CN108404114B - 一种金黄色葡萄球菌抗菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种金黄色葡萄球菌抗菌剂，所述金黄色葡萄球菌抗菌剂包括干酪乳杆菌L.casei ATCC 334 S‑层蛋白和乳酸链球菌素。本发明还公开了一种金黄色葡萄球菌抗菌剂的制备方法和应用。本发明的干酪乳杆菌L.casei ATCC 334 S‑层蛋白与乳酸链球菌素对金黄色葡萄球菌具有协同抑制作用，该抗菌剂的抑菌效果远远超出单独使用干酪乳杆菌L.casei ATCC 334 S‑层蛋白或乳酸链球菌素的效果，本发明的抗菌剂的金黄色葡萄球菌的抑制率可高达87.19%。

Description

一种金黄色葡萄球菌抗菌剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种金黄色葡萄球菌抗菌剂及其制备方法和应用。
背景技术
食源性病原金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)属于革兰氏阳性球菌，能引起许多严重感染，诸如引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等甚至败血症、脓毒症等全身感染。易被S.aureus污染的食品主要有奶、肉、蛋、鱼及其制品，在我国它是引起食物中毒的主要病原菌。随着中国乳制品的发展，乳制品质量安全问题获得人们广泛关注。生乳极易受乳牛乳腺炎、环境、器具、操作人员等所带的S.aureus污染，引起食源性疾病。为了减少S.aureus污染的风险，牛奶及其乳制品加工中会添加化学防腐剂或者抗生素。然而，在食品加工过程中使用化学防腐剂会损害食品原有品质以及对人体健康造成伤害。使用安全无毒的天然抗菌物质来代替合成添加剂对食品的安全保鲜非常重要，微生物来源的抗菌肽或抗菌蛋白是其中一种安全无毒的杀菌剂。
S-层蛋白是细菌表层的一种蛋白成分，具有自组装功能，在超滤膜和分子筛、脂质体、多功能S-层纳米器件、超晶格金属纳米粒子等应用方面有所报道。由于S-层蛋白的基因多样性，不同来源的S-层晶格结构和生物学特性千差万别，相关研究主要集中在古菌属。有关乳杆菌S-层蛋白的研究起步较晚，且主要集中在其黏附及免疫调节功能方面。近年来有研究显示少数乳杆菌S-层蛋白能够裂解革兰氏阳性病原菌细胞壁，报道目前仅限于嗜酸乳杆菌、瑞士乳杆菌和卷曲乳杆菌，其中卷曲乳杆菌S-层蛋白与乳酸链球菌素(Nisin)对多种致病菌均具有极显著的协同杀菌作用。现今化学抗菌剂的安全性存在争议，天然的抗菌剂便受到青睐。乳酸链球菌素具有易被人体消化分解，无毒性，用量少，价格低廉等优点，但是其抗菌谱较窄。
发明内容
发明目的：基于上述存在的问题，本发明通过将乳酸链球菌素与提取的干酪乳杆菌S-层蛋白协同作用于金黄色葡萄球菌，大大增强各自抗菌性能，不论是在食品行业还是医药行业，都是更加安全可靠的新一代绿色抗菌剂。因此，本发明所要解决的技术问题是提供了一种用于抑制金黄色葡萄球菌的抗菌剂，利用干酪乳杆菌L.casei ATCC 334 S-层蛋白和乳酸链球菌素的协同作用，增强对食品工业与医药行业常见金黄色葡萄球菌的抑制作用，为开发新型绿色安全的抗菌剂以及拓展乳杆菌S-层蛋白的应用提供信息参考。
本发明还要解决的技术问题是提供了金黄色葡萄球菌抗菌剂的制备方法。
本发明最后要解决的技术问题是提供了金黄色葡萄球菌抗菌剂的应用。
技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种金黄色葡萄球菌抗菌剂，所述金黄色葡萄球菌抗菌剂包括干酪乳杆菌L.casei ATCC 334 S-层蛋白和乳酸链球菌素。
