CN115895935B - 一种枯草芽孢杆菌及其在青苔防治方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种枯草芽孢杆菌A4，具体涉及一种筛选出来的具有溶藻活性的枯草芽孢杆菌；本发明的枯草芽孢杆菌A4对于水绵的生长具有良好的、广谱的抑制作用，可以应用于抑制水绵生长和青苔防治，特别是应用于水产养殖水体环境中的青苔防治。

Description

一种枯草芽孢杆菌及其在青苔防治方面的应用

技术领域

本发明涉及一种枯草芽孢杆菌，具体涉及一种筛选出来的具有溶藻活性的枯草芽孢杆菌，及其在抑制水绵生长和青苔防治方面的应用，特别是用于水产养殖水体环境中的青苔防治。

背景技术

青苔，又名青泥苔，是部分丝状绿藻的俗称，其主要组成是水绵(Spirogyra)。

水绵(Spirogyra)为不分枝的丝状绿藻，在相对清洁的富营养化水体中非常普遍，在水中呈片或团状，摸起来手感黏滑，其主要通过接合生殖的方式产生大量的休眠孢子来繁殖和传播后代。水绵初生时，常附着于水底淤泥表层，随着藻体的长大和浮力的增加，就会大量漂浮于水面，形成碧绿色至黄褐色的絮状藻丝团。水绵对于温度的适应能力很强，从冬季的冰下水体到夏天的高温水体，只要有足够的光照，就可以进行光合作用产生大量氧气泡并快速生长。

在大自然环境中，少量的转板藻(Mougeotia)、双星藻(Zygnema)和丝藻(Ulothrix)等丝状绿藻常与水绵纠缠寄生在一起生活，形成俗称的青苔。

青苔，经常在养殖水体(包括养殖池和养殖水田)中大量生长繁殖，占领水体。例如，在虾蟹的养殖水体中繁殖会严重影响到虾蟹的养殖产量和养成规格；具体来说，当青苔形成的藻丝团大量漂浮于水面时，容易裹缠虾蟹导致其死亡，并且占用水体空间、阻隔水中光照、消耗大量营养盐类，使水质清瘦，且释放有毒有害物质，使水体产生霉味和臭味，造成水体严重污染，抑制养殖虾蟹生长的同时也抑制其他饵料生物的繁殖生长；因此青苔是导致养殖水域环境恶化的重要因素。

目前，国内外主要是采用散播黏土、膜过滤等物理方法或利用金属、光敏剂、除草剂和其他化学品等化学方法处理青苔，但其成本较高，且易出现效果不佳、产生二次污染等问题。

此外，基于溶藻细菌的生物控藻技术，也是目前国内外的研究热点，具体来说，采用天然水体中大量存在的溶藻细菌，通过直接或间接的方式作用于藻细胞，影响藻细胞的结构和生理功能，例如促进或者抑制相关基因或蛋白的表达，进而抑制藻类生长甚至杀死藻类；目前，溶藻细菌在控制铜绿微囊藻方面的报道比较多，但利用溶藻细菌控制青苔/水绵的研究较少。

因此，本领域希望筛选对于水藻、青苔/水绵生长具有抑制作用或致死作用的溶藻细菌，开发有效的杀藻剂、杀青苔剂，应用于青苔防治以及改善养殖水体的环境。

发明内容

鉴于相关技术的上述问题和/或其他问题，本发明第一方面提供了一种枯草芽孢杆菌A4，该枯草芽孢杆菌A4保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M20221167。

本发明第二方面提供了一种微生物菌剂，其中，所述微生物菌剂包含如上述的枯草芽孢杆菌A4的发酵菌液或所述发酵菌液制得的菌液制剂或所述发酵菌液经干燥制得的菌粉制剂。

本发明第三方面提供了一种杀藻剂，其中，所述杀藻剂包含如上述枯草芽孢杆菌A4或上述的微生物菌剂。

本发明第四方面提供了上述的枯草芽孢杆菌A4、上述的微生物菌剂或上述的杀藻剂在抑制水体藻类生长方面的应用。

优选的，所述应用为抑制水绵生长方面的应用。更优选的，所述应用为青苔防治方面的应用。

更优选的，所述青苔防治为水产养殖水体环境中的青苔防治，例如虾蟹等其他水产动物养殖水体环境的青苔防治。

本发明第五方面提供了一种用于青苔防治的生物制剂，其中，所述生物制剂包含上述的枯草芽孢杆菌A4或上述的微生物菌剂。

本发明提供了一种枯草芽孢杆菌A4，具体涉及一种筛选出来的具有溶藻活性的枯草芽孢杆菌；本发明的枯草芽孢杆菌A4对于水绵的生长具有良好的、广谱的抑制作用，可以应用于抑制水绵生长和青苔防治，特别是应用于水产养殖水体环境中的青苔防治。

