022337。
2.如权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌，其特征在于，所述鼠李糖乳杆菌的16s rDNA序列如SEQ ID NO：1所示。
3.权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌在制备具有降低胆固醇功能的制品中的应用。
4.权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌在制备具有抗氧化功能的制品中的应用。
5.权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌在制备具有预防或治疗腹泻功能的制品中的应用。
6.如权利要求3-5任一所述的应用，其特征在于，所述的制品为药品、保健品或食品。
7.一种乳酸菌饮料，其特征在于，所述的乳酸菌饮料是通过将权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌进行发酵制备的。
8.如权利要求7所述的乳酸菌饮料，其特征在于，所述的乳酸菌饮料中活菌数超过10亿/mL。
9.权利要求7或8所述的乳酸菌饮料的制备方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：
（1）配制液体发酵培养基，灭菌；
（2）按发酵量的2-5%将发酵乳杆菌接种至液体发酵培养基中；
（3）发酵温度36～40℃，发酵时间为15～18h；
（4）将发酵液进行无菌灌装，包装，即得乳酸菌饮料。
10.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述的液体发酵培养基为复原脱脂乳，浓度为120 g/L。
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