CN106190919B - 嗜根考克氏菌在降解真菌毒素中的应用 - Google Patents

嗜根考克氏菌在降解真菌毒素中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN106190919B
CN106190919B CN201610641825.0A CN201610641825A CN106190919B CN 106190919 B CN106190919 B CN 106190919B CN 201610641825 A CN201610641825 A CN 201610641825A CN 106190919 B CN106190919 B CN 106190919B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cock salmonella
thermophilic
mycotoxin
application
feed
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201610641825.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106190919A (zh
Inventor
王雅玲
孙力军
周浪花
刘颖
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangdong Ocean University
Original Assignee
Guangdong Ocean University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangdong Ocean University filed Critical Guangdong Ocean University
Priority to CN201610641825.0A priority Critical patent/CN106190919B/zh
Publication of CN106190919A publication Critical patent/CN106190919A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106190919B publication Critical patent/CN106190919B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Fodder In General (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明属于微生物应用技术领域公开了嗜根考克氏菌在降解真菌毒素中的应用。该微生物被鉴定为嗜根考克氏菌CAMT21651（KR‑51），于2016年6月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所；保藏编号为：GDMCC No：60048；该菌能够显著降低动物体内真菌毒素的残留量，从而为真菌毒素的生物防治奠定了基础。

Description

嗜根考克氏菌在降解真菌毒素中的应用
技术领域
本发明涉及微生物应用技术领域，更具体地，涉及嗜根考克氏菌在降解真菌毒素中的应用。
背景技术
真菌毒素是真菌在食品或饲料里生长所产生的代谢产物，对人类和动物都有害，真菌毒素污染是我国农产品质量和食品安全中的重大问题，食品安全关系到每个人的利益，因此有效的防止真菌毒素污染食品或农产品是一个亟需解决的问题。
现有技术中对于真菌毒素的防治可以分为物理法、化学药剂法和生物防治法，物理法治标不治本，化学药剂法效率高，对真菌毒素的杀伤力大，但却存在严重的化学药剂残留的问题，化学药剂的残留会使吃了饲料的动物体内残留，从而影响人类的身体健康；生物防治法主要是利用能够降解或者抑制体内残留的微生物防治真菌毒素，然而现有分离出来的微生物对毒素的降解作用太弱，出现的微生物种类少，难以满足真菌毒素的防治的需求。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述问题，发现了一株新嗜根考克氏菌，提供所述嗜根考克氏菌在降解真菌毒素中的应用。
本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：
嗜根考克氏菌在降解真菌毒素中的应用，嗜根考克氏菌被称为CAMT21651（KR-51），于2016年6月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所；保藏编号为：GDMCC No：60048，分类学命称：Kocuria rhizophila。
优选地，所述嗜根考克氏菌的16S rRNA的序列如SEQ ID NO：1所示。
优选地，所述嗜根考克氏菌为球状、革兰氏阳性，菌落为亮黄色，呈圆形凸起，整齐湿润不透明，菌落直径为0.423～1.283 mm。
优选地，所述嗜根考克氏菌的硝酸盐还原试验为阳性，接触酶阳性。
优选地，所述嗜根考克氏菌的氧化酶、V-P试验、吲哚试验、柠檬酸盐利用试验、明胶液化试验、酪氨酸水解、脲酶、糖发酵试验均为阴性。
研究发现该菌对真菌毒素具有抑制作用，特别是对DON毒素具有降解作用。
因此优选地，所述真菌毒素为呕吐毒素（DON）。
优选地，所述应用是将所述嗜根考克氏菌接种于培养基中，于30 ℃培养24h得到培养液，将培养液应用于降解真菌毒素。
优选地，所述培养基为TGY培养基，其培养基的组成为10g 胰蛋白胨，5g 酵母浸粉，1g 葡萄糖，30 g NaCl，1000 mL 蒸馏水，pH为7.0～7.5。
具体地，所述应用是将所述嗜根考克氏菌的培养液添加入饲料中喂养动物，发现动物体内毒素残留明显下降。
