KR20140117747A

KR20140117747A - 복수 종의 바실러스 혼합균에 의한 염분을 함유한 유기폐수 정화방법 및 미생물제재

Info

Publication number: KR20140117747A
Application number: KR1020130032144A
Authority: KR
Inventors: 강경호; 강형일; 최석진; 허준욱; 정지섭; 김중근; 김지건
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2013-03-26
Filing date: 2013-03-26
Publication date: 2014-10-08
Also published as: KR101476031B1

Abstract

본 발명은 연안 갯벌에서 유기물 분해능이 매우 우수한 것으로 알려진 갯지렁이(Perinereis aibuhitensis)에 내생하고 있는 미생물을 MA 배지에서 생장하여 나타난 집락(colony)의 색깔과 모양에 따라 선별한 31개의 집락을 별도로 선별하여 순수배양한 후 16S rRNA 염기서열에 기초하여 동정한 결과, Bacillus 속에 포함되는 균주를 분리하였다. 갯지렁이로부터 분리하여 선별한 Bacillus 균주 EBW4와 CBW4는 단백질, 탄수화물, 지질 분해능이 뛰어나고 염분에 내성을 갖고 있으므로 유기물로 오염된 양식장 폐수 환경을 정화하는데 유용하게 쓰일 수 있을 것이다.

Description

복수 종의 바실러스 혼합균에 의한 염분을 함유한 유기폐수 정화방법 및 미생물제재{Bacillus spp., identified from lugworm and microbial cleaning agent.}

본 발명은 연안 갯벌에서 유기물 분해능이 매우 우수한 것으로 알려진 갯지렁이(Perinereis aibuhitensis)에 내생하고 있는 미생물 중 영양물질의 소화 및 생물면역과 밀접하게 연관된 것으로 알려져 있는 Bacillus균의 다양성을 배양법에 기초하여 복수종의 바실러스 균주CBW4와 EBW4를 동정분석하고, 동정된 신규 균주 EBW4와 CBW4 2개의 복수 종의 혼합균을 이용한 천연 미생물제재를 제조하여 양식장 폐수와 반응시켜 양식장에서 배수되는 사육폐수에 포함되는 유기물을 분해하는데 적합한 양식장 폐수 처리용 미생물제재 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

갯지렁이는 해양 무척추동물로 조간대 갯벌과 강 하구에 넓게 분포되어 있는 저서생물 중의 하나로, 스트레스를 받은 환경 조건에 대한 적응능력 때문에 연구자들은 이들 갯지렁이들을 환경 파수꾼으로서 뿐만 아니라 모니터링 프로그램을 위해 잠재적으로 중요한 생태종으로서 간주한다.

여과 섭식을 하는 많은 저서생물들은 흔히 가정이나 수서생태계에서 물의 유기물을 제거하고 정화하는데 흔히 사용되며, 특히 Perinereis sp.를 비롯한 여러 종의 갯지렁이들이 새우 양식장 환경에서 비통제 방식으로 사용되는 것으로 알려져 있다.

조간대에서 세균 군집에 미치는 대형 무척추동물의 영향에 대한 연구에서 굴, 대합, 그리고 연체동물들은 비브리오균의 주요 저장소로 알려져 있다. 부유성 세균의 영양학적 기능과 관련하여 갯지렁이를 비롯한 여과 섭식자(suspension feeders)를 대상으로 폭 넓게 연구되어 왔으며 (Gili and Coma, 1998; Orejas et al., 2000; Prieur et al ., 1990), 갯지렁이 Sabella spallanzanii는 주위 환경으로부터 매우 효과적으로 박테리아를 축적하고 농축할 수 있는 능력이 있음을 보고한 바 있다 (Stabili et al ., 2006b).

특히 동물의 장내 미생물상은 영양분의 소화 및 흡수 능력을 향상시키거나 감염성 질병에 대한 체 저항성을 증가시킬 수 있는 수백 개의 다른 세균으로 구성되어 있다(Tannock, 1998; Walker and Duffy, 1998).

일반적으로, 배양된 세균으로부터 얻어진 자료는 특정 환경에 존재하는 전체 세균을 대표하지는 않아서 미생물 다양성에 대한 해석이 매우 제한적이기 때문에, 이를 극복하기 위해 최근에는 환경으로부터 genomic DNA를 직접 분리하여 metagenomic library를 조립한 후 16S rRNA 유전자 서열 결정을 통하여 미생물다양성을 분석하는 연구가 활발히 수행되어 왔다.

이러한 배양법에 의한 세균의 연구는 잠재적인 대사활성은 물론 생지화학적 순환에서 종속영양세균의 역할에 대한 의미있는 정보를 제공해줄 뿐만 아니라, 특히 Bacillus에 속하는 수많은 종들은 배양이 가능하다는 점에서 배양세균에 대한 연구로도 충분히 의미있는 가치를 도출할 수 있을 것이다. 이를 바탕으로 본 발명은 연안 갯벌 지렁이에 서식하는 바실러스(Bacillus ) 균 다양성 분석에 초점을 맞추어 MA 배지에서 생장하여 나타난 집락(colony)의 색깔과 모양에 따라 선별한 31개의 집락을 별도로 선별하여 순수배양한 후 16S rRNA 염기서열에 기초하여 바실러스(Bacillus ) 균주를 동정하였다.

한편, 전 세계적으로 식량 위기에 대응하여 양식업에 대한 관심이 집중되고 있으며, 양식업은 수산 식량 공급의 주요 원천으로 그 역할이 높아지고 있다. 최근 양식장은 어류의 대량 생산 기반을 갖추고 있고, 양식장 내의 사육수의 순환 및 배수에 관한 방식 및 장치와 관련한 기술 개발이 이루어지고 있다.

특히, 육상에서 염분을 함유한 유기폐수로는 양식장에서 발생되는 사육폐수를 들 수 있으며, 해산어를 육상에서 양식하는 경우, 사육수로서 해수를 사용하여야하며, 이때 양식생물의 사육에 사용된 사육수는 사육생물이 배설한 유기물, 사료찌꺼기 등이 혼합되어 있어 재사용하기 어렵다. 따라서 양식어류를 사육한 사육수 내에 존재하는 유기물을 분해할 수 있는 미생물에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있고, 이는 어류들의 분비물 및 사료 찌꺼기 등이 존재하는 사육수를 배수하지 않고 오염된 사육수 안에 존재하는 단백질, 탄수화물, 지질 등과 같은 유기물을 미생물을 접종하여 배양함으로서 미생물에 의해 자연적으로 분해하여 다시 사용할 수 있는 양식장 폐수를 정화하여 처리할 수 있는 연구들이 진행되고 있다.

본 발명에서는 연안 갯벌 지렁이에 서식하는 염분 내성이 강한 바실러스(Bacillus ) 균주를 동정하여 동정된 바실러스(Bacillus ) 균주의 고분자 분해효소 활성시험을 통해 단백질, 탄수화물, 지질 분해능을 확인함으로서 염분을 함유한 유기물로 오염된 폐수를 정화할 수 있는 미생물 제재를 제공하고자한다.

국내 등록특허공보 제10-08689010호에는 진균에 대해 길항능력을 갖는 바실러스 속 (Bacillus spp.) 균주를 포함하는 미생물 제제에 관한 것으로, 보다 상세하게는 식물병원성 세균 및 진균에 대하여 길항능력을 갖는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 A-7 (Bacillus amyloliquefaciens A-7) 균주, 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 A-2 (Bacillus amyloliquefaciens A-2) 균주, 이의 대량 배양 기술 및 이를 포함하는 식물의 진균 방제용 조성물 및 이의 제형화 기술이 개시되어있다. 국내 등록특허공보 제10-10863670호는 식물생장 촉진 활성을 갖는 신균주 바실러스 아리아바타이 LS9 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로, 식물 생장촉진 활성을 갖는 바실러스 아리아바타이 LS9 균주 또는 균주의 배양물을 포함하는 미생물 제제 및 상기 균주를 이용한 식물생장 촉진 방법에 관한 구성이 개시되어있다. 국내등록특허공보 제10-08507430호는 포도상구균에 항균성이 있는 바실러스 서브틸리스 균주 및 이를 이용한 생균제에 관한 구성이 개시되어 있으나, 상기에 개시된 균주들은 육상식물 또는 동물에서 유래하는 종으로 본 발명에서와 같이 염분에 대한 내성을 갖는 해산동물을 기반으로 동정된 것이 아니라는 점에서 큰 차이를 갖는다.

본 발명은 연안 갯벌에서 유기물 분해능이 매우 우수한 것으로 알려진 갯지렁이(Perinereis aibuhitensis)에 내생하고 있는 미생물 중 영양물질의 소화 및 생물면역과 밀접하게 연관된 것으로 알려져 있는 바실러스(Bacillus )균주로부터 신규 바실러스 균주를 동정하여 제공함과 동시에 신규 상기 균주들의 단백질, 탄수화물, 지질 분해능을 검증함으로서 유기물로 오염된 염분을 함유한 폐수를 정화하는데 유용하게 쓰일 수 있는 미생물제제를 제공하고자 하는 것이다.

본 발명에서는 연안 갯벌에서 유기물 분해능이 매우 우수한 것으로 알려진 갯지렁이(Perinereis aibuhitensis)에 내생하고 있는 미생물 중 영양물질의 소화 및 생물면역과 밀접하게 연관된 것으로 알려져 있는 Bacillus균의 다양성을 배양법에 기초하여 분석하였다.

MA 배지에서 생장하여 나타난 집락(colony)의 색깔과 모양에 따라 선별한 31개의 집락을 별도로 선별하여 순수배양한 후 16S rRNA 염기서열에 기초하여 동정한 결과, Bacillus 속에 포함되는 11 균주를 분리하였다. Bacills 속(genus)에 포함되는 11 균주의 다양성을 분석한 결과 바실러스 알지콜라(Bacills algicola ), 바실러스 안트라시스( Bacills anthrasis ), 바실러스 아퀴마리스( Bacills aquimaris ), 바실러스 바바리쿠스( Bacills barbaricus ), 바실러스 화진포엔시스( Bacills hwajinpoensis), 바실러스 난히엔시스( Bacills nanhiensis ), 바실러스 비에트남엔시스( Bacills vietnamensis ) 등 모두 7 종 (species)의 Bacillus spp.가 갯지렁이(Perinereis aibuhitensis)에 내생하는 것으로 조사되었다.

본 발명에서 밝혀진 11개의 Bacillus 균주의 16S rRNA 염기서열을 기초로 계통관계를 분석하였을 때 크게 5개 그룹으로 구분되었으며, 그 중 Bacillus 균주 바실러스 안트레시스(이하 "CBW4" 라 한다)와 바실러스 화진포엔시스(이하 "EBW4" 라 한다) 의 특성을 분석하였다.

고분자 분해효소 활성 시험을 통하여 균주 CBW4와 EBW4 모두가 DNAse 활성과 함께, 카제인을 분해하여 단백질 분해 효소 활성을 가지고 있는 것으로 나타났다. 또한 CBW4는 strach를 분해하는 효소 활성을 가지고 있었으나 EBW4는 starch 분해능이 없는 것으로 나타났고, CBW4와 EBW4 모두 대부분의 Tween을 분해하는 것으로 나타나 지질 분해 효소 활성을 가지고 있는 것으로 나타났다. 특히 균주 CBW2와 CBW4는 Bacillus vietnamensis 15-1^T및 Bacillus anthracis ATCC 14578^T와각각 90.7%와 94.2%의 상동성을 보였으며, EBW4는 Bacillus hwajinpoensis SW-72^T와96.8%의 상동성을 보여 신종(new species) 균주로 밝혀졌다.

본 발명에서 유기물 분해능이 매우 우수한 것으로 알려진 갯지렁이(Perinereis aibuhitensis)에 내생하고 있는 미생물 중 영양물질의 소화 및 생물면역과 밀접하게 연관된 것으로 알려져 있는 Bacillus균의 다양성을 배양법에 기초하여 연안 갯지렁이로부터 Bacillus 균주인 EBW4와 CBW4를 동정하였고, 동정된 미생물들의 활성 분석결과와 염분내성을 갖는 것으로부터 유기물로 오염된 염분을 함유한 폐수를 정화하는데 필요한 미생물제제로서 유용하게 사용가능하여 환경보호에 효과가 있다..

도 1은 갯지렁이의 사진을 나타낸다.
도 2은 갯지렁이 유래 Bacillus 균주의 동정과정을 나타내는 모식도이다.
도 3은 갯지렁이로부터 분리 동정한 바실러스 균주 CBW4의 16S rDNA 유전자의 염기서열을 나타낸다.
도 4는 갯지렁이로부터 분리 동정한 바실러스 균주 EBW4의 16S rDNA 유전자의 염기서열을 나타낸다.
도 5는 동정된 갯지렁이 유래 바실러스 균주의 계통관계를 나타내는 모식도이다.
도 6은 바실러스 속(기탁번호:KACC91722P)의 특허미생물 수탁증을 나타낸다.
도 7은 바실러스 속(기탁번호:KACC91749P)의 특허미생물 수탁증을 나타낸다.
도 8은 갯지렁이 유래 Bacillus sp. 균주로부터 미생물제제를 제조하기 위한 방법을 나타내는 모식도이다.
도 9는 갯지렁이 유래 Bacillus 균주를 이용하여 제조된 미생물제제가 사용되는 폐수처리시설의 예를 나타낸다.

본 발명은 갯지렁이로부터 동정된 기탁번호: KACC91722P와 KACC91749P의 바실러스(Bacillus sp.) 속 균주로부터 배양되는 염분 내성이 있고 단백질, 탄수화물, 지질 및 계면활성제 중에 선택되는 어느 하나 이상의 유기물 분해능이 있는 이종의 새로운 바실러스 균주들을 이용한 염분을 함유한 유기물로 오염된 폐수를 정화할 수 있는 미생물제제 및 이의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 신균주인 상기 바실러스 속 균주 CBW2와 CBW4는 본 발명자들에 의해 최초로 분리 동정된 것으로서, 연안 갯벌에서 유기물 분해능이 매우 우수한 것으로 알려진 갯지렁이(Perinereis aibuhitensis)에 내생하고 있는 미생물을 배양법에 기초하여 처음으로 분리 동정하였다.

분리한 균주의 16S rDNA 서열 검색에 의한 분자 유전학적인 방법에 의해 분석하여 동정한 결과, 밝혀진 11개의 Bacillus 균의 16S rRNA 염기서열을 기초로 계통관계를 분석하였을 때 크게 5개 그룹으로 구분되었으며, 그 중 균주 CBW2와 CBW4는 Bacillus vietnamensis 15-1^T및 Bacillus anthracis ATCC 14578^T와각각 90.7%와 94.2%의 상동성을 보였으며, EBW4는 Bacillus hwajinpoensis SW-72^T와96.8%의 상동성을 보여 신종(new species) 균주임을 알 수 있었다.

이에 본 발명자들은 바실러스 화진포엔시스(Bacillus hwajinpoensis SW-72T)와 96.8%의 상동성을 보인 상기 분리 및 동정된 본 발명의 신균주를 "Bacillus sp. EBW4"라고 명명하였으며, 2012년 10월 26일자로 국립농업과학원 농업유전자원센터(KACC)에 기탁하여 기탁번호 KACC91749P를 부여받았다.

또한, 본 발명자들은 상기 분리 및 동정된 본 발명의 신균주를 "Bacillus sp. CBW4"라고 명명하였으며, 2012년 6월 8일자로 국립농업과학원 농업 유전자원센터(KACC)에 기탁하여 기탁번호 KACC91722P를 부여 받았다.

이하 갯지렁이에서 신규주를 동정하기 위한 방법 및 균주의 유기물 분해능에 대하여 실시예를 중심으로 설명한다.

1 갯지렁이로부터의 균주 분리 동정

1.1 균주 분리 및 배양 조건

본 발명에서 균주 분리원으로 사용한 갯지렁이(Perinereis aibuhitensis)는 순천만 잿벌 양식장에서 채취하였다. 도 1은 갯지렁이의 사진을 나타내고, 도 2는 갯지렁이 유래 Bacillus 균주의 동정과정을 나타내는 모식도이다.

갯지렁이 내부에 존재하는 미생물을 분리하기 위해 살아있는 갯지렁이를 BM buffer (Mikesell et al ., 1993) 50 mL가 포함된 conical tube에 넣은 후, vortex에서 세 번 세척한 후, 70% ethanol에서 짧게 다시 한 번 세척하였다. 세척한 갯지렁이를 멸균된 면도날로 갯지렁이의 복부를 가르고 다시 여러 개의 매우 짧은 마디로 절단한 후, BM buffer 50 mL가 포함된 conical tube에 넣어 격렬하게 vortexing 하여 갯지렁이 내생 미생물이 buffer안으로 빠져나오게 하였다.

이어서, 갯지렁이를 제거한 후 12000 rpm으로 원심분리하여 pellet을 모은 후 2mL의 BM buffer를 첨가하여 잘 섞은 후, 100㎕씩 고체 Bacto marine agar 2216(MA)배지에 접종하여 미생물을 배양하였다. MA배지는 1:10과 1:2로 희석한 배지 및 희석하지 않은 배지를 동시에 사용하여 배양법에 의하여 분석할 수 있는 미생물 다양성을 높이고자 하였다. 기타 환경조건별 균주의 생장 여부를 파악할 때는 분리한 모든 균주가 LB에서 생장할 수 있었기 때문에, LB 또는 LB agar 배지를 기본배지로 사용하였으며, 구체적인 균주 배양조건은 환경 조건별 생장시험에 자세히 나타내었다.

1.2. Total genomic DNA 분리와 정제

각 균주를 50 mL의 LB 배지에 접종하고 30℃에서 180 rpm으로 24시간 동안 배양한 후 원심분리 (6,300 ㅧ g, 10 min, 4℃)하여 세포를 수확하였다. 회수된 배양세포를 5 mL TES buffer [0.1 M Tris-HCl (pH 7.0), 0.01 M EDTA, 1 M NaCl]로 재현탁하고, lysozyme (10 mg/mL)을 200㎕ 첨가하여 37℃에서 15분간 반응시켰다. 10% SDS를 100㎕ 첨가하고, 물리적인 DNA 절단을 방지하기 위하여 천천히 섞어준 후 50㎕ proteinase K (20㎎/㎖)와 5㎕ RNase를 첨가하여 37℃에서 30분간 반응시켰다. 5㎖ TES buffer를 더 첨가형 10㎖의 phenol을 첨가하여 잘 섞어주었다.

원심분리를 통하여 얻어진 상징액을 취하여 새로운 tube로 옮긴 후 동량의 phenol/choroform/isoamyl alcohol로 2회, chlorofrom으로 1회 처리하였다. 상징액을 취하여 새로운 tube로 옮긴 후 1/10 volume의 3M sodium acetate(PH.54)와 2-3 volume의 100% ethanol을 첨가하여 30분간 실온에서 방치하였다.

원심분리 후 상징액을 버리고, 70% ethanol을 처리하여 염류를 씻어낸 후, 다시 한번 원심분리하였다. 상징액을 버리고 공기 중에서 ethanol을 제거한 후, 침전물 500㎕의 멸균수에 녹여 다음 실험에 사용하였다. 0.8% agarose gel에 전기영동을 실시하여 DNA band를 확인한 후 UV-spectrophotometer (여 800, Beckman Coulter, Fullerton, USA)를 이용하여 정량하였다.

Total DNA의 정제를 위해 crude DNA를 10㎖ cesium chloride용액에서 녹인 후 ethidium bromide를 첨가하여 102,200um membrane filter를 이용하여 30분간 투석하여 DNA 용액을 회수하여 농축한 후 특정 유전자의 증폭 또는 클로닝을 위한 시료를 사용하였다.