其中，所述金黄色葡萄球菌抗菌剂包括10-60重量份的干酪乳杆菌L.casei ATCC334 S-层蛋白和100-300重量份的乳酸链球菌素。
其中，所述乳酸链球菌素为标准品，其效价为1*106IU/g。
本发明内容还包括所述的金黄色葡萄球菌抗菌剂的制备方法，包括以下步骤：
1)干酪乳杆菌L.casei ATCC 334 S-层蛋白的制备；
2)乳酸链球菌素标准品的配制；
3)将步骤1)制备的干酪乳杆菌L.casei ATCC 334 S-层蛋白与步骤2)的乳酸链球菌素标准品混合均匀，即为金黄色葡萄球菌抗菌剂。
其中，所述步骤1)的干酪乳杆菌L.casei ATCC 334 S-层蛋白的制备方法包括如下步骤：
1)取-20℃甘油管保存的干酪乳杆菌L.casei ATCC 334按2-4％的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃恒温培养18～24h后，再按2-4％的接种量活化于 MRS液体培养基中，37℃恒温培养18～24h得到培养液，备用；
2)取步骤1)的干酪乳杆菌培养液离心，收集菌体，PBS清洗并再次离心收集湿菌体；
3)将步骤2)湿菌体用LiCl溶液重悬混匀，37℃温育10～30min，离心，弃上清，盐酸胍溶液重悬混匀，于37℃恒温培养箱中处理0.5-3h，离心，收集上清；
4)将步骤3)的上清移入14kDa分子截留量的透析袋中，4℃去离子水中透析48h后，离心取上清，即为干酪乳杆菌S-层粗蛋白，将蛋白冻干得到S-层粗蛋白冻干粉；
5)通过SP Sepharose预装柱对S-层粗蛋白冻干粉进行纯化得到纯化的干酪乳杆菌L.casei ATCC 334 S-层蛋白。
其中，所述步骤2)中的离心条件为5000～5600r/min，10～15min；所述步骤 3)中的离心条件为8000～12000r/min，10～15min；所述步骤4)的离心条件为 8000～12000r/min，10～15min。
其中，所述步骤3)的每克湿菌体中加入10mL的4-6mol/L的LiCl溶液，每克湿菌体加入5mL的3-5mol/L盐酸胍。
其中，所述步骤5)的纯化步骤如下：将步骤4)得到的S-层粗蛋白冻干粉溶于Buffer A，上样，采用Buffer B对凝胶柱进行洗脱，将主峰洗脱液进行透析、离心、冻干，即为纯化的表层蛋白，即为干酪乳杆菌L.casei ATCC 334 S-层蛋白。
其中，所述Buffer A缓冲液包含：8mol/L尿素以及50mmol/L Tris-HCl溶液，pH7.0。
其中，所述Buffer B缓冲液包含：8mol/L尿素，50mmol/L Tris-HCl溶液以及1mol/L NaCl，pH 7.0。
本发明内容还包括所述的金黄色葡萄球菌抗菌剂在食品或医药领域方面的应用。
有益效果：本发明以干酪乳杆菌L.casei ATCC 334 S-层蛋白和乳酸链球菌素为原料，通过两者对金黄色葡萄球菌的协同抑制作用达到对金黄色葡萄球菌的微量高效抑制作用。将该抗菌剂代替传统抗菌剂加入到食品中，在人体内易被消化道中一些蛋白酶降解、不产生耐药性、无毒、高效等特点，并且对食品的色、香、味等无不良影响。将制备的抗菌剂添加到接种金黄色葡萄球菌的培养基中，结果表明S-层蛋白与乳酸链球菌素对金黄色葡萄球菌具有协同抑制作用，该抗菌剂的抑菌效果远远超出单独使用干酪乳杆菌S-层蛋白或乳酸链球菌素的效果。
附图说明
图1为干酪乳杆菌ATCC 334的生长曲线、pH变化曲线；
图2为干酪乳杆菌ATCC 334在不同pH下干酪乳杆菌的生长曲线；
图3为干酪乳杆菌ATCC 334的S-层结构TEM电镜图；
图4为利用本发明实施例5所述用于金黄色葡萄球菌抗菌剂处理后的金黄色葡萄球菌的生长曲线图；