优选地，所述培养液的添加浓度为1×109～2.8×109 CFU/g·feed。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明通过从摄取真菌毒素的动物体内成功分离获得耐真菌毒素的微生物，该微生物被鉴定为嗜根考克氏菌CAMT21651（KR-51），于2016年6月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所；保藏编号为：GDMCC No：60048；该菌能够显著降低动物体内真菌毒素的残留量，从而为真菌毒素的生物防治奠定了基础。
附图说明
图1为嗜根考克氏菌CAMT21651（KR-51）的电镜扫描图。
图2为嗜根考克氏菌CAMT21651（KR-51）的的系统发育树。
图3为对虾肌肉中DON毒素的消除率随时间的变化。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作进一步的解释说明，但具体实施例并不对本发明作任何限定。除非特别说明，实施例中所涉及的试剂、方法均为本领域常用的试剂和方法。本发明对化合物的来源不做任何形式的限定。
实施例1 耐DON的微生物的分离
（1）制备DON蓄积的虾仁
随机挑选体质健康、个体大小均一的南美白对虾（5±0.5g），按照每组40尾（设3个平行）随机分配到长方形硬塑养殖箱（容积40×30×12cm3）中，利用充气式养殖系统保持海水溶氧量DO>6mg/L，pH6.5～7.5；水温24～28 ℃；盐度9.18～11.99 %。每天换1/3体积的水，采用自然光照，每日按照南美白对虾体重的5%，每日分为三次，早上9点一次，下午3点一次，晚上9点一次，每日饲料饲喂比为2：3：5。
以四天为一个周期， DON每种真菌毒素按照四天换一种剂量添加到饲料中喂养，真菌毒素的起始添加剂量是6 mg/kg·feed，每天染毒，每个周期真菌毒素的添加剂量递增1.5倍。四天为一个周期解剖一次，在无菌超净台去除虾头、虾尾、虾壳、虾肠、以及提取出肝胰腺等，得到虾肌肉于-20 ℃保存。
（2）染毒虾仁中分离DON的耐受菌
在无菌超净台中用灭菌剪刀将一尾虾虾仁剪细碎，从中取出虾肉25.0 g于灭菌225mL生理盐水，在漩涡混合器中漩涡120 s，制成1：10的样品匀液。用移液枪吸取1：10的样品匀液1mL，沿试管内壁缓慢注入装有9mL的灭菌生理盐水的试管中，摇晃试管或者用移液枪头反复吹打混合均匀，制成1：100的样品匀液。以此类推制备10倍系列稀释样品的匀液，每递增稀释一次，更换一次1mL移液枪头，最后得到10-1～10-3稀释度的样品匀液。在三个稀释度中分别取0.1ml样品稀释液于营养琼脂培养基（NA）上，均匀涂布，置于30 ℃培养48 h后计算菌落总数并选择具有代表性单菌落，用三段划线法划线纯化。从冷冻虾仁中分离到一株耐 DON的微生物KR-51，耐受DON浓度为1 mg/kg。
（3）毒素耐受菌KR-51的生长特性及生理生化鉴定
该菌菌落为亮黄色革兰氏阳性球菌，菌落直径为0.423～1.283 mm，菌落呈圆形凸起，整齐湿润不透明，最适生长培养基为改良TGY培养基（10g 胰蛋白胨，5g 酵母浸粉，1g葡萄糖，30 g NaCl，1000 mL 蒸馏水，pH为7.0～7.5），最适生长温度为 30℃，硝酸盐还原试验阳性，接触酶阳性，而氧化酶、V-P试验、吲哚、柠檬酸盐利用试验、明胶液化、酪氨酸水解、脲酶、糖类发酵试验（葡萄糖、海藻糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、D-木糖）等均呈现阴性，该菌株的电镜扫描图如图1。
（4）耐受菌KR-51分离株的16S rRNA 测 序 及 同 源 性 比 较
将目标菌的菌株划线接种于改良TGY培养基中，于30℃恒温培养箱中培养24h，得到单菌落。
以引物1：5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和引物2：5’-CGGCTACCTTGTTACGAC-3’作为上下游引物。建立30µL的PCR反应体系： 15 µL 2×MightyAmp polymerase Ver.2，12.9µL双蒸水，0.75µL上游引物1，0.75µL下游引物2 和0.6µL DNA聚合酶。最后挑取微量的单菌落作为DNA模板，加入30 µL PCR反应体系中进行扩增。 PCR反应程序第一阶段: 98 ℃预变性2min；第二阶段：98 ℃变性10 s、58 ℃退火15 s、68 ℃延伸90 s，40个循环；第三个阶段10 ℃保存20 min。
PCR扩增结束后，取2µL扩增产物与1µL核酸染料混合，点样于凝胶孔上，进行1.5%琼脂糖电泳（121V，30min），用凝胶成像仪观察扩增产物的电泳结果，16S rRNA的PCR扩增产物由上海生工生物工程计算服务有限公司完成。根据测序结果，将16S rRNA序列登陆数据库EzBioCloud中进行相似性比对搜索，从中获得相似性较高且是有效描述的典型菌株的16S rRNA序列作为参比对象，利用MEGA6.0的Neighbor Joining法建立系统发育树，并进行1000次Bootstraps检验。结果检测发现毒素耐受菌KR-51被鉴定为嗜根考克氏菌（Kocuria rhizophila），该菌株的遗传系统发育树如图2。
该毒素耐受菌KR-51被称为CAMT21651（KR-51），于2016年6月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所；保藏编号为：GDMCC No：60048。
实施例2 KR-51对水产饲料中DON 毒素在对虾体内残留量的消减
选取对虾600 尾，随机分成4个处理组，分别为基础饲料组、基础饲料+ DON组、基础饲料+嗜根考克氏菌制剂组、基础饲料+DON +嗜根考克氏菌制剂组（嗜根考克氏菌制剂的添加量为1000 mL/kg·feed（0.02%质量分数，1×108～3.6×108CFU/g·feed））。
