CN107488220A

CN107488220A - 一种植物乳杆菌细菌素及其制备方法和应用

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Publication number: CN107488220A
Application number: CN201710805778.3A
Authority: CN
Inventors: 李�权; 李一权
Original assignee: Jilin Kaibo Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Jilin Kaibo Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2017-09-08
Filing date: 2017-09-08
Publication date: 2017-12-19
Anticipated expiration: 2037-09-08
Also published as: CN107488220B

Abstract

本发明公开了一种植物乳杆菌细菌素及其制备方法和应用，属于生物技术领域，采用的技术方案是，一种植物乳杆菌细菌素，所述细菌素由植物乳杆菌CGMCC 1.557产生。所述细菌素的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明方法具有如下优点：本发明提供的植物乳杆菌细菌素及以植物乳杆菌细菌素作为有效成分组成的抗感染制剂不仅能抑制革兰氏阳性菌，还能有效抑制革兰氏阴性菌，抑菌、尤其是抑制耐药菌株感染的活性高；通过对发酵条件、培养基组成及分离纯化条件的优化，提供了高效制备性能优良的细菌素的方法；本发明的方法严谨、工艺条件科学，易于实现工业化生产，具备成为抗感染药物制剂替代抗生素的潜力。

Description

一种植物乳杆菌细菌素及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种植物乳杆菌细菌素及其制备方法和应用。

背景技术

细菌素是由乳杆菌在代谢过程中由核糖体合成的一类具有抑菌活性的蛋白质、多肽或前体多肽，是一种耐高温、耐酸且具有较强抑菌活性的抗菌短肽。抑菌范围不仅仅局限于同源的细菌，产生菌对其细菌素具有自身免疫性。细菌素作为一种特殊的抗菌抑菌蛋白质，具有抑菌活性强、生物相容性好、性能稳定、可生物降解、可消化吸收、生物安全性高的特点，在食品发酵领域、预防及治疗畜禽疾病、生产绿色生物饲料添加剂和生物兽药领域具有广阔的开发应用前景。

乳杆菌是公认的益生菌，抗感染是益生菌的一个重要特性，乳酸菌的抗感染活性研究十分广泛。引起人类和多种动物的许多严重感染的一种重要病原菌是金黄色葡萄球菌，且金黄色葡萄球菌普遍存在多种耐药性菌株，是医源性感染的重要来源，对畜牧生产和人类健康造成严重威胁，为此，广谱抗生素的大范围普及甚至是滥用，尤其在发展中国家，由于卫生条件差，抗生素使用普遍，因其产生的继发感染也更为普遍，所带来的负面效应日益突出。开发有效的抗感染药物及新型抗感染制剂迫在眉睫，越来越多的研究将抗菌转向细菌素，然而，与近些年广泛而深入的研究形成鲜明对比的是，迄今为止，只有乳酸乳球菌分泌的主要针对格兰仕阳性菌的Nisin得到了深入研究并作为成熟的商品化细菌素广泛应用于多种领域。其它自然界中种类繁多的乳酸菌并没有在细菌素的开发中显露出重要角色，其中有诸多原因，如其它乳酸菌产量低、菌株不稳定、抑菌谱窄等。

综上可见，研究能产生细菌素的乳酸菌、开发制备新型有效的细菌素及抗感染药物对人类及动物的健康、食品安全等具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种植物乳杆菌细菌素及其制备方法和应用，用以解决现有细菌素产量低、抑菌活性差及不能广泛生产的问题，通过对植物乳杆菌CGMCC 1.557抑菌特性的研究，成功提取分离其中产生细菌素的基因序列及细菌素，其抑菌活性高、易于工业化生产，在制备抗感染制剂中应用前景广泛。

为实现上述目的，本发明首先提供一种植物乳杆菌细菌素，所述细菌素由植物乳杆菌CGMCC 1.557产生。

所述细菌素的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明还提供植物乳杆菌细菌素的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

(1)植物乳杆菌CGMCC 1.557的纯化培养：取菌种进行划线涂板，挑取单克隆细菌在固体培养基中连续传代4-10次后进行鉴定，将鉴定正确的菌株接种于MRS液体培养基中扩大培养18-48h至平台期，再以总体积1％量接种至发酵培养基，37℃发酵培养10-24h，得细菌发酵液；

(2)植物乳杆菌细菌素粗液的制备：将细菌发酵液以2500-5000rpm/min离心5-20min，弃去细菌沉淀，收集上层培养液，调整上层培养液pH至5.5-6.5，0.22μm过滤器，得植物乳杆菌细菌素粗液。