1.3. 16S rRNA 유전자 염기서열 및 계통관계 분석

세균의 16S rDNA 염기서열 분석은 분리 균주들을 액체 배지에서 30℃에서 2일-3일 동안 배양한 후 이로부터 추출된 chromosomal DNA를 PCR 반응의 주형으로, 프라이머는 Eub27F : 5' -AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG- 3'와 Eub1522R : 5' -AAG GAG GTG ATC CAR CCG CA- 3'로 이루어진 한 세트가 사용하였다.

PCR 반응은 GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems, CT)를 사용하여 수행하였고, 반응 조건은 95℃에서 5분간 초기 열처리를 한 후, 95℃에서 1분, 55℃에서 1분, 72℃에서 1분씩 30번 반복하여 마지막에는 72℃에서 1분간 처리한 후 4℃에서 보관하였다. 증폭된 DNA는 1.0% agarose gel에서 전기영동한 후 gel extraction kit(SolGent사)에 의해 회수되었다.

회수된 DNA는 pGEM-T easy vector(Promega, Madison, Wisconsin)에 ligation한 후 E. coli JM109에 형질전환하였다. 형질전환된 클론의 플라스미드 DNA를 분리한 후 promoter primer나 SP6 promoter primer를 이용하여 ABI 377 자동염기서열 분석기(Applied Biosystem, Foster, USA)에서 양방향으로 DNA sequencing을 수행하였다.

결정된 염기서열은 Ribosomal Database Project-Ⅱ(http://rdp.cme.msu.edu) GenBankhttp://ncbi.nlm.nih.gov)의 database를 이용하여 분석하였다. 염기서열이 결정된 미생물의 계통관계는 EZtaxon을 이용하여 type 균주들의 16S rNA 염기서열과의 관계를 나타내었다.

1.4 배양의존성 갯지렁이 내생 미생물 분리 결과

희석법에 의해 3 종류의 영양분의 농도로 조정하여 제조된 MA 배지에 갯지렁이 추출물이 포함된 BM buffer 0.1 mL를 접종하여 분리 배양한 세균들을 분석하였다. MA 배지에서 생장하여 나타난 집락(colony)의 색깔과 모양에 따라 30개의 집락을 별도로 선별하여 순수배양한 후 16S rRNA 염기서열에 기초하여 동정한 결과, 11 균주가 Bacillus 속(genus), 1 균주가 Micrococcus 속, 1 균주가 Pantoea 속, 7 균주가 Shewanella 속, 10 균주가 Vibrio 속에 포함되는 것으로 밝혀졌다 (표 1).

16S rRNA 서열에 기초한 갯지렁이 유래 세균의 동정

Strain	Closest Relatives	Similarity (%)	Diff / Total nt
CBW1	Shewanella marisflavi SW-117^T	98.4	23/1441
CBW2	Bacillus vietnamensis 15-1^T	90.7	127/1362
CBW3	Bacillus barbaricus V2-BIII-A2^T	96.8	46/1419
CBW4	Bacillus anthracis ATCC 14578^T	94.2	76/1305
CBW5	Bacillus nanhaiensis JSM 082006^T	99.2	11/1429
CBW6	Shewanella marisflavi SW-117^T	98.8	18/1441
CBW7	Bacillus nanhaiensis JSM 082006^T	99.6	5/1401
CBW8	Vibrio azureus LC2-005^T	99.2	10/1298
CBW9	Bacillus algicola KMM 3737^T	98.5	22/1443
CBW10	Vibrio azureus LC2-005^T	98.8	15/1298
CBW11	Micrococcus yunnanensis YIM 65004^T	99.0	13/1393
CBW12	Vibrio azureus LC2-005^T	99.2	11/1298
CBW13	Vibrio azureus LC2-005^T	99.2	10/1298
CBW14	Bacillus barbaricus V2-BIII-A2^T	99.0	14/1419
CBW15	Bacillus vietnamensis 15-1^T	98.0	27/1311
CBW16	Shewanella marisflavi SW-117^T	98.6	20/1439
CBW17	Shewanella marisflavi SW-117^T	97.5	36/1435
CBW18	Pantoea septica LMG 5345^T	99.6	5/1340
CBW19	Shewanella marisflavi SW-117^T	99.7	4/1416
CBW20	Bacillus aquimaris TF-12^T	99.4	8/1403
CBW21	Bacillus aquimaris TF-12^T	99.2	11/1401
EBW1	Vibrio azureus LC2-005^T	98.5	19/1297
EBW2	Vibrio azureus LC2-005^T	99.2	10/1298
EBW3	Vibrio azureus LC2-005^T	99.4	8/1295
EBW4	Bacillus hwajinpoensis SW-72^T	96.8	47/1446
EBW5	Vibrio azureus LC2-005^T	99.2	11/1298
EBW6	Shewanella aquimarina SW-120^T	98.0	30/1438
EBW7	Shewanella aquimarina SW-120^T	98.0	29/1440
EBW8	Vibrio azureus LC2-005^T	99.2	11/1298
EBW9	Vibrio azureus LC2-005^T	99.2	10/1298

1.5 갯지렁이 유래 Bacillus 균주의 다양성 및 계통관계 분석

본 발명에서 바실러스 알지콜라(Bacillus algicola ), 바실러스 안트라시시(Bacillus anthrasis ), 바실러스 아퀴마리스( Bacillus aquimaris ), 바실러스 바바리쿠스( Bacillus barbaricus ), 바실러스 화진포엔시스( Bacillus hwajinpoensis ), 바실러스 난히엔시스(Bacillus nanhiensis ), 바실러스 비에트남엔시스(Bacillus vietnamensis) 등 다양한 종의 Bacillus가 갯지렁이 내에 서식하는 것으로 나타났다.

본 발명에서 밝혀진 11개의 Bacillus 균의 16S rRNA 염기서열을 기초로 계통관계를 분석하였을 때 크게 5개 그룹으로 구분되었으며, 그 중 균주 CBW2와 CBW4는 Bacillus vietnamensis 15-1^T및 Bacillus anthracis ATCC 14578^T와각각 90.7%와 94.2%의 상동성을 보여 신종(new species)일 가능성이 매우 높은 것으로 사료된다. 도 3은 갯지렁이로부터 분리 동정한 바실러스 균주 CBW4의 16S rDNA 유전자의 염기서열을 나타내고, 도 4는 갯지렁이로부터 분리 동정한 바실러스 균주 EBW4의 16S rDNA 유전자의 염기서열을 나타낸다. 도 5는 동정된 갯지렁이 유래 Bacillus sp. 균주의 계통관계를 나타내는 모식도이다. 갯지렁이에 내생하는 미생물에 대한 발명은 본 발명에서 처음 밝혀진 것으로 이들 미생물군의 기능과 관련해서는 심층적인 분석이 이루어질 필요가 있다.