（1）饲料+DON组：制备DON微胶囊毒饲料，DON毒素设 6、9、13.15、20.25和30.375mg/kg·feed剂量组。
（2）基础饲料+嗜根考克氏菌制剂组：挑取实施例1所述嗜根考克氏菌株接种在改良TGY培养基中，32 ℃培养24 h。将培养24h的嗜根考克氏菌发酵液按1：1的比例均匀喷洒到基础饲料中（嗜根考克氏菌在饲料中的含量为1×108～3.6×108CFU/g·feed）。
（3）基础饲料+DON+嗜根考克氏菌制剂组：配制不同剂量的DON饲料组，加入嗜根考克氏菌（嗜根考克氏菌在饲料中的含量为1×108～3.6×108CFU/g·feed）。
试验采用剂量递增法染毒，以饲料中DON含量为6 mg/kg·feed作为起始染毒剂量，每天染毒，4天为一周期，每期递增1.5倍，连续染毒20天，并设置空白对照。
采用LC-MS/MS方法检测对虾肌肉中DON毒素的残留量，结果发现：和基础饲料+DON组相比，基础饲料+DON +嗜根考克氏菌制剂组中消除DON残留率最高为37.01%±0.75，最终消除残留量为8.55±0.93 ng/g（图3）。
实施例3
在8.8mL TGY和8.8mL传统发酵鱼露中分别加入1mL嗜根考克氏菌KR-51发酵液（1×109 CFU/mL）和DON标准工作液（2.5µg/mL）0.20mL，使TGY和传统发酵鱼露培养液中DON的初始浓度均为500.0 ng/mL，30℃振荡培养24h（160r/min）后，用LC-MS/MS方法检测培养液中DON含量。比较嗜根考克氏菌KR-51发酵前后鱼露中毒素残留量变化，结果表明，嗜根考克氏菌KR-51对TGY培养液中DON的降解率为52.24±1.63%，降解量为261.2±17.86 ng。对传统发酵鱼露中DON的降解率为32.02±1.18.%，降解量为160.1±11.24ng。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东海洋大学
<120> 嗜根考克氏菌在降解真菌毒素中的应用
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1132
<212> DNA
<213> 16srDNA序列
<400> 1
gtgcaatgcg cagctaccat gcagtcgacg ctgagcttgg tgcttgcact gggtggatga 60
gtggcgaacg ggtgagtaat acgtgagtaa cctgcccttg actctgggat aagcctggga 120
aactgggtct aatactggat acgacatgtc accgcatggt ggtgtgtgga aagggtttta 180
ctggttttgg atgggctcac ggcctatcag cttgttggtg gggtaatggc tcaccaaggc 240
gacgacgggt agccggcctg agagggtgac cggccacact gggactgaga cacggcccag 300
actcctacgg gaggcagcag tggggaatat tgcacaatgg gcggaagcct gatgcagcga 360
cgccgcgtga gggatgacgg ccttcgggtt gtaaacctct ttcagcacgg aagaagcgaa 420
agtgacggta cgtgcagaag aagcgccggc taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg 480
tagggcgcaa gcgttgtccg gaattattgg gcgtaaagag ctcgtaggcg gtttgtcgcg 540
tctgctgtga aagcccgggg cttaaccccg ggtgtgcagt gggtacgggc agacttgagt 600
gcagtagggg agactggaat tcctggtgta gcggtgaaat gcgcagatat caggaggaac 660
accgatggcg aaggcaggtc tctgggctgt tactgacgct gaggagcgaa agcatgggga 720
gcgaacagga ttagataccc tggtagtcca tgccgtaaac gttgggcact aggtgtgggg 780
aacattccac gttttccgcg ccgtagctaa cgcattaagt gccccgcctg gggagtacgg 840
ccgcaaggct aaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca caagcggcgg agcatgcgga 900
ttaattcgat gcaacgcgaa gaaccttacc aagggcttga catacaccgg accgggccag 960
agatgtcttt ccccttgtgg ggctggtgta caggtggtgc atggttgtcg tcagctcgtg 1020
tcgtgagatg tggttaagtc ccgcacgagc gcaaccctcg ttctatgttg gcagcacgtg 1080
atggtgggga ctcaatagga gaactgcccg gggtcaactt cggaaggaat gt 1132
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 引物1
<400> 2
gagagtttga tcctggctca g 21
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 引物2
<400> 3
cggctacctt gttacgac 18