优选的，所述步骤(1)中发酵培养的条件如下：发酵培养基组成为1L中含50-120g碳源、50-150g氮源、0.1-0.15g KH₂PO₄、0.15-0.3g MgSO₄·7H₂O、0.15-0.25g MnSO₄·H₂O、5.0-8.0gCaCO₃、5.0-20g稀土元素硝酸盐、3.0-8.0g FeSO₄·4H₂O、5-10g乙酸钠、柠檬酸二胺1.0-2.0g和1.0-1.5mL吐温80，所述碳源为葡萄糖、蔗糖以质量比1:1.5-3混合而成。

优选的，所述步骤(2)中为以1M的NaOH溶液调整上层培养液pH至6.0。

优选的，所述步骤(2)中离心条件为4000rpm/min离心10min。

本发明还提供上述植物乳杆菌细菌素在制备抑制细菌增殖产品中的应用。

所述细菌为革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌。

本发明还提供一种抗感染制剂，所述抗感染制剂中有效成分包括上述的植物乳杆菌细菌素。

最后本发明还提供编码上述植物乳杆菌细菌素的一种DNA序列，所述DNA序列如SEQ ID NO：2所示。

上述技术方案中，提供一种新型的植物乳杆菌细菌素，是深入研究植物乳杆菌CGMCC 1.557(拉丁学名Lactobacilus plantarum subsp.plantarum)的抗感染活性后科学研究、分离或制备所得，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，不仅能抑制革兰氏阳性菌，如金黄色葡萄球菌，还能有效抑制革兰氏阴性菌，如大肠杆菌，还表现出了良好的免疫调节活性，能减少了药物治疗感染时带来的副作用，且不受到耐药菌株感染的限制，有望替代抗生素广泛应用于抗感染药物制剂。

本发明方法具有如下优点：(1)本发明提供的植物乳杆菌细菌素及以植物乳杆菌细菌素作为有效成分的抗感染制剂抑菌活性高，尤其是抑制耐药菌株感染的活性高；(2)提供的制备方法及工艺条件严谨、科学，保证了高效制备性能优良的细菌素，易于实现工业化生产，具备成为抗感染药物制剂替代抗生素潜力；(3)进一步改进的技术方案中，对培养基组分、发酵条件、纯化条件进行了优化，大大提高了细菌素产量。

附图说明

图1为实施例1中植物乳杆菌CGMCC 1.557分子鉴定结果。

图2为实施例1中植物乳杆菌CGMCC 1.557全基因组测序结果。

图3为实施例1中植物乳杆菌CGMCC 1.557系统进化树结果。

图4为实施例1中植物乳杆菌CGMCC 1.557细菌素基因位点图。

图5为实施例1中本发明植物乳杆菌细菌素粗液抑菌金黄色葡萄球菌的结果图。

图6为图5中蛋白酶K处理植物乳杆菌细菌素粗液后抑菌金黄色葡萄球菌的结果图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围，实施例中所涉及的方法如无特殊说明，均为常规方法，所涉及的试剂，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1植物乳杆菌益生菌株CGMCC 1.557的全基因组序列及细菌素的基因序列的获得

1、植物乳杆菌CGMCC 1.557菌株培养和保存

使用接种环蘸取少量菌液涂布于培养皿中固体MRS培养基，放入37℃培养箱中，厌氧培养24h后，取出用无菌枪头挑取单克隆菌落，转接至新的MRS液体培养基，继续培养，以后每隔12h再次以1％体积转接，连续传代5次后，提取全基因组进行测序，测序结果与NCBI中基因信息比对，将鉴定正确的菌株连续传代50次，再次以接种环蘸去少量菌液涂布于固体培养基中，挑取单克隆用于实验或冷冻保存。

其中，植物乳杆菌CGMCC 1.557总DNA的提取方法如下：

(1)将单个菌落接种于MRS培养基中，37℃厌氧培养24h至平台期，再以总体积1％量接种至发酵培养基，37℃发酵培养10-24h，得细菌发酵液；

离心去除上清，向菌体沉淀物中加入20ug/mL溶菌酶，37℃处理30min，离心除去溶菌酶，加入SDS(十二烷基磺酸钠)、蛋白酶K等除去杂质蛋白，高盐环境下沉淀获得基因组DNA；

(2)利用苯酚：氯仿：异戊醇法抽提DNA；

(3)以乙酸盐沉淀法获得基因组DNA沉淀，再以70～75％乙醇洗涤一次，室温晾干，RTE缓冲液充分溶解，得植物乳杆菌CGMCC 1.557总DNA。

植物乳杆菌CGMCC 1.557总DNA的PCR扩增及测序如下：

(1)以基因组DNA为模板，以细菌通用引物和植物乳杆菌特异性引物为引物，根据引物说明设定Tm值，按照Taq预混液说明书进行PCR扩增，完成后进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定(结果见图1)

上述的细菌通用引物为16S rRNA扩增引物20F、1500R，20F序列为AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，1500R序列为GGTTACCTTGTTACGACTT，植物乳杆菌特异性引物为F1和R1，F1序列为GCCGCCTAAGGTGGGACAGAT，R1序列为TTACCTAACGGTAAATGCGA。

(2)回收扩增产物进行连接，进行全基因组测序

首先，超声破碎基因组，构建文库；然后上机测序；再去除接头序列，组装基因组序列，使用二代测序对三代测序进行矫正；使用DNAplotter绘制CGMCC 1.557全基因组图，结果见图2；

传代培养的细菌保存方法：

(1)将保菌管和甘油以121℃灭菌15min，以备使用；

(2)每个保菌管分装300uL灭菌的甘油，并将连续转接3次的含菌体的MRS培养基菌液加入至甘油中，混匀后液氮中低温保藏。其中甘油与MRS培养基体积比为3:7。

2、系统进化分析及细菌素的基因序列

(1)对总DNA基因组在NCBI数据库进行基因注释，结果见表1；

表1总DNA基因注释

(2)基于16S rRNA基因确定CGMCC 1.557菌株在植物乳杆菌中的系统进化地位，分析结果如图3；

(3)借助BAGEL工具预测细菌素位点，结果见如图4，分析其分子量等，为制备植物乳杆菌细菌素粗液的条件提供依据。

3、制备植物乳杆菌细菌素粗液：将细菌发酵液以3000rpm/min离心15min，弃去细菌沉淀，收集上层培养液，调整上层培养液pH至5.5-6.5，0.22μm过滤器，得植物乳杆菌细菌素粗液。

4、植物乳杆菌CGMCC 1.557细菌素抑菌效果研究

通过微量肉汤稀释法与纸片法研究植物乳杆菌CGMCC 1.557细菌素粗液对大肠杆菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC25923和肠炎沙门氏菌肠炎亚种ATCC14028的抑菌效果。

(1)活化测试菌株

将大肠杆菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC25923和肠炎沙门氏菌肠炎亚种ATCC14028的菌株活化，使用一次性接种环沾取部分冻存菌液于LB琼脂平板上划线，37℃过夜培养，挑取单菌落于接种于2mL MH培养液中，37℃振荡培养16-18h。

(2)微量肉汤稀释法检测本发明植物乳杆菌细菌素的抑菌效果

参考CLSI标准(2016版)最小抑菌浓度(MIC)测定方法进行检测，操作如下：

①将培养16-18h的三种测试细菌分别以MH肉汤调至0.5麦氏比浊度，再进行1000倍稀释，备用；

②96孔培养板铺板设置：设置3块96孔板分别用于上述三种测试细菌，在每块板中，除培养基对照组和最高浓度组外，其余每孔均分别加入100μL MH培养液；最高浓度组每孔加入200μL培养上清液，然后吸取100μL加入下一梯度，进行2倍梯度系列稀释，每种受检测物质稀释7个梯度，每个梯度设置3个重复；培养基对照组，每组第一孔加入100μL MH培养液，第二孔和第三孔加入100μL MRS培养液；

③向96孔板的每孔均加入100μL植物乳杆菌细菌素粗液原液或梯度稀释的植物乳杆菌细菌素粗液，37℃培养16-18h，查看结果。

结果发现，以1/2浓度的培养上清液即对三种测试细菌均有良好的抑制效果，说明本发明植物乳杆菌细菌素抑菌效果良好。

(3)纸片法试验检测本发明植物乳杆菌细菌素的抑菌效果

参考CLSI(2016版)药物敏感性试验的测试抑菌效果：

①将按照步骤5制备的植物乳杆菌细菌素粗液和以蛋白酶K处理的植物乳杆菌细菌素粗液分别滴加到空白药敏片(OXOID)上，25μL/片，室温晾干，其中，35-60μg/mL蛋白酶K处理的条件为35-60μg/mL蛋白酶K，37℃作用45-90min，本实施例中以50μg/mL蛋白酶K，37℃作用50min；

②将培养16-18h的三种细菌调至0.5麦氏比浊度，分别吸取100μL涂布于MH琼脂平板，晾干后，将制作好的药敏片均匀地贴在上面，培养上清液和蛋白提取液对每株菌设置2个重复，37℃恒温箱中培养16-18h，观察抑菌圈的大小。

从3次药敏片检测结果发现，本发明植物乳杆菌培养上清液对金黄色葡萄球菌抑菌效果良好，抑菌圈大小达8mm(如图5)，以蛋白酶K处理后抑菌效果消失，抑菌圈大小达0mm(如图6)。

实施例2植物乳杆菌细菌素的制备方法中发酵条件优化及抑菌效果研究

本实施例为提高植物乳杆菌细菌素的产量，进一步对发酵条件进行了优化，实验设置了A、B、C和对照组共4组，培养方法分别如下：

取实施例1中鉴定正确的菌株接种于MRS液体培养基中扩大培养36h至平台期，再以总体积1％量接种至发酵培养基，37℃发酵培养12h，分别得到细菌发酵液；其中，对照组培养基选用基础培养基，其组分为1L中含100g碳源(葡萄糖、蔗糖以质量比1:1.5混合)、150g氮源、0.1g KH₂PO₄、0.15g MgSO₄·7H₂O、0.25g MnSO₄·H₂O、6.0g CaCO₃、5.0g FeSO₄·4H₂O、5g乙酸钠、柠檬酸二胺2.0g和1.0mL吐温80；A组选用添加5.0g硝酸铈的基础培养基，B组选用添加8.0g硝酸铈的基础培养基，C组选用添加15.0g硝酸铈的基础培养基；

(2)植物乳杆菌细菌素粗液的制备：将上述细菌发酵液分别以3500rpm/min离心15min，弃去细菌沉淀，收集上层培养液，调整上层培养液pH至6.0，0.22μm过滤器，得植物乳杆菌细菌素粗液。

对所得A、B、C和对照组的植物乳杆菌细菌素粗液分别按照实施例1中抑菌效果研究中(3)纸片法试验检测方法，进行对比实验，发现参加对比的4各实验组均具有良好的抑菌效果，其中A、B、C组所得植物乳杆菌细菌素粗液抑菌效果均强于对照组，分别比对照组抑菌效果提高46％、61％和77％，可以发现，其抑菌效果与培养基中稀土元素硝酸盐的浓度在测试范围内呈现浓度依赖性，说明稀土元素硝酸盐对细菌素的产生有促进作用，究其原因，在于碳源、氮源含量的提高和组成的配比优化，葡萄糖、蔗糖结合CaCO₃，氮源如常规的蛋白胨、酵母膏等与稀土元素硝酸盐和柠檬酸二胺结合，一方面对植物乳杆菌生长具有促进作用，更对其细菌素的产生具有高效促进作用。

实施例3不同培养基制备植物乳杆菌细菌素的抑菌效果研究

本实施例设置了A、B、C和对照组共4组，培养方法分别如下：取实施例1中鉴定正确的菌株接种于MRS液体培养基中扩大培养24h至平台期，再以总体积1％量接种至发酵培养基，37℃发酵培养18h，分别得到细菌发酵液；其中，对照组培养基选用基础培养基，其组分为1L中含80g碳源(葡萄糖、蔗糖以质量比1:2.5混合)、120g氮源、0.15g KH₂PO₄、0.25gMgSO₄·7H₂O、0.25g MnSO₄·H₂O、8.0g CaCO₃、5.0g FeSO4·4H₂O、5g乙酸钠、柠檬酸二胺2.0g和1.5mL吐温80；A组选用添加5.0g硝酸铈的基础培养基，B组选用添加8.0g硝酸铈的基础培养基，C组选用添加15.0g硝酸铈的基础培养基；

(2)植物乳杆菌细菌素粗液的制备：将上述细菌发酵液分别以4000rpm/min离心10min，弃去细菌沉淀，收集上层培养液，调整上层培养液pH至6.0，0.22um过滤器，得植物乳杆菌细菌素粗液。

对所得A、B、C和对照组的植物乳杆菌细菌素粗液分别按照实施例1中抑菌效果研究中(3)纸片法试验检测方法，进行对比实验，发现参加对比的4各实验组均具有良好的抑菌效果，其中A、B、C组所得植物乳杆菌细菌素粗液抑菌效果均强于对照组，分别比对照组抑菌效果提高38％、56％和72％，