附图说明

图1为分离筛选出10株对纤细水绵FACHB-354具有明显抑制作用的菌株(分别命名为A1-A10)的平均溶藻率结果；

图2为本发明枯草芽孢杆菌A4在营养琼脂平板上形成的菌落形态图；

图3为本发明枯草芽孢杆菌A4经革兰氏染色后，在100倍光学显微镜下的照片；

图4为本发明的枯草芽孢杆菌A4的菌液、上清液(无菌细胞滤液)和菌细胞(纯菌细胞悬浮液)的溶藻率检测结果；

图5为本发明的枯草芽孢杆菌A4在不同浓度下的溶藻率检测结果；

图6为本发明的枯草芽孢杆菌A4对于不同水绵藻株的溶藻率检测结果；

图7为本发明的枯草芽孢杆菌A4在不同温度下对水绵的溶藻率检测结果；

图8为本发明的枯草芽孢杆菌A4在不同光照条件下对水绵的溶藻率检测结果。

具体实施方式

以下通过具体实施方式对本发明作进一步的说明，但本发明并不限于这些具体实施方式。

下面具体实施方式中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。其中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或按照产品说明书进行。

一、下面介绍本申请发明人从自然环境中分离筛选获得本发明的溶藻细菌——枯草芽孢杆菌A4(Bacillus subtilis A4)CCTCC No：M 20221167的操作过程。

1)初筛

取10g养殖池塘淤泥(取自山东威海市荣成市某养殖池塘)于90mL无菌生理盐水中，震荡混匀后于水浴锅中80℃水浴10min，在营养琼脂板(营养琼脂购自国药集团化学试剂有限公司)上采用平板划线法和稀释涂布法进行菌株的分离和纯化。

将纯化后的单菌落分别接至无菌营养肉汤(购自国药集团化学试剂有限公司)，在30℃、200r/min条件下摇床振荡培养24h后；将其转接至营养肉汤培养基培养基，在30℃、200r/min条件下摇床振荡培养48h后各自制成终浓度为3×10¹⁰CFU/mL的菌液，保存备用。

2)以抑制水绵活性为指标进一步筛选溶藻细菌

以纤细水绵FACHB-354(购自中国科学院淡水藻种库)作为筛选指示水绵；实验组中，将上述分离纯化获得的各菌株的菌浓度稀释至3×10⁸CFU/mL，然后马上取各菌株的菌液2ml加入18mL纤细水绵FACHB-354的藻液中(经检测，其初始叶绿素a的浓度为0.74mg/L)；空白对照组中加入等量的无菌营养肉汤；每组做3个平行。

培养条件为温度25℃、光照2000lx、光暗周期比14h:10h，每天摇动3次，6d后根据《HJ 897-2017水质叶绿素a的测定分光光度法》测定各实验组和空白对照组中的叶绿素a的含量，并参照文献(Lyu，2018)计算各组的平均溶藻率。

经过上述实验和数据统计，共分离筛选出10株对纤细水绵FACHB-354具有明显抑制作用的菌株(分别命名为A1-A10)，它们的平均溶藻率分别为26.12％、9.78％、7.08％、65.57％、35.06％、33.10％、47.09％、48.69％、30.40％和54.80％(具体参见图1)。

3)可以看出，菌株A4对于纤细水绵FACHB-354具有最佳的抑制(溶藻)效果。

二、关于筛选获得的溶藻菌株A4的鉴定过程如下：

(1)分子生物学鉴定

根据细菌16S rRNA序列，采用系统发育分析对筛选获得的溶藻菌株A4进行分子生物学的鉴定。

具体的，将筛选获得的溶藻菌株A4，接种到20mL无菌营养肉汤中，在30℃、200r/min条件下培养24h后，采用天根细菌基因组提取试剂盒提取溶藻芽孢杆菌优良菌株的基因组DNA，以基因组DNA为模板，对其16S rRNA进行PCR扩增；16S PCR正向引物为27F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，反向引物为1492R:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，扩增体系(20μL)为Premix Taq 10μL、上下游引物各1μL、模板1μL、ddH₂O 7μL，PCR的扩增条件为94℃3min，94℃30s，55℃30s，72℃1min 40s，72℃10min，共35个循环。由上海迈浦生物科技有限公司对溶藻菌株A4的16S rRNA基因测序。

测定的溶藻菌株A4的16S rRNA序列如下：

TGGCACTACGGCGTGCTATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAACTCAAAGGGATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACATCCTAGAGATTAGGACGTCCCCTTTCGGGGGCAGAGTGAACAGGTGGTTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGGAGGATGTTGGGTTAGGTCCCGCCAACGAGCGCTACCCTTGATCTTTAGTTGCAGCCATTCAGTGGGCACTTCTAAGGTGACTGCCGGTGGACAAACCGGAAGAAGGTGGGATGGACGTC(SEQ ID NO.1)。

利用NCBI的BLAST对溶藻菌株A4的16S rRNA基因序列进行同源性比较，从比对结果看，溶藻菌株A4的16S rRNA基因序列与GenBank数据库中枯草芽孢杆菌的16S rRNA序列自然聚类，同源性达97％以上。

再利用MEGA 5.0软件采用邻接法(Neighbor-joining，重复度F1000)构建系统发育树，进一步证明溶藻菌株A4与枯草芽孢杆菌BSY28(GenBank登录号：OK287097)和枯草芽孢杆菌TP5(GenBank登录号：OL818270)的亲缘关系最近。

经鉴定，本发明筛选获得的溶藻菌株A4为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

(2)形态学鉴定

溶藻菌株A4为革兰氏染色阳性菌，在营养琼脂平板上24h形成的菌落特征为：微黄色，边缘不整齐，表面粗糙且略有突起(参见图2)。在形态上与常见的枯草芽孢杆菌类似。

溶藻菌株A4经革兰氏染色后，在100倍光学显微镜下的照片参见图3。

(3)生理生化鉴定

参照东秀珠等编订的《常见细菌系统鉴定手册》(第一版)中相应属、种鉴定的有关内容选择生理生化试验性状，采用细菌微量生化鉴定管，对溶藻菌株A4进行生理生化鉴定。

鉴定结果参见下表1：

从上表1可以看出，溶藻菌株A4与地衣芽孢杆菌参考菌株的生理生化特性完全一致。

综上，结合16S rRNA分子鉴定、形态学观察和生理生化鉴定的结果，可以判定本发明筛选获得的溶藻菌株A4为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

三、关于菌株的保藏

本发明的溶藻菌株A4，属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2022年07月25日，其保藏编号为CCTCC No：M 20221167。

四、本发明的溶藻菌株A4的发酵培养方法

将本发明的溶藻菌株A4的单菌落接种至20mL营养肉汤或其他芽孢杆菌发酵培养基，于30℃恒温摇床振荡培养24小时，使其菌液浓度大于10⁷CFU/mL；再将其以10％接种量转接至200mL营养肉汤或其他芽孢杆菌发酵培养基，于30℃恒温摇床振荡培养24小时，获得的发酵液为本发明的溶藻菌株A4的发酵液。经检测，该发酵液的菌浓度大约为10⁹-10¹⁰CFU/ml。

本发明的溶藻菌株A4的生长速度快，并且发酵培养的操作条件较为简单，在好氧、无菌发酵培养基环境下进行快速高密度发酵，节省能源，减少杂菌污染，获得的发酵产品质量可控。综上，本发明的溶藻菌株A4是一种可以适用于产业化的发酵生产的优良菌株。

五、本发明的溶藻菌株A4的溶藻方式的研究分析

参照Xue et al.(2021)对发明的溶藻菌株A4的作用方式进行分析。

具体的，将上述第四部分发酵培养获得的本发明的溶藻菌株A4的菌液(浓度3×10⁸CFU/mL)，在4℃、6000rmin^-1离心15min。将获得的上清液通过0.22μm醋酸纤维素膜过滤，得到无菌细胞滤液。离心获得的菌体用无菌蒸馏水冲洗两次以获得纯菌细胞悬浮液。

分别将2mL的原菌液、无菌细胞滤液和纯菌细胞悬浮液分别接种于18mL纤细水绵FACHB-354藻液中(经检测，其初始叶绿素a浓度为0.82mg/L)共培养，空白对照组中加入等量的无菌营养肉汤；每组做3个平行。培养条件为温度25℃、光照2000lx、光暗周期比14h:10h，每天摇动3次，6d后根据《HJ 897-2017水质叶绿素a的测定分光光度法》测定FACHB-354中叶绿素a的含量，并参照文献(Lyu，2018)计算平均溶藻率。

统计结果参见图4。从图4中可以看出，本发明的溶藻菌株A4的菌液、上清液(无菌细胞滤液)和菌细胞(纯菌细胞悬浮液)对纤细水绵FACHB-354均具有杀藻活性，溶藻率分别为63.18％、56.73％和6.68％。可以推定，本发明的溶藻菌株A4对水绵的溶藻方式主要以间接溶藻为主，换句话来说，溶藻菌株A4主要通过其发酵产物(代谢产物)实现其溶藻作用。

鉴于大自然环境中的青苔主要由水绵组成，由此可以推定，本发明的溶藻菌株A4具有抑制水绵/青苔的生长，甚至杀死水绵/青苔的作用。

六、本发明的溶藻菌株A4在不同浓度下的水绵抑制效果。

参照Kim等(2009)采用人工模拟池塘环境对不同浓度的溶藻菌株A4进行水绵控制效果分析。

具体的，将上述第四部分获得的溶藻菌株A4发酵菌液连续10倍梯度稀释(菌浓度依次为3.0×10⁵、3.0×10⁶、3.0×10⁷...3.0×10¹⁰CFU/mL)，分别取不同浓度的菌液2mL接种于18mL纤细水绵FACHB-354藻液中(经测定，其初始叶绿素a浓度为0.82mg/L)，使菌液终浓度的对数值依次4.48、5.48、6.48、7.48、8.48和9.48(对应的菌液浓度依次为3.0×10⁴、3.0×10⁵、3.0×10⁶、3.0×10⁷、3.0×10⁸和3.0×10⁹CFU/mL)，以加入等量的无菌营养肉汤的纤细水绵藻液为空白对照，每个处理3个平行；然后于温度25℃、光照2000lx、光暗周期比14h:10h、每天摇动3次等条件下作用6d，然后测定纤细水绵FACHB-354中叶绿素a的含量，参照文献(Lyu，2018)计算各组的平均溶藻率。

结果参见图5，可以看出，当溶藻菌株A4的菌液浓度为3.0×10⁴和3.0×10⁵CFU/mL时，处理6d后溶藻率分别为8.43％和29.93％；而当菌液浓度为3.0×10⁶、3.0×10⁷、3.0×10⁸和3.0×10⁹CFU/mL时，溶藻菌株A4对纤细水绵FACHB-354的溶藻率分别达到了52.55％、63.18％、74.22％、85.61％；即溶藻菌株A4的菌液浓度≥3.0×10⁶CFU/mL时对水绵的溶藻率能达到50％以上，对水绵具有良好的抑制/溶藻效果。

七、本发明的溶藻菌株A4的溶藻广谱性研究

取自然界的青苔中常见的几种水绵藻株作为实验对象，具体的，纤细水绵(Spirogyra gracilis)FACHB-354，以及水绵(Spirogyra sp.)FACHB-737、FACHB-1484、FACHB-1990、FACHB-2906，购自中国科学院淡水藻种库。

无菌操作取上述第四部分获得的溶藻菌株A4发酵菌液(浓度为3×10⁸CFU/mL)2mL分别加入18mL水绵FACHB-737、FACHB-1484、FACHB-1990、FACHB-2906的藻液中(初始叶绿素a浓度均为0.82mg/L)，同时以加入等量的无菌营养肉汤的各藻株藻液为对照，然后于培养条件为温度25℃、光照2000lx、光暗周期比14h:10h，每天摇动3次，6d后根据《HJ 897-2017水质叶绿素a的测定分光光度法》测定各组的叶绿素a的含量，并参照文献(Lyu，2018)计算各组的平均溶藻率。每个处理3个平行。