Claims (5)

1.嗜根考克氏菌（Kocuria rhizophila）在降解真菌毒素中的应用，其特征在于，所述嗜根考克氏菌于2016年6月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：60048；所述真菌毒素为呕吐毒素。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，是将所述嗜根考克氏菌接种于培养基中，于30℃培养24 h得到培养液，将培养液应用于降解真菌毒素。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述培养基的组成为10 g胰蛋白胨，5 g酵母浸粉，1 g葡萄糖，30 g NaCl，1000 mL蒸馏水，pH为7.0～7.5。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，是将所述培养液添加入饲料中喂养动物。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述培养液的添加浓度为1×109～2.8×109CFU/g·feed。
CN201610641825.0A 2016-08-08 2016-08-08 嗜根考克氏菌在降解真菌毒素中的应用 Active CN106190919B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610641825.0A CN106190919B (zh) 2016-08-08 2016-08-08 嗜根考克氏菌在降解真菌毒素中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610641825.0A CN106190919B (zh) 2016-08-08 2016-08-08 嗜根考克氏菌在降解真菌毒素中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106190919A CN106190919A (zh) 2016-12-07
CN106190919B true CN106190919B (zh) 2019-07-09

Family

ID=57513746

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610641825.0A Active CN106190919B (zh) 2016-08-08 2016-08-08 嗜根考克氏菌在降解真菌毒素中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106190919B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113373080B (zh) * 2021-04-08 2023-04-07 云南省农业科学院农产品加工研究所 一株嗜根考克氏菌及其应用
CN117247868B (zh) * 2023-09-25 2024-03-15 中国海洋大学 一种嗜根考克氏菌及其应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
一株耐辐射考克氏菌的分离与鉴定;唐然 等;《核农学报》;20101231;第24卷(第2期);276-280 *
一株降解呕吐毒素的青霉菌的分离与鉴定;李亚菲 等;《饲料工业》;20151231;第36卷(第15期);42-45 *
呕吐毒素(DON)生物合成和降解研究进展;曹慧英 等;《中国粮油学报》;20130531;第28卷(第5期);116-123 *
饲料呕吐毒素脱毒方法研究进展;万晶 等;《浙江农业科学》;20141231(第9期);1450-1454 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN106190919A (zh) 2016-12-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Kim et al. Isolation and characterization of Leptolyngbya sp. KIOST‐1, a basophilic and euryhaline filamentous cyanobacterium from an open paddle‐wheel raceway Arthrospira culture pond in Korea
CN105176874B (zh) 凝结芽孢杆菌fm603及其应用
CN105175518B (zh) 凝结芽孢杆菌fm603产生的细菌素及其制备方法
CN104774781B (zh) 一株枯草芽孢杆菌dcu及其用途
CN111733117B (zh) 一株产抗菌肽的海洋芽孢杆菌及其发酵方法和应用
CN112940982A (zh) 一株鳢源贝莱斯芽孢杆菌及其应用
CN113040390B (zh) 一株益生、耐盐约氏乳杆菌及其在畜禽水产养殖中防治病原菌的应用
CN103602608A (zh) 短小芽孢杆菌在对虾养殖中的应用
CN110004096A (zh) 一株植物乳杆菌及其应用
CN103525719B (zh) 一种分离自肠道内的益生菌及其应用
CN106190919B (zh) 嗜根考克氏菌在降解真菌毒素中的应用
CN113502243B (zh) 一株高产乳酸的植物乳杆菌gbw-lp001及其替抗菌剂和应用
CN110331103A (zh) 一株溶藻链霉菌n1-32、其微生态制剂及其制备方法
CN107937301B (zh) 一种解淀粉芽孢杆菌及其在水产养殖中的应用
CN103525721B (zh) 具有抑菌能力的益生菌及其应用
CN106148236B (zh) 一种嗜根考克氏菌
CN113151035A (zh) 一种解淀粉芽孢杆菌、筛选方法、鉴定方法及应用
CN105104712B (zh) 一种微生物饲料添加剂及其制备方法
CN116240123B (zh) 一株多粘类芽孢杆菌、其微生态制剂及其制备方法
CN110452849A (zh) 一种益生植物乳杆菌
CN113604387B (zh) 一株耐盐、耐高温罗伊氏乳杆菌及其在畜禽水产养殖中防治病原菌的应用
CN114717140A (zh) 一种地衣芽孢杆菌及其应用
Ebnetorab et al. Isolation, biochemical and molecular detection of Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis from the digestive system of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) and its inhibitory effect on Aeromonas hydrophila
CN107988135B (zh) 镁离子在促进海洋蛭弧菌蛭质体形成中的应用
CN102550812A (zh) 有益微生物饲料添加剂及其制作方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant