CN114717140A - 一种地衣芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种地衣芽孢杆菌AQ19‑11，其对于水体无毒性，且能够水解水体中的淀粉，降低水体中的氨氮含量；本发明的地衣芽孢杆菌AQ19‑11能够作为益生菌应用于改善水质，例如用于水环境治理，改善自然水体的水质，或者用于水产养殖，改善水产养殖水体的水质。

Description

一种地衣芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及一种地衣芽孢杆菌，以及其作为益生菌在改善水质方面的应用，特别是在改善水产养殖水体方面的应用。
背景技术
随着环境保护和农林牧渔业的生态发展，人们尝试开发无污染、无公害的微生物产品，以满足保持生态平衡、合理改造自然的要求。
尽管微生物的作用机理多样，但基于目前已揭示并达成的基本共识是：微生物的功能不是单一的，往往同时兼具多重功效，例如改善动/植物营养、刺激生长、抑制病菌、防治病虫害、改善水质等等。
具体到水产养殖领域，集约化高密度养殖是我国当前主要的水产养殖模式，但该模式往往因为饲料过量投喂引起残饵不断积累，进而导致水质恶化。其中，残饵中残留的淀粉是主要的水体污染物。因此，及时水解残饵(尤其是淀粉类有机污染物)是改善水产养殖水体的水质的重要途径。
因此，本领域希望能够筛选改善水质，尤其是改善水产养殖环境的水质的微生物。
发明内容
鉴于相关技术的上述问题和/或其他问题，本发明第一方面提供了一种地衣芽孢杆菌AQ19-11，该地衣芽孢杆菌AQ19-11保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNo：M 2022012。
本发明第二方面提供了一种微生物菌剂，其中，所述微生物菌剂为上述的地衣芽孢杆菌AQ19-11的发酵菌液或所述发酵菌液制得的菌液制剂或所述发酵菌液经干燥制得的菌粉制剂。
本发明第三方面提供了上述的地衣芽孢杆菌AQ19-11，其作为益生菌在改善水质方面的应用。
优选的，所述应用为改善水产养殖水体方面的应用。
本发明第四方面提供了上述的微生物菌剂，其作为益生菌在改善水质方面的应用。
优选的，所述应用为改善水产养殖水体方面的应用。
本发明第五方面提供了一种改善水质的产品，其中，所述改善水质的产品包含上述的地衣芽孢杆菌AQ19-11或者包含上述的微生物菌剂。
本发明提供了一种地衣芽孢杆菌AQ19-11，其对于水体无毒性，且能够水解水体中的淀粉，降低水体中的氨氮含量；本发明的地衣芽孢杆菌AQ19-11 能够作为益生菌应用于改善水质，例如用于水环境治理，改善自然水体的水质，或者用于水产养殖，改善水产养殖水体的水质。
附图说明
图1为本发明的地衣芽孢杆菌AQ19-11经染色后在100倍光学显微镜(油镜)下的菌体形态图；
图2为本发明的地衣芽孢杆菌AQ19-11在营养琼脂平板上形成的菌落形态图；
图3为本发明的地衣芽孢杆菌AQ19-11和各对照菌的淀粉酶水解试验结果图；
图4为本发明的地衣芽孢杆菌AQ19-11对水产养殖水体中氨氮含量影响的结果图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式对本发明作进一步的说明，但本发明并不限于这些具体实施方式。
下面具体实施方式中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。其中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》第三版，科学出版社)或按照产品说明书进行。
一、下面介绍本申请发明人从自然环境中分离筛选获得的本发明的地衣芽孢杆菌AQ19-11(Bacillus licheniformis AQ19-11)CCTCC No：M 2022012 的操作过程。