结果参见图6，可以看出，溶藻菌株A4的发酵菌液除对纤细水绵FACHB354具有溶藻活性外，对其他常见的水绵藻株均具有溶藻活性：对水绵FACHB737的溶藻率为62.22％，对水绵FACHB1484的溶藻率为59.70％，对水绵FACHB1990的溶藻率为54.70％，对水绵FACHB2906的溶藻率为64.97％，表现出良好的广谱溶藻活性。

八、本发明的溶藻菌株A4在不同温度下对水绵的溶藻效果分析

参照孙军德等(2009)方法研究温度对溶藻活性的影响。无菌操作取上述第四部分获得的溶藻菌株A4发酵菌液(浓度为3×10⁸CFU/mL)2mL分别加入18mL纤细水绵FACHB-354藻液中(初始叶绿素a浓度均为0.82mg/L)，同时以加入等量的无菌营养肉汤的各藻株藻液为对照，温度分别设置为15℃、25℃和35℃。然后于培养条件为光照2000lx、光暗周期比14h:10h，每天摇动3次，6d后根据《HJ 897-2017水质叶绿素a的测定分光光度法》测定各组的叶绿素a的含量，并参照文献(Lyu，2018)计算各组的平均溶藻率。每个处理3个平行。结果参见图7，本发明的溶藻菌株A4在35℃时的溶藻率(70.44％)优于15℃时的溶藻率(52.95％)。

九、本发明的溶藻菌株A4在不同光照条件下对水绵的溶藻效果分析

参照Liu等(2019)方法研究温度对溶藻活性的影响。无菌操作取上述第四部分获得的溶藻菌株A4发酵菌液(浓度为3×10⁸CFU/mL)2mL分别加入18mL纤细水绵FACHB-354藻液中(初始叶绿素a浓度均为0.82mg/L)，同时以加入等量的无菌营养肉汤的各藻株藻液为对照，光照2000lx、光暗周期比分别设置为24h:0h、14h:10h和0h:24h，然后于培养温度为25℃，每天摇动3次，6d后根据《HJ 897-2017水质叶绿素a的测定分光光度法》测定各组的叶绿素a的含量，并参照文献(Lyu，2018)计算各组的平均溶藻率。每个处理3个平行。

结果参见图8，本发明的溶藻菌株A4在完全光照条件、完全黑暗条件、光-暗(14h:10h)循环条件下对水绵的抑制作用大致接近(没有明显差异)；在完全光照条件下，抑制作用稍强；在光-暗循环中，抑制作用稍弱。

基于上述的本发明枯草芽孢杆菌A4的生理生化鉴定结果以及第五-九部分的溶藻/抑制水绵生长的实验研究结果，本领域技术人员可以将本发明的枯草芽孢杆菌A4用作杀藻剂，应用于抑制水体藻类生长，优选的，应用于抑制水绵生长，或者说，应用于青苔防治；特别是应用于水产养殖水体环境中的青苔防治，例如虾蟹等其他水产动物养殖水体环境的青苔防治。

本领域技术人员可以通过常规的枯草芽孢杆菌发酵方法(例如上述第四部分)获得本发明枯草芽孢杆菌A4的微生物菌剂，并将其作为杀藻剂或杀青苔剂直接撒入水体环境中，优选水产养殖水体环境，更优选虾蟹等其他水产动物养殖水体环境。

关于本发明枯草芽孢杆菌A4的微生物菌剂，可以按照常规的微生物工业化生产方法获得枯草芽孢杆菌A4发酵菌液或所述发酵菌液制得的菌液制剂或所述发酵菌液经干燥制得的菌粉制剂。

应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施方式中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)A4，该枯草芽孢杆菌A4保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M 20221167。

2.一种微生物菌剂，其特征在于：所述微生物菌剂包含如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌A4的发酵菌液或所述发酵菌液制得的菌液制剂或所述发酵菌液经干燥制得的菌粉制剂。

3.一种杀藻剂，其特征在于：所述杀藻剂包含如权利要求1所述枯草芽孢杆菌A4或如权利要求2所述的微生物菌剂。

4.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌A4、如权利要求2所述的微生物菌剂或如权利要求3所述的杀藻剂在抑制水绵生长方面的应用。

5.如权利要求4所述应用，其特征在于：所述应用为青苔防治方面的应用。

6.如权利要求5所述应用，其特征在于：所述青苔防治为水产养殖水体环境中的青苔防治。

7.一种用于青苔防治的生物制剂，其特征在于：所述生物制剂包含如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌A4或如权利要求2所述的微生物菌剂。