본 발명에서 갯지렁이(Perinereis aibuhitensis)로부터 분리한 세균 중 우점종으로 나타난 다양한 Bacillus에 대한 정보는 본 발명에서 처음으로 보고하는 것으로 파악됨에 따라 유기물 분해능이 뛰어나 선별한 두 개의 Bacillus 균주 CBW4와 EBW4에 대한 특성을 자세히 조사하였다. 도 6은 분리한 바실러스 속(기탁번호:KACC91722P)의 특허미생물 수탁증을 나타내며, 도 7은 분리한 바실러스 속(기탁번호:KACC91749P)의 특허미생물 수탁증을 나타낸다.

2. 갯지렁이에서 동정한 신규주의 환경조건별 생장 특성

가. 환경 조건별 균주 생장 시험

본 발명에서는 온도, PH, 염도 등 세 가지 환경 조건을 달리하여 균주의 생장 여부를 조사하였다. 균 생장의 적정 온도 범위를 정하기 위해 균주를 LB 배지에 접종한 후 4℃, 15℃, 25℃, 30℃, 40℃, 45℃, 50℃, 55℃으로 조건을 달리하여 각각 배양하였으며, 30℃이하는 LB 고체 배지에, 40℃부터는 LB 액체 배지에 균주를 접종한 후 수조(water bath)에서 배양하면서 생장 여부를 관찰하였다.

균 생장의 적정 염도범위는 sodium chloride를 이용하여 LB 배지의 염도를 1%, 3%, 5%, 7%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%로 조정하였고, 균 생장의 적정 pH 범위는 NaOH와 HCl을 이용하여 LB 배지의 pH를 pH3에서 pH11까지 pH1 단위로 조정하여 사용하였다. 균주의 생장 여부는 균주 접종 후 각 균주의 적정 생장 온도에서 5일간 배양하면서 생장여부를 확인하였다.

나. 갯지렁이 유래 선별 Bacillus 균주의 배지 이용능 시험 결과

본 발명에서 선별한 두 Bacillus 균주를 MA(marine agar), NA(nutrient agar), TSA (tryptic soy agar), R₂A, LB (Luria-Bertani)배지에서 이용한 생장능을 시험한 결과, CBW4와 EBW4는 일부는 육상 혹은 담수에서 유래한 Bacillus 균주와는 다르게 LB, TSA, 또는 NA 배지에서 생장하지 못하는 것으로 나타났고, 시험한 두 균주 모두 다량의 염분을 포함하고 있는 MA배지에서 생장하는 것으로 나타나 염분 요구성이 모두 큰 것으로 나타났다(표 2).

다양한 배지에서 생장능 시험

Strain	MA	LB	TSA	NA	R ₂ A
CBW4	+	+	+	-	+
EBW4	+	-	-	+	+

3. 갯지렁이에서 동정한 신규주의 생리, 생화학적 특성

가. 세균의 형태적, 생리, 생화학적 특성 분석

세균의 형태적, 생리적 특성을 보기 위해 균주들을 MA(marine agar) 고체배지에 접종하여 25℃에서 배양하였다. 먼저 5-7일 동안 배양하면서 형성되는 단일 콜로니의 형태, 색깔, 크기를 관찰하였으며, 균주의 형태와 크기는 광학 현미경과 주사전자현미경을 이용하여 관찰하였다. 전자현미경 관찰시, 배양된 세균을 4% glutaraldehyde로 2시간 동안 고정시킨 후, 50mM phosphate 완충용액 (pH 7.2)을 이용하여 세적하였다. 그리고 2% osmium tetroxide 용액에 1시간 고정한 후 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100% 에탄올로 탈수시킨 후 동결건조 시켰다. 이 후 ion sputter를 이용하여 gold coating을 한 후 전자현미경을 이용하여 관찰하였다.

균주의 운동성은 0.4%의 agar를 포함시킨 semisolid 배지에서 확인하였고, 산소 대사와 관계된 oxidase는 Oxidase Reagent Kit(BioM'rieux)를 이용하여 콜로니 색의 변화로 분석하였다. Catelase는 3% 과산수소를 균체에 떨어뜨려 거품이 발생 유, 무로 판단하였다.

기타 분리 균주의 생리·생화학적 특성은 여러 가지 API kit(BioM'rieux)를 하용하였으며, API 20E, APL 20NE, API 50CHB, 그리고 API ZYM kit를 동시에 이용하여 균주의 특성을 조사하였다. 이때 균주는 MA 고체배지를 이용하여 25℃에서 2일-3일간 배양하였으며, 성장된 균체는 멸균된 3% sea salt 용액에 현탁하여 제조회사의 지시에 따라 수행하였다. 주요 조사 항목으로는 nitrate 환원반응, esterase(C4), esterase lipase(C8), leucine arylamidase, acid phosphatase, naphtol-AS-Bi-phosphohydrolase, glucose acidification, gelatin 액화, arginine dihydrolase, urease, β-glucosidase, β-galactosidase, alkalin phosphatase, lipase(C14) 등이 효소활성 유무, indole 생성 여부 등을 들 수 있다. 또한 탄소원 mannitol, gluconate, malate, citrate, glucose, arabinose, mammose, N-acetyl-glucosamine, maltose, caprate, adipate, phenyl-acetate 등의 동화 여부 등에 대하여 조사하였다.

나. 갯지렁이 유래 선별 Bacillus 균주의 생리생화학적 특성 분석 결과

API 20NE kit를 이용하여 Bacillus 균주의 생리생화학적 특성을 분석하였다. 균주 CBW4와 EBW4 모두가 β-glucosidase와 protease 효소 활성을 가지고 있었고, maltose를 이용할 수 있는 것으로 나타났다(표 3).

API 20NE kit를 이용한 Bacillus 균주의 특성 분석

Test	Reactions / Enzymes	CBW4	EBW4
NO₃	reduction of nitrates to nitrites // reduction of nitrates to nitrogen	+/-	+/-
TRP	indole production	-	-
GLU	acidification	-	-
ADH	arginine dihydrolase	-	-
URE	urease	-	-
ESC	hydrolysis(β-glucosidase)	+	+
GEL	hydrolysis(protease)	+	+
PNPG	β-galactosidase	-	w+
GLU	glucose assimilation	W+	w+
ARA	arabinose assimilation	W+	w+
MNE	mannose assimilation	-	w+
MAN	mannitol assimilation	W+	+
NAG	N-acetyl-glucosamine assimilation	W+	w+
MAL	maltose assimilation	+	+
GNT	gluconate assimilation	W+	W+
CAP	caprate assimilation	-	-
ADI	adipate assimilation	W+	w+
MLT	malate assimilation	w+	w+
CIT	citrate assimilation	W+	w+
PAC	phenyl-acetate assimilation	W+	w+

API 20E kit를 이용한 시험 결과, 균주 CBW4는 arginine dihydrolase, lysine decarboxylase, gelatinase 활성이 높은 것으로 나타난 반면, EBW4는 β-glucosidase와 gelatinase 활성을 가지고 있었다(표 4).

API 20E kit를 이용한 Bacillus 균주의 특성 분석

Test	Reactions / Enzymes	CBW4	EBW4
OPNG	Beta-galactosidase	-	+
ADH	Arginine dihydrolase	+	-
LDC	Lysine decarboxylase	+	-
ODC	Ornithine decarboxylase	-	-
CIT	Citrate utilization	-	-
H₂S	H2S production	-	-
URE	Urease	-	-
TDA	Tryptophane deaminase	-	-
IND	Indole production	-	-
VP	Acetoin production	-	-
GEL	gelatinase	+	+
GLU	Glucose F/O	-	-
MAN	Mannitol F/O	-	-
INO	Inositol F/O	-	-
SOR	Sorbitol F/O	-	-
RHA	Rhamnose F/O	-	-
SAC	Sucrose F/O	-	-
MEL	Melibiose F/O	-	-
AMY	Amygdalin F/O	-	-
ARA	Arabinose F/O	-	-

API 50CHB/E kit를 이용한 시험 결과, 균주 CBW4와 EBW4 모두 glycerol, ribose, glucose, fructose, esculin, cellobiose, maltose, trehalose, starch를 이용할 수 있는 능력이 있는 것으로 나타났다. 이외에 CBW4는 arbutin, salicin, lactose 등을 이용할 수 있는 능력이 있는 반면, EBW4는 이들을 이용할 수 없었으나, CBW4 균주가 이용하지 못하는 mannose, mannitol, α-methyl-D-glucoside, N-acethyl-glucosamine, melibiose, sucrose, raffinose, D-turanose 등 다양한 당을 이용하는 것으로 나타나 두 균주가 상당히 다른 특성을 갖고 있었다(표 5).

API 50CHB/E kit를 이용한 Bacillus 균주의 특성 분석

No .	Substrate	CBW4	EBW4
0	CONTROL	-	-
1	GLYcerol	+	+
2	ERYthritol	-	-
3	DARAbinose	-	-
4	LArbinose	-	-
5	RIBose	+	+
6	DXYLose	-	-
7	LXYLose	-	-
8	ADOnitol	-	-
9	β-Methyl-D-Xyloside	-	-
10	GALzctose	-	+
11	GLUcose	+	+
12	FRUctose	+	+
13	MaNnosE	-	+
14	SorBosE	-	-
15	RHAmnose	-	-
16	DULcitol	-	-
17	INOsitol	-	-
18	MANnitol	-	+
19	SORbitol	-	-
20	α-Methyl-D-Mannoside	w+	-
21	α-Methyl-D-Glucoside	w+	+
22	N-Acethyl-Glucosamine	w+	+
23	AMYgdalin	w+	w+
24	ARButin	+	w+
25	Esculin	+	+
26	SALicin	+	w+
27	CELlobiose	+	+
28	MALtose	+	+
29	LACtose	+	-
30	MELibiose	-	+
31	Sucrose	-	+
32	TREhalose	+	+
33	INUlin	-	-
34	MeLeZitose	-	w+
35	RAFfinose	-	+
36	Starch	+	+
37	GLYcoGen	w+	+
38	XyLiTol	-	-
39	GENtiobiose	-	-
40	DTURanose	-	+
41	DLYXose	-	-
42	DTAGatose	-	-
43	DFUCose	-	-
44	LFUCose	-	-
45	DArabitoL	-	-
46	LArabitol	-	-
47	GlucoNaTe	-	w+
48	2-keto-Gluconate	-	W+
49	5-keto-Gluconate	-	-

API ZYM kit를 이용한 효소활성 시험 결과, 균주 CBW4와 EBW4 모두 alkaline phosphatase, leucine arylamidase, α-chymotrypsin 활성을 가지고 있는 것으로 나타났다. 이외에 CBW4는 매우 높은 acid phosphatase 활성과 함께 β-glucosidase 활성을 가지고 있는 것으로 조사되었다. EBW4는 CBW4 균주에서는 탐지하지 못한 esterase 활성을 갖고 있었다(표 6).

API ZYM kit를 이용한 Bacillus 균주의 특성 분석

NO .	Enzyme Assayed For	CBW4	EBW4 -1
1	Control
2	Alkaline phosphatase	4+	4+
3	Esterase (C4)	1-	3+
4	Esterase Lipase (C8)	1-	2-
5	Lipase (C14)	0-	0-
6	Leucine arylamidase	4+	3+
7	Valine arylamidase	2-	2-
8	Crystine arylamidase	1-	1-
9	Trypsin	2-	0-
10	α-chymotrypsin	3+	3+
11	Acid phospatase	5+	0-
12	Naphtol-AS-Bl-phosphohydrolase	1-	0-
13	α-galactosidase	0-	0-
14	β-galactosidase	0-	2-
15	β-glucuronidase	0-	0-
16	α-glucosidase	2-	2-
17	β-glucosidase	4+	0-
18	N-acetyl-β-glucosaminidase	0-	0-
19	α-mannosedase	0-	0-
20	α-fucosidase	0-	0-

4. 신규균주의 염분을 함유한 유기폐수 정화용 미생물제제로의 응용

가. 고분자 물질 분해 효소 활성 시험

Bacillus의 다양한 고분자 물질 분해능을 알아보기 위해 셀룰로오스, 녹말, 카세인, 그리고 계면활성제(Tween80)이 포함된 LB 고체 배지에 본 발명에서 분리한 신규 이종의 Bacillus 균주, CBW4(기탁번호: KACC91722P)와 EBW4(기탁번호:KACC91749P)를 동일 비율로 접종한 후, 이들 고분자 물질 분해에 관련된 효소, cellulase, amylase, protease, 그리고 lipase 활성이 있는지에 대해 조사하였다.

균주의 셀룰로오스 분해능은 접종 후 30℃에서 3일 배양 후 congo red로 30분간 염색 후 1M NaCl을 이용하여 5분간 탈색하여 형성된 투명환으로, 녹말 분해는 iodine으로 30분 염색 후 1M NaCl로 5분간 탈색하여 형성된 투명환으로 판단하였다. 카세인과 Tween80은 각각 2일, 3일 배양하여 별다른 염색과정을 거치지 않고 육안으로 관찰된 투명환으로 분해능을 확인하였다. Alkaline protease 활성은 0.5% 농도의 Hammerstan casein (Merck)을 이용하여 100mM Tris-HCl buffer (pH 10.0)에서 결정하였다 (Joo et al., 2002). 효소활성의 1 Unit는 표준 분석 조건하에서 50℃에서 분당 1g의 티로신을 방출하는 효소의 양으로 정의된다.

나. 갯지렁이 유래 선별 Bacillus 균주의 고분자 분해 효소 활성 시험 결과

고분자 분해효소 활성 시험을 통하여 균주 CBW4와 EBW4 모두가 DNAse 활성과 함께, 카제인을 분해하여 단백질 분해 효소 활성을 가지고 있었다. CBW4는 strach를 분해하는 효소 활성을 가지고 있었으나 EBW4는 starch 분해능이 없는 것으로 나타났다. 또한, CBW4와 EBW4 모두 대부분의 Tween을 분해하는 것으로 나타나 지질 분해 효소 활성을 가지고 있는 것으로 나타났다.

따라서 본 발명에서 갯지렁이로부터 분리하여 선별한 두 Bacillus 균주들은 단백질, 탄수화물, 지질 분해능이 뛰어나 유기물로 오염된 갯벌 환경을 정화하는데 유용하게 쓰일 수 있을 것이다 (표 7).

고분자 분해 효소 활성 시험

Strain	Starch 1%	DNAse	CM / cellulose	Casein 1%	Tween
Strain	Starch 1%	DNAse	CM / cellulose	Casein 1%	20	40	60	80
CBW4	+	+	-	+	+	+	+	+
EBW4	-	+	-	+	-	+	+	+

다. 신규균주를 이용한 염분이 함유된 유기물 정화용 미생물 제제 제작

도 8은 갯지렁이 유래 Bacillus 균주로부터 미생물제제를 제조하기 위한 방법을 나타내는 모식도이고, 도 9는 갯지렁이 유래 Bacillus 균주를 이용하여 제조된 미생물제제가 사용되는 염분을 함유하는 유기물 폐수의 처리시설 예를 나타낸다.

갯지렁이로부터 동정된 새로운 균주 바실러스 속(Bacillus sp .) CBW4(기탁번호: KACC91722P)와 EBW4(기탁번호:KACC91749P)를 1:1의 비율로 액체 배양액에 접종하여 25-30℃에서 1-2일간 배양하였으며, 배양단계에서 얻은 결과물 일부를 액상 미생물제제로, 남은 일부를 무균적으로 건조시키고, 건조단계 후 얻어진 결과물을 무균적으로 분쇄하는 단계를 거쳐 분말형태의 미생물제제로 제조하였다.

액상제조물의 경우는 색상조절을 위한 부형제로서 식용색소등이 첨가될 수 있고, 저장성 개선을 위한 부형제로서 비타민C 등이 첨가될 수 있으며, 효소능력 활성화를 위한 부형제로서 Tween80 등이 첨가될 수 있다.

고체분말용의 경우는 발효용 부형제로서 미강, 탈지강, 당밀 등이 부가적으로 첨가되고, 저장성 개선용 부형제로서 규산염 등이 첨가가능하다.

[실시 예]

도 9는 갯지렁이 유래 Bacillus 균주를 이용하여 제조된 미생물제제가 사용되는 염분이 함유된 유기물 폐수가 많이 배출되는 양식장 사육수 처리시설의 공정도를 나타낸다. 일반 육상 양식장의 시설은 사용된 사육수를 그대로 하천 또는 바다로 방류하나 도 7에서와 같이 일정 공간에 배출되는 사육수를 모아 미생물 제재를 이용하여 유기물 분해처리를 실시하여 하천 또는 바다로 배출함으로서 양식장으로부터 방류되는 염분을 함유하는 사육폐수에 의한 오염방지가 가능하다.

염분을 함유한 유기물 폐수를 정화하기 위한 미생물 제제는 갯지렁이로 부터 동정된 복수 종의 새로운 균주 바실러스 속(Bacillus sp .) EBW4(기탁번호: KACC91726P)와 CBW4(기탁번호: KACC91722P)를 액체 배양액에 접종하여 25-30℃에서 1-2일간 배양하여, 배양단계에서 얻은 결과물 일부를 액상 미생물제제로, 남은 일부를 무균적으로 건조시키고, 건조단계 후 얻어진 결과물을 무균적으로 분쇄하는 단계를 거쳐 분말형태로 제조된 미생물제제를 이용하였다.

상기 갯지렁이로부터 동정된 기탁번호: KACC91722P의 바실러스 속(Bacillus sp.) CBW4와 EBW4(기탁번호: KACC91726P)와 배양물을 유효성분으로 함유하는 양식장 폐수 정화용 미생물 제제를 양식장 폐수 처리 반응수조에 살포하여 1 내지 3일간 배양 처리한 다음 유입수와 방류수의 성분을 분석한 결과, 사육수 내에 포함되는 단백질, 탄수화물, 지질 및 계면활성제등의 유기물이 배출수에서는 유입수 대비 배출수가 70-85% 감소한 것으로 나타났다.

즉, 염분을 함유한 유기물에 오염되어 배출되는 사육수 폐수는 양식생물이 배설한 단백질, 탄수화물, 지질 및 계면활성제 등의 유기물을 포함하고 있으나, 상기에서 제조된 미생물제재를 사육수 저장조에 접종하여 1-3일간 배양시킴으로서 사육수 저장조에서 배양된 미생물의 활성에 의해 양식수 내에 포함되는 유기물 물질이 분해되어 정화된 양식수를 바다로 흘러보냄으로서 양식장 사육폐수에 의한 오염방지가 가능한 환경보호형 재생산 산업으로의 이용이 가능하다.

본 발명의 염분 내성을 갖는 복수 종의 바실러스 속 신규 균주를 이용한 양식장 폐수 처리용 미생물 제재는 연안 갯지렁이로부터 분리하여 선별한 Bacillus 균주 CBW4와 EBW4는 단백질, 탄수화물, 지질 분해능이 뛰어나고 염분에 내성을 갖고 있으므로 양식생물의 활동에 따른 유기물로 오염된 양식장 폐수를 정화하는데 유용하게 활용할 수 있을 것이다.

농업생명공학연구원

KACC91749

20121026

농업생명공학연구원

KACC91722

20120608

<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> Bacillus spp., identified from lugworm and microbial cleaning agent <130> P201212064 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1378 <212> RNA <213> Bacillus sp. EBW4 <400> 1 tcgagcgaat ggattgagag cttgctctta tgaagttagc ggcggacggg tgagtaacac 60 gtgggtaacc tgcccataag actgggataa ctccgggaaa ccggggctaa taccggataa 120 tattttgaac tgcatggttc gaaattgaaa ggcggcttcg gctgtcactt atggatggac 180 ccgcgtcgca ttagctagtt ggtgaggtaa cggctcacca aggcaacgat gcgtagccga 240 cctgagaggg tgatcggcca cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca 300 gcagtaggga atcttccgca atggacgaaa gtctgacgga gcaacgccgc gtgagtgatg 360 aaggctttcg ggtcgtaaaa ctctgttgtt agggaagaac aagtgctagt tgaataagct 420 ggcaccttga cggtacctaa ccagaaagcc acggctaact acgtgccagc agccgcggta 480 atacgtaggt ggcaagcgtt atccggaatt attgggcgta aagcgcgcgc aggtggtttc 540 ttaagtctga tgtgaaagcc cacggctcaa ccgtggaggg tcattggaaa ctgggagact 600 tgagtgcaga agaggaaagt ggaattccat gtgtagcggt gaaatgcgta gagatatgga 660 ggaacaccag tggcgaaggc gactttctgg tctgtaactg acactgaggc gcgaaagcgt 720 ggggagcaaa caggattaga taccctggta gtccacgccg taaacgatga gtgctaagtg 780 ttagagggtt tccgcccttt agtgctgaag ttaacgcatt aagcactccg cctggggagt 840 acggccgcaa ggctgaaact caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg 900 tggtttaatt cgatgcaacg cgaagaacct tacctactct tgacatccag agaattcgct 960 agagatagct tagtgccttc gggagctctg agacaggtgc tgcatggctg tcgtcagctc 1020 gtgttgtgaa atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccttatcct tacttgccag 1080 cgggtcatgc cgggaacttt agggagactg ccggtgataa accggaggaa ggtggggacg 1140 acgtcaagtc atcatggccc ttacgagtag ggctacacac gtgctacaat ggcgagtaca 1200 gagggttgcg aagccgcgag gtggagctaa tctcagaaag ctcgtcgtag tccggattgg 1260 agtctgcaac tcgactccat gaagtcggaa tcgctagtaa tcgtggatca gaatgccacg 1320 gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccatgggagt gggctgca 1378 <210> 2 <211> 1374 <212> RNA <213> Bacillus sp. CBW4 <400> 2 tcgagcgaat gatgaggagc ttgctcctct gatttagcgg cggacgggtg agtaacacgt 60 gggtaatctg cctgtaagac ggggataact ccgggaaacc ggggctaata ccggataaca 120 agagaagaag catttcttct ttttgaaagt cggtttcggc tgacacttac agatgagccc 180 gcggcgcatt agctagttgg tgaggtaacg gctcaccaag gcgacgatgc gtagccgacc 240 tgagagggtg atcggccaca ctgggactga gacacggccc agactcctac gggaggcagc 300 agtagggaat cttcggcaat gggcgaaagc ctgaccgagc aacgccgcgt gagcgatgaa 360 ggccttcggg tcgtaaagct ctgttgttag agaagaacaa gtacgagagt aactgctcgt 420 accttgacgg tacctaacca gaaagccacg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata 480 cgtaggtggc aagcgttatc cggaattatt gggcgtaaag cgcgcgcagg cggtctctta 540 agtctgatgt gaaagcccac ggctcaaccg tggagggtca ttggaaactg ggagacttga 600 gtgcaggaga gaaaagtgga attccacgtg tagcggtgaa atgcgtagag atgtggagga 660 acaccagtgg cgaaggcggc tttttggcct gtaactgacg ctgaggcgcg aaagcgtggg 720 gagcaaacag gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa acgatgagtg ctaggtgttg 780 gggggttcca ccctcagtgc tgaagttaac acattaagca ctccgcctgg ggagtacgac 840 cgcaaggttg aaactcaaag gaattgacgg gggcccgcac aagcagtgga gcatgtggtt 900 taattcgaag caacgcgaag aacccttacc aggtcttgac atcctctgac cactctagag 960 atagagcttt ccccttcggg ggacagagtg acaggtggtg catggttgtc gtcagctcgt 1020 gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cttgacctta gttgccagca 1080 ttcagttggg cactctaagg tgactgccgg tgacaaaccg gaggaaggtg gggatgacgt 1140 caaatcatca tgccccttat gacctgggct acacacgtgc tacaatggat ggtacaaagg 1200 gttgcgaagc cgcgaggcca agccaatccc aaaaagccat tctcagttcg gattgtaggc 1260 tgcaactcgc ctacatgaag ccggaattgc tagtaatcgc ggatcagcat gccgcggtga 1320 atacgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcacaccac gagagtttgt aaca 1374

Claims

갯지렁이로부터 동정된 기탁번호 KACC91722P와 기탁번호 KACC91749P의 복수 종의 바실러스(Bacillus sp.) 속의 새로운 균주, CBW4와 EBW4의 복합 배양물을 유효성분으로 포함하는 염분을 함유한 유기폐수 정화용 미생물 정화제.
갯지렁이로부터 동정된 기탁번호 KACC91722P와 기탁번호 KACC91749P의 복수 종의 바실러스(Bacillus sp.) 속의 새로운 균주, CBW4와 EBW4의 복합 배양물을 유효성분으로 포함하는 염분을 함유한 유기폐수 정화용 미생물 정화제를 염분이 함유된 유기물 폐수처리 반응수조에 살포하여 폐수 내의 유기물을 분해시키는 것을 특징으로 하는 염분을 함유하는 유기폐수 정화 방법.
갯지렁이로부터 동정된 새로운 균주 바실러스 속(Bacillus sp.) CBW4(기탁번호: KACC91722P)와 EBW4(기탁번호:KACC91749P)를 배양액에 접종하여 25-30℃에서 1-2일간 배양하여 얻은 것을 특징으로 하는 염분을 함유한 유기폐수 정화용 미생물 정화제의 제조방법.
제3항에 있어서, 배양단계에서 얻은 결과물을 무균적으로 건조시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 염분을 함유하는 유기폐수 정화용 미생물 정화제의 제조방법.
제4항에 있어서 상기 건조단계 후 얻어진 결과물을 무균적으로 분쇄하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 염분을 함유하는 유기폐수 정화용 미생물 정화제의 제조방법.
제5항에 있어서 액상제조물에 색상조절을 위한 부형제 또는 저장성 개선을 위한 부형제 또는 효소능력 활성화를 위한 부형제중에서 선택되는 어느 하나의 물질이 부가적으로 첨가된 것을 특징으로 하는 염분을 함유하는 유기폐수 정화용 미생물 정화제의 제조방법.
제6항에 있어서 분쇄된 미생물제제에 발효용 부형제 또는 저장성 개선용 부형제중에서 선택되는 어느 하나의 물질이 부가적으로 첨가된 것을 특징으로 하는 염분을 함유하는 유기폐수 정화용 미생물 정화제의 제조방법.