1)初筛；称取养殖淤泥1.0g(取自山东省昌邑市海丰水产养殖有限公司)，混悬于9mL无菌水中，振荡混匀后于80℃水浴静置10min，然后采用稀释涂布平板法和划线平板法在营养琼脂培养基上进行菌株的分离与纯化。无菌操作挑取生长情况良好的单菌落，作为候选菌株，分别接种至无菌营养肉汤后，在30℃、200r/min条件下摇床振荡培养18～24h后制成终浓度为1.0×106 CFU/mL的菌悬液；
2)以淀粉酶产生能力作为筛选评价指标进行进一步筛选；无菌操作将上述候选菌株的菌悬液，分别用移液器吸取5μL置于无菌圆形滤纸片上，然后粘贴在淀粉酶水解培养基平板上，于30℃恒温培养24h后在其表面覆盖一层碘液，观察并测定各个候选菌株产生的淀粉酶水解圈直径。
以发明人实验室中已有的淀粉酶产生菌株(以枯草芽孢杆菌 BYK201031)作为对照菌株，将候选菌株中淀粉酶水解圈直径最大的菌株，作为本发明筛选获得的具有淀粉酶产生能力的优良菌株，命名为AQ19-11。
二、关于本发明的地衣芽孢杆菌AQ19-11的鉴定过程如下：
(1)分子生物学鉴定
根据细菌16S rRNA序列，采用系统发育分析对筛选获得的菌株AQ19-11 进行分子生物学的鉴定。
具体的，将筛选获得的菌株AQ19-11接种到100mL无菌营养肉汤中，在30℃、200r/min条件下摇床振荡培养24h后，于4℃、12000r/min离心1 min，弃上清，然后采用Ezup柱式基因组DNA抽提试剂盒提取菌株的基因组DNA；然后以基因组DNA为模板，对其16S rRNA对应的DNA进行PCR 扩增。其中，正向引物为27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物为1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′；PCR反应体系50.0μL： 10×Easy taq Buffer(Mg2+)5.0μL，High Pured NTP 4.0μL，正向反向引物各 0.5μL，Easy Taq酶1.0μL，双蒸水补足至50.0μL；PCR的扩增条件为:95℃预变性3min；95℃1min，60℃1min，72℃1min，共35个循环。经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段，并采用上海天根生化科技有限公司的DNA纯化回收试剂盒进行切胶回收；回收样品送至上海迈普生物科技有限公司进行测序。
测定的AQ19-11的16S rRNA对应的基因序列(如SEQ ID NO.1所示)。
利用GenBank数据库中的NCBI BLAST，将菌株AQ19-11的16S rRNA 序列进行同源性比对，并利用Mega 5.0软件采用邻接法构建系统发育树 (Replications＝1000，bootstrap值取百分比)。从比对结果看，菌株AQ19-11 与数据库中的地衣芽孢杆菌菌株自然聚类(97％～99％的序列同源性)，其中与GenBank登录号为MZ959528的地衣芽孢杆菌菌株亲缘关系最近。
(2)形态学鉴定
菌株AQ19-11为革兰氏染色阳性菌，其经染色后在100倍光学显微镜(油镜)下的菌体形态参见图1；其在营养琼脂平板上形成的菌落形态，参见图2，菌落形态特征：白色、圆形、边缘不规则；菌株AQ19-11在形态上与常见的呈杆形的地衣芽孢杆菌类似。
(3)生理生化鉴定
参照东秀珠等编订的《常见细菌系统鉴定手册》(第一版)中相应属、种鉴定的有关内容选择生理生化试验性状，采用细菌微量生化鉴定管，对菌株 AQ19-11进行生理生化鉴定。
从生理生化结果来看，菌株AQ19-11能够水解淀粉和明胶，能够还原硝酸盐，呈接触酶反应、V-P、硝酸盐还原反应阳性，可发酵葡萄糖、鼠李糖、山梨醇、D-水杨苷和阿拉伯糖，可水解明胶、淀粉，不能发酵甘露醇、木糖和D-棉子糖，不能利用丙二酸，不产尿素酶和硫化氢，在20～100g/LNaCl 环境中能够存活；与《常见细菌系统鉴定手册》中地衣芽孢杆菌的生理生化特征基本一致。
综合第(1)～(3)部分的鉴定结果，最终认定本发明筛选获得的菌株 AQ19-11为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。
三、关于菌株的保藏
本发明的菌株AQ19-11，属于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2022年1月05日，其保藏编号为CCTCC No：M2022012，保藏单位地址为中国武汉武汉大学。
四、本发明的地衣芽孢杆菌AQ19-11的发酵培养方法
无菌操作刮取本发明的斜面保藏的地衣芽孢杆菌AQ19-11的菌苔接种至 20mL发酵培养基(可以采用市售的常规的营养肉汤培养基，例如购自国药集团(上海)化学试剂有限公司的沃凯牌营养肉汤；也可以采用专利号为ZL 201110346583.X的发酵培养基)，于30℃、200r/min恒温摇床振荡培养48 小时至培养基出现混浊；然后将其转接至100mL发酵培养基，于30℃、200 r/min恒温摇床振荡培养48小时出现混浊，再将其转接至400mL发酵培养基，于30℃、200r/min恒温摇床振荡培养72小时获得的发酵液为本发明的地衣芽孢杆菌AQ19-11。经检测，该发酵液的菌浓度大约为108～109CFU/ml。
关于本发明的地衣芽孢杆菌AQ19-11的菌剂，可以将发酵生产获得的发酵液直接应用或将发酵液处理制成菌液制剂来应用，也可以将获得的发酵液进行干燥处理，例如微囊包埋处理或冷冻干燥处理，制成菌粉制剂来应用。
五、本发明的地衣芽孢杆菌AQ19-11的安全性
以水生模式动物斑马鱼作为受试对象评价本发明的地衣芽孢杆菌 AQ19-11的安全性。
试验设1个对照组和4个实验组，每组3个平行，分别在盛有0.1m3标准稀释水的玻璃水族缸(22cm×18cm×25cm)中放入健康斑马鱼10尾。4个实验组中分别加入本发明的地衣芽孢杆菌AQ19-11至终浓度为5.0×106、 5.0×107、5.0×108、5.0×109CFU/mL，对照组不加任何物质。试验期间水温控制在23℃、DO＞5mg/L、pH为7.2；连续浸泡斑马鱼7d，记录各组斑马鱼的死亡数目。采用Bliss法计算对斑马鱼的半数致死浓度(LC50)。结果如下表1。
表1
Figure BDA0003527706140000051
Figure BDA0003527706140000061
四个实验组结果表明，在菌株AQ19-11的终浓度为5.0×106～5.0×109 CFU/mL的水产养殖环境中连续浸泡7d，斑马鱼均生长良好，游动和呼吸能力正常，未出现鱼体侧翻、反应迟缓等不正常现象与死亡。对照组中的斑马鱼也生长良好，未存在死亡现象。
这说明，本发明的地衣芽孢杆菌AQ19-11对斑马鱼的LC50>5.0×109 CFU/mL。根据Cutting(2010)对菌株安全性的评价标准：LC50>4.7×108CFU/g 为无毒菌株，可以得出本发明的地衣芽孢杆菌AQ19-11为无毒菌株，对于水产养殖环境无毒性的结论。
六、本发明的地衣芽孢杆菌AQ19-11的淀粉酶水解试验
将已知的淀粉酶产生菌：枯草芽孢杆菌BYK201031、解淀粉芽孢杆菌 AQ19-3、短小芽孢杆菌AQ-8、蜡状芽孢杆菌AQ19-15(国家水生动物病原库提供)作为对照菌。
分别将5μL终浓度为1.0×106CFU/mL的地衣芽孢杆菌AQ19-11以及各对照菌株置于无菌圆形滤纸片上，然后粘贴在淀粉酶水解培养基平板上，于30℃恒温培养24h后在其表面覆盖一层碘液，观察并测定各个菌株产生的淀粉酶水解圈直径(mm)。
结果参见图3，可以看出，地衣芽孢杆菌AQ19-11产生的淀粉酶水解圈直径分别较已知的淀粉酶产生菌：枯草芽孢杆菌BYK201031、解淀粉芽孢杆菌AQ19-3、短小芽孢杆菌AQ-8、蜡状芽孢杆菌AQ19-15增加了28.93％ (P<0.05)、35.65％(P<0.05)、22.83％(P<0.05)、51.46％(P<0.05)，表明本发明的地衣芽孢杆菌AQ19-11具有良好的生产淀粉酶和水解淀粉的能力。
七、本发明的地衣芽孢杆菌AQ19-11对水产养殖水体中的氨氮的影响
试验前，将本发明的地衣芽孢杆菌AQ19-11接种至发酵培养基中，32℃发酵培养48h，制成菌浓度约为5.0×108CFU/mL的液体菌剂。
试验设1个对照组和1个试验组，每组包括2个南美白对虾的养殖池(8 亩/池，水深1.5m)，每个养殖池中南美白对虾苗种投放密度为5万尾/亩。
试验组采用上述的地衣芽孢杆菌AQ19-11的液体菌剂，对照组采用EM 菌剂(购自无锡泓宝微生物科技公司的泓宝EM液)；试验组和对照组均按 1.0g/m3的剂量全池均匀泼洒，每10天使用1次，试验周期为120天，试验期间各组正常投喂南美白对虾饲料，3次/天，养殖期间不换水，每天灵活调整增氧时间以确保溶氧＞5mg/L即可(各组增氧时间保持一致)，每10d采取水样(在同一时间点，对每个养殖池的3个不同区域进行采样)，采用杭州陆恒生物科技有限公司生产的氨氮检测试剂盒测定水样中的氨氮含量(mg/L)，并计算每个时间点对照组和试验组的养殖池中的平均氨氮含量值，结果参见图4。
从图4的结果可以看出，整个试验期间，采用本发明的地衣芽孢杆菌 AQ19-11能更好地控制养殖水体中的氨氮含量，显著优于对照组EM菌剂；养殖试验120天结束时，全池泼洒菌株AQ19-11的试验池的氨氮含量较对照组EM菌剂降低了42.11％。
此外，基于地衣芽孢杆菌本身的特性，上述第二部分第(3)小节的生理生化鉴定结果，本领域技术人员在获知了上述第五部分(证明本发明的地衣芽孢杆菌AQ19-11对于水产养殖水体安全无毒性)、上述第二部分、第六部分(证明菌株AQ19-11水解淀粉的能力)，以及上述第七部分(证明菌株AQ19-11降低水产养殖水体中氨氮含量的能力)的结果，可以想到将本发明的地衣芽孢杆菌AQ19-11应用于改善水质，例如用于水环境治理，改善自然水体的水质，或者用于水产养殖，改善水产养殖水体的水质。
应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施方式中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。
Figure IDA0003527706250000011
Figure IDA0003527706250000021
Figure IDA0003527706250000031

Claims (7)

1.一种地衣芽孢杆菌AQ19-11，该地衣芽孢杆菌AQ19-11保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M 2022012。
2.一种微生物菌剂，其特征在于：所述微生物菌剂为权利要求1所述的地衣芽孢杆菌AQ19-11的发酵菌液或所述发酵菌液制得的菌液制剂或所述发酵菌液经干燥制得的菌粉制剂。
3.如权利要求1所述的地衣芽孢杆菌AQ19-11，其作为益生菌在改善水质方面的应用。
4.如权利要求3所述应用，其特征在于：所述应用为改善水产养殖水体方面的应用。
5.如权利要求2所述的微生物菌剂，其作为益生菌在改善水质方面的应用。
6.如权利要求5所述应用，其特征在于：所述应用为改善水产养殖水体方面的应用。
7.一种改善水质的产品，其特征在于：所述改善水质的产品包含如权利要求1所述的地衣芽孢杆菌AQ19-11或者包含如权利要求2所述的微生物菌剂。
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