实施例4植物乳杆菌细菌素的制备方法、纯化条件优化及抑菌效果研究

本实施例进一步对纯化条件进行了优化，实验设置了A、B、C共3组，培养方法分别如下：

取实施例1中鉴定正确的菌株接种于MRS液体培养基中扩大培养36h至平台期，再以总体积1％量接种至MRS发酵培养基，37℃发酵培养12h，分别得到细菌发酵液；

(2)植物乳杆菌细菌素粗液的制备：将上述细菌发酵液分别以3500rpm/min离心15min，弃去细菌沉淀，收集上层培养液，对A组所得上层培养液以1M的NaOH调整上层培养液pH至5.5，B组所得上层培养液以1M的NaOH调整上层培养液pH至6.0，A组所得上层培养液以1M的NaOH调整上层培养液pH至6.5，而后分别以0.22μm过滤器，得植物乳杆菌细菌素粗液。

对所得A、B、C组的植物乳杆菌细菌素粗液分别按照实施例1中抑菌效果研究中(3)纸片法试验检测方法，进行对比实验，发现3个实验组均具有良好的抑菌效果，而B组所得植物乳杆菌细菌素粗液抑菌效果强于A和C组抑菌效果比A和C组分别提高38％和52％，因此，调整上层培养液pH至6.0对细菌素的活性及保留率最高。

实施例5

对植物乳杆菌细菌素粗液，采用本领域常规硫酸铵沉淀、分级分离、HLC纯化或层析法等，对其中的蛋白成分进行分析，并以抑菌效果验证，从而确定细菌素的目标蛋白，其氨基酸序列即为SEQ ID NO：1所示。其编码序列可以为SEQ ID NO：2所示。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 吉林省凯博生物技术有限公司

<120> 一种植物乳杆菌细菌素及其制备方法和应用

<141> 2017-09-08

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 59

<212> PRT

<213> 植物乳杆菌(Lactobacilus plantarum subsp.plantarum)

<400> 1

Met Ala Leu Ser Ile Ser Ala Pro Leu Ala Leu Ala Gly Leu Gly Leu

1 5 10 15

Gly Ala Val Ala Gly Gly Ile Thr Gly Thr Ile Val Gly Gly Leu Gly

20 25 30

Pro Leu Ala Gly Ala Ala Thr Ser His Ser Ala Gly Ile Ser Ser Gly

35 40 45

Ile Leu Leu Ala Leu Leu Leu Gly Thr Gly Thr

50 55

<210> 2

<211> 180

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

atgagaaaaa gcatcagtaa ttttaaagca ttaaatgaaa aagaacttgg cgctgttaac 60

ggtgggattt ggcaatggat tgtgggcggt ttaggctttc ttgctggtga tgcatggtcc 120

cattcagatc aaatctcaag tggaattaaa aaacgcaaga aaaaaggtta tggctactag 180

Claims

1.一种植物乳杆菌细菌素，其特征在于，所述细菌素由植物乳杆菌CGMCC 1.557产生。

2.根据权利要求1所述的细菌素，其特征在于，所述细菌素的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

3.权利要求1所述植物乳杆菌细菌素的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

(2)粗制细菌素：将细菌发酵液以2500-5000rpm/min离心5-20min，弃去细菌沉淀，收集上层培养液，调整上层培养液pH至5.5-6.5，0.22μm过滤器，得植物乳杆菌细菌素粗液。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中发酵培养的条件如下：发酵培养基组成为1L中含50-120g碳源、50-150g氮源、0.1-0.15g KH₂PO₄、0.15-0.3gMgSO₄·7H₂O、0.15-0.25g MnSO₄·H₂O、5.0-8.0gCaCO₃、5.0-20g稀土元素硝酸盐、3.0-8.0gFeSO₄·4H₂O、5-10g乙酸钠、柠檬酸二胺1.0-2.0g和1.0-1.5mL吐温80，所述碳源为葡萄糖、蔗糖以质量比1:1.5-3混合而成。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中为以1M的NaOH溶液调整上层培养液pH至6.0。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中离心条件为4000rpm/min离心10min。

7.权利要求1所述植物乳杆菌细菌素在制备抑制细菌增殖产品中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述细菌为革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌。

9.一种抗感染制剂，其特征在于，所述抗感染制剂中有效成分包括权利要求1所述的植物乳杆菌细菌素。

10.一种编码权利要求1所述的植物乳杆菌细菌素的DNA序列，其特征在于，所述DNA序列如SEQ ID NO：2所示。