图5为利用本发明实施例6所述用于金黄色葡萄球菌抗菌剂处理后的金黄色葡萄球菌的生长曲线图；
图6为利用本发明实施例7所述用于金黄色葡萄球菌抗菌剂处理后的金黄色葡萄球菌的生长曲线图；
图7为利用本发明实施例8所述用于金黄色葡萄球菌抗菌剂处理后的金黄色葡萄球菌的生长曲线图；
图8为利用本发明实施例9所述用于金黄色葡萄球菌抗菌剂处理后的金黄色葡萄球菌的生长曲线图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于申请所附权利要求书所限定的范围。
除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
实施例1干酪乳杆菌L.casei ATCC 334的生长情况、产酸能力及干酪乳杆菌 S-层结构观察
1、干酪乳杆菌L.casei ATCC 334的生长情况：取-20℃甘油管保存的干酪乳杆菌(扬州大学食品科学与工程学院发酵实验室保存)按2％(v/v)的接种量接种于10mL MRS液体培养基中，37℃恒温培养箱培养20h后，再按2％(v/v) 的接种量活化于MRS液体培养基中，37℃恒温培养20h，备用。将活化好的干酪乳杆菌ATCC 334培养液按照2％(v/v)的接种量接种于10mL的MRS液体培养基，37℃恒温培养箱中培养24h，从0h开始，每隔2h测一次OD600nm值及pH值，每次检测重复三次，绘制干酪乳杆菌的生长曲线及pH变化曲线。干酪乳杆菌的生长曲线及pH变化曲线如图1所示。由图可知，干酪乳杆菌在20h 时生物量(OD600nm)达到最大值，故选择培养了20h的干酪乳杆菌进行表层结构蛋白提取。同时可见该干酪乳杆菌在整个生长过程中pH随时间的延长而下降。
2、干酪乳杆菌耐酸性：将步骤1中活化好的干酪乳杆菌培养液按2％(v/v) 的接种量分别接种至不同初始pH(pH 5.5、pH 5.0、pH 4.0、pH 3.5)的MRS液体培养基中，37℃恒温培养24h，从0h开始，每隔2h测一次OD600nm值。如图2所示，随着pH值的下降，干酪乳杆菌的生长速度亦逐步减缓。此外，在pH 3.5的条件下，干酪乳杆菌仍能快速繁殖和生长，说明受到表层结构的保护，干酪乳杆菌具有较强的酸适应能力，能够在较低pH条件下存活。
3、酪乳杆菌S-层结构观察：将干酪乳杆菌菌悬液于4℃下8000r/min冷冻离心10min收集菌体，用0.01M无菌PBS(pH 7.4)洗涤两次。处理组为菌体经5mol/L LiCl溶液处理后重悬于PBS，对照组即为直接将菌体重悬于PBS，并对LiCl溶液处理前后的干酪乳杆菌进行观察。菌体重悬于PBS后，将对照组和处理组样品分别滴至专用铜网上，自然晾干10min后，用2％磷钨酸染色2min，滤纸吸除多余染液，自然挥干，在透射电子显微镜(TEM)下观察。
采用透射电镜进一步观察表明，干酪乳杆菌ATCC 334存在S-层结构(见图 3a)，通过LiCl溶液处理菌株后，其S-层被成功脱除(见图3b)，说明S-层结构与菌株是通过共价键相连。
实施例2干酪乳杆菌L.casei ATCC 334的S-层蛋白的提取
取实施例1培养的生长至对数期的干酪乳杆菌L.casei ATCC 334的培养液5000r/min离心15min，收集菌体；用0.01M PBS(pH 7.4)清洗两次并再次离心收集菌体；将湿菌体用5mol/L LiCl溶液重悬混匀，37℃温育30min，8000r/min 离心15min，弃上清，加入4mol/L盐酸胍溶液重悬混匀，于37℃恒温培养箱中处理1h，离心(8000r/min，15min)，收集上清；将上清移入14kDa分子截留量的透析袋中，4℃去离子水中透析48h后，12000r/min离心15min，取上清，冻干。
实施例3干酪乳杆菌L.casei ATCC 334的S-层蛋白的提取
取实施例1培养的生长至对数期的干酪乳杆菌L.casei ATCC 334的培养液5600r/min离心10min，收集菌体；用0.01M PBS(pH 7.4)清洗两次并再次离心收集菌体；将湿菌体用5mol/L LiCl溶液重悬混匀，37℃温育10min，12000 r/min离心10min，弃上清，加入3mol/L盐酸胍溶液重悬混匀，于37℃恒温培养箱中处理0.5h，离心(12000r/min，10min)，收集上清；将上清移入14kDa 分子截留量的透析袋中，4℃去离子水中透析48h后，12000r/min离心15min，取上清，冻干。
实施例4干酪乳杆菌L.casei ATCC 334的S-层蛋白的提取
取实施例1培养的生长至对数期的干酪乳杆菌L.casei ATCC 334的培养液5300r/min离心13min，收集菌体；用0.01M PBS(pH 7.4)清洗两次并再次离心收集菌体；将湿菌体用5mol/L LiCl溶液重悬混匀，37℃温育25min，10000 r/min离心13min，弃上清，加入5mol/L盐酸胍溶液重悬混匀，于37℃恒温培养箱中处理3h，离心(10000r/min，13min)，收集上清；将上清移入14kDa 分子截留量的透析袋中，4℃去离子水中透析48h后，12000r/min离心15min，取上清，冻干。
实施例5金黄色葡萄球菌抗菌剂的制备
金黄色葡萄球菌抗菌剂包括实施例2制备的干酪乳杆菌L.casei ATCC 334 S-层蛋白20份和150重量份的乳酸链球菌素，其中干酪乳杆菌L.casei ATCC 334 S-层蛋白浓度为20μg/mL，乳酸链球菌素浓度为150μg/mL。该乳酸链球菌素为标准品效价为1*106IU/g。
实施例6金黄色葡萄球菌抗菌剂的制备
金黄色葡萄球菌抗菌剂包括实施例3制备的干酪乳杆菌L.casei ATCC 334 S-层蛋白15重量份和乳酸链球菌素200份，其中干酪乳杆菌L.casei ATCC 334 S- 层蛋白浓度为15μg/mL，乳酸链球菌素浓度为200μg/mL。该乳酸链球菌素为标准品效价为1*106IU/g。
实施例7金黄色葡萄球菌抗菌剂的制备
金黄色葡萄球菌抗菌剂包括实施例4制备的的干酪乳杆菌L.casei ATCC 334 S-层蛋白10份和乳酸链球菌素300份，其中干酪乳杆菌L.casei ATCC 334 S- 层蛋白浓度为10μg/mL，乳酸链球菌素浓度为300μg/ml。该乳酸链球菌素为标准品效价为1*106IU/g。
实施例8金黄色葡萄球菌抗菌剂的制备
金黄色葡萄球菌抗菌剂包括实施例2制备的干酪乳杆菌L.casei ATCC 334 S-层蛋白60重量份和乳酸链球菌素100份，其中干酪乳杆菌L.casei ATCC 334 S- 层蛋白浓度为60μg/mL，乳酸链球菌素浓度为100μg/mL。该乳酸链球菌素为标准品效价为1*106IU/g。
实施例9金黄色葡萄球菌抗菌剂的制备
金黄色葡萄球菌抗菌剂包括实施例2制备的干酪乳杆菌L.casei ATCC 334 S-层蛋白35份和乳酸链球菌素200份，其中干酪乳杆菌L.casei ATCC 334S-层蛋白浓度为35μg/mL，乳酸链球菌素浓度为200μg/mL。该乳酸链球菌素为标准品效价为1*106IU/g。
实施例10金黄色葡萄球菌抗菌剂对金黄色葡萄球菌的生长影响
取-20℃甘油管保存的金黄色葡萄球菌CICC 22936(中国工业微生物菌种保藏管理中心)按2％(v/v)的接种量接种于LB液体培养基中，37℃恒温摇床培养16h，再按2％(v/v)的接种量活化于LB液体培养基中，37℃恒温摇床培养 16h，以此提高菌株活力，备用。取活化好的金黄色葡萄球菌菌悬液混匀加入 LB液体培养基中，接种量2％(v/v)。设置四个组别：对实验组1加入干酪乳杆菌S-层蛋白(终浓度20μg/mL)，实验组2加入乳酸链球菌素(终浓度150 IU/mL)，实验组3加入实施例5制备的抗菌剂，对照组只接种金黄色葡萄球菌菌液，37℃摇床振荡培养10h，每2h测一次OD600nm值。绘制各条件下金黄色葡萄球菌的生长曲线图。同一培养时间，实验组的吸光度值记为AT，对照组的吸光度值记为AC，按照公式
Figure RE-GDA0001679797660000081
计算金黄色葡萄球菌的生长抑制率。
由图4可知，10h后，在干酪乳杆菌S-层蛋白和乳酸链球菌素分别单独作用下，对金黄色葡萄球菌的抑制率分别为16.23％和51.23％；而在实施例5金黄色葡萄球菌抗菌剂作用下，对金黄色葡萄球菌的抑制率可达87.19％，结果表明 S-层蛋白与乳酸链球菌素对金黄色葡萄球菌具有协同抑制作用。
实施例11
取-20℃甘油管保存的金黄色葡萄球菌CICC 22936(中国工业微生物菌种保藏管理中心)按2％(v/v)的接种量接种于LB液体培养基中，37℃恒温摇床培养16h，再按2％(v/v)的接种量活化于LB液体培养基中，37℃恒温摇床培养 16h，以此提高菌株活力，备用。取活化好的金黄色葡萄球菌菌悬液混匀加入 LB液体培养基中，接种量2％(v/v)。设置四个组别：对实验组1加入干酪乳杆菌S-层蛋白(终浓度15μg/mL)，实验组2加入乳酸链球菌素(终浓度200 IU/mL)，实验组3加入实施例6制备的抗菌剂，对照组只接种金黄色葡萄球菌菌液，37℃摇床振荡培养10h，每2h测一次OD600nm值。绘制各条件下金黄色葡萄球菌的生长曲线图。
由图5可知，同一培养时间，实验组的吸光度值记为AT，对照组的吸光度值记为AC，按照公式
Figure RE-GDA0001679797660000081
计算金黄色葡萄球菌的生长抑制率。10h后，在干酪乳杆菌S-层蛋白和乳酸链球菌素分别单独作用下，对金黄色葡萄球菌的抑制率分别为11.93％和57.00％；而在实施例6金黄色葡萄球菌抗菌剂作用下，对金黄色葡萄球菌的抑制率可达80.79％，结果表明S-层蛋白与乳酸链球菌素对金黄色葡萄球菌具有协同抑制作用。
实施例12
取-20℃甘油管保存的金黄色葡萄球菌CICC 22936(中国工业微生物菌种保藏管理中心)按2％(v/v)的接种量接种于LB液体培养基中，37℃恒温摇床培养16h，再按2％(v/v)的接种量活化于LB液体培养基中，37℃恒温摇床培养16h，以此提高菌株活力，备用。取活化好的金黄色葡萄球菌菌悬液混匀加入 LB液体培养基中，接种量2％(v/v)。设置四个组别：对实验组1加入干酪乳杆菌S-层蛋白(终浓度10μg/mL)，实验组2加入乳酸链球菌素(终浓度300 IU/mL)，实验组3加入实施例7制备的抗菌剂，对照组只接种金黄色葡萄球菌菌液，37℃摇床振荡培养10h，每2h测一次OD600nm值。绘制各条件下金黄色葡萄球菌的生长曲线图。
由图6可知，同一培养时间，实验组的吸光度值记为AT，对照组的吸光度值记为AC，按照公式
Figure RE-GDA0001679797660000081
计算金黄色葡萄球菌的生长抑制率。10h后，在干酪乳杆菌S-层蛋白和乳酸链球菌素分别单独作用下，对金黄色葡萄球菌的抑制率分别为5.38％和64.34％；而在实施例7金黄色葡萄球菌抗菌剂作用下，对金黄色葡萄球菌的抑制率可达82.24％，结果表明S-层蛋白与乳酸链球菌素对金黄色葡萄球菌具有协同抑制作用。
实施例13
取-20℃甘油管保存的金黄色葡萄球菌CICC 22936(中国工业微生物菌种保藏管理中心)按2％(v/v)的接种量接种于LB液体培养基中，37℃恒温摇床培养16h，再按2％(v/v)的接种量活化于LB液体培养基中，37℃恒温摇床培养 16h，以此提高菌株活力，备用。取活化好的金黄色葡萄球菌菌悬液混匀加入 LB液体培养基中，接种量2％(v/v)。设置四个组别：对实验组1加入干酪乳杆菌S-层蛋白(终浓度60μg/mL)，实验组2加入乳酸链球菌素(终浓度100 IU/mL)，实验组3加入实施例8制备的抗菌剂，对照组只接种金黄色葡萄球菌菌液，37℃摇床振荡培养10h，每2h测一次OD600nm值。绘制各条件下金黄色葡萄球菌的生长曲线图。
由图7可知，同一培养时间，实验组的吸光度值记为AT，对照组的吸光度值记为AC，按照公式
Figure RE-GDA0001679797660000081
计算金黄色葡萄球菌的生长抑制率。10h后，在干酪乳杆菌S-层蛋白和乳酸链球菌素分别单独作用下，对金黄色葡萄球菌的抑制率分别为30.00％和31.73％；而在实施例8金黄色葡萄球菌抗菌剂作用下，对金黄色葡萄球菌的抑制率可达79.33％，结果表明S-层蛋白与乳酸链球菌素对金黄色葡萄球菌具有协同抑制作用。
实施例14
取-20℃甘油管保存的金黄色葡萄球菌CICC 22936(中国工业微生物菌种保藏管理中心)按2％(v/v)的接种量接种于LB液体培养基中，37℃恒温摇床培养16h，再按2％(v/v)的接种量活化于LB液体培养基中，37℃恒温摇床培养 16h，以此提高菌株活力，备用。取活化好的金黄色葡萄球菌菌悬液混匀加入 LB液体培养基中，接种量2％(v/v)。设置四个组别：对实验组1加入干酪乳杆菌S-层蛋白(终浓度35μg/mL)，实验组2加入乳酸链球菌素(终浓度200 IU/mL)，实验组3加入实施例9制备的抗菌剂，对照组只接种金黄色葡萄球菌菌液，37℃摇床振荡培养10h，每2h测一次OD600nm值。绘制各条件下金黄色葡萄球菌的生长曲线图。
由图8可知，同一培养时间，实验组的吸光度值记为AT，对照组的吸光度值记为AC，按照公式
Figure RE-GDA0001679797660000081
计算金黄色葡萄球菌的生长抑制率。10h后，在干酪乳杆菌S-层蛋白和乳酸链球菌素分别单独作用下，对金黄色葡萄球菌的抑制率分别为19.20％和57.06％；而在实施例9金黄色葡萄球菌抗菌剂作用下，对金黄色葡萄球菌的抑制率可达90.24％。

Claims (8)

1. 一种金黄色葡萄球菌抗菌剂，其特征在于，所述金黄色葡萄球菌抗菌剂包括10-60重量份的干酪乳杆菌L. casei ATCC 334 S-层蛋白和100-300重量份的乳酸链球菌素，所述乳酸链球菌素为标准品，其效价为1*106 IU/g，
所述的金黄色葡萄球菌抗菌剂的制备方法，包括以下步骤：
1）干酪乳杆菌L. casei ATCC 334 S-层蛋白的制备；
2）乳酸链球菌素标准品的配制；
3）将步骤1）制备的干酪乳杆菌L. casei ATCC 334 S-层蛋白与步骤2）的乳酸链球菌素标准品混合均匀，即为金黄色葡萄球菌抗菌剂；
所述步骤1）的干酪乳杆菌L. casei ATCC 334 S-层蛋白的制备方法包括如下步骤：
s1）取-20℃甘油管保存的干酪乳杆菌L. casei ATCC 334按2-4%的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃恒温培养18~24 h后，再按2-4%的接种量活化于MRS液体培养基中，37℃恒温培养18~24 h得到培养液，备用；
s2）取步骤s1）的干酪乳杆菌L. casei ATCC 334的培养液离心，收集菌体，PBS清洗并再次离心收集湿菌体；
s3）将步骤s2）的湿菌体用LiCl溶液重悬混匀，37℃温育10~30 min，离心，弃上清，盐酸胍溶液重悬混匀，于37℃恒温培养箱中处理0.5-3 h，离心，收集上清；
s4）将步骤s3）的上清移入14kDa分子截留量的透析袋中，4℃去离子水中透析48h后，离心取上清，即为干酪乳杆菌L. casei ATCC 334S-层粗蛋白，将蛋白冻干得到S-层粗蛋白冻干粉；
s5）通过SP Sepharose预装柱对S-层粗蛋白冻干粉进行纯化得到纯化的干酪乳杆菌L. casei ATCC 334 S-层蛋白。
2.权利要求1所述的金黄色葡萄球菌抗菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）干酪乳杆菌L. casei ATCC 334 S-层蛋白的制备；
2）乳酸链球菌素标准品的配制；
3）将步骤1）制备的干酪乳杆菌L. casei ATCC 334 S-层蛋白与步骤2）的乳酸链球菌素标准品混合均匀，即为金黄色葡萄球菌抗菌剂。
3.根据权利要求2所述的金黄色葡萄球菌抗菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤1）的干酪乳杆菌L. casei ATCC 334 S-层蛋白的制备方法包括如下步骤：
1）取-20℃甘油管保存的干酪乳杆菌L. casei ATCC 334按2-4%的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃恒温培养18~24 h后，再按2-4%的接种量活化于MRS液体培养基中，37℃恒温培养18~24 h得到培养液，备用；
2）取步骤1）的干酪乳杆菌L. casei ATCC 334的培养液离心，收集菌体，PBS清洗并再次离心收集湿菌体；
3）将步骤2）的湿菌体用LiCl溶液重悬混匀，37℃温育10~30 min，离心，弃上清，盐酸胍溶液重悬混匀，于37℃恒温培养箱中处理0.5-3 h，离心，收集上清；
4）将步骤3）的上清移入14kDa分子截留量的透析袋中，4℃去离子水中透析48h后，离心取上清，即为干酪乳杆菌L. casei ATCC 334S-层粗蛋白，将蛋白冻干得到S-层粗蛋白冻干粉；
5）通过SP Sepharose预装柱对S-层粗蛋白冻干粉进行纯化得到纯化的干酪乳杆菌L. casei ATCC 334 S-层蛋白。
4.根据权利要求3所述的金黄色葡萄球菌抗菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤3）的每克湿菌体中加入10 mL的4-6 mol/L的LiCl溶液，每克湿菌体加入5 mL的3-5 mol/L的盐酸胍溶液。
5.根据权利要求3所述的金黄色葡萄球菌抗菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤5）的纯化步骤如下：将步骤4）中S-层粗蛋白冻干粉溶于Buffer A，上样，采用Buffer B对凝胶柱进行洗脱，将主峰洗脱液进行透析、离心、冻干，即为纯化的表层蛋白，即为干酪乳杆菌L. casei ATCC 334 S-层蛋白。
6.根据权利要求5所述的金黄色葡萄球菌抗菌剂的制备方法，其特征在于，所述BufferA缓冲液包含：8 mol/L尿素以及50 mmol/L Tris-HCl溶液，pH 7.0。
7.根据权利要求5所述的金黄色葡萄球菌抗菌剂的制备方法，其特征在于，所述BufferB缓冲液包含：8 mol/L尿素，50 mmol/L Tris-HCl溶液以及1 mol/L NaCl，pH 7.0。
8.权利要求1所述的金黄色葡萄球菌抗菌剂在制备食品或医药领域抗菌剂方面的应用。
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