KR101722167B1 - 신규한 균주 마리노모나스 악티카 ｐｔ－１ 및 그의 용도 - Google Patents

신규한 균주 마리노모나스 악티카 ｐｔ－１ 및 그의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 갯벌에서 분리된 신규한 균주 마리노모나스 악티카 PT-1(Marinomonas arctica PT-1), 상기 균주 또는 그의 배양산물을 포함하는 단백질 분해용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 단백질 분해용 키트 및 상기 조성물 또는 키트를 이용하여 단백질을 분해하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 신규한 마리노모나스 악티카 PT-1 균주를 이용하면 축산폐기물 또는 오염된 해수에 포함된 카제인, 젤라틴 등의 단백질성 물질을 분해할 수 있으므로, 단백질성 물질을 포함하는 축산폐기물 또는 오염된 해수의 정화에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

신규한 균주 마리노모나스 악티카 ＰＴ－１ 및 그의 용도{Novel Marinomonas arctica PT-1 and uses thereof}
본 발명은 신규한 균주 마리노모나스 악티카 PT-1 및 그의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 갯벌에서 분리된 신규한 균주 마리노모나스 악티카 PT-1(Marinomonas arctica PT-1), 상기 균주 또는 그의 배양산물을 포함하는 단백질 분해용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 단백질 분해용 키트 및 상기 조성물 또는 키트를 이용하여 단백질을 분해하는 방법에 관한 것이다.
국민소득의 증대는 사회구성원들의 생산 및 소비활동의 다양화, 고급화 및 대량화하게 하였으며, 특히 식생활문화의 변화를 통한 육류 소비는 크게 증가되었다. 이에 따라 돼지, 닭, 소 등을 포함하는 축산업은 그 수요 충족을 위해 사육 두수의 증가와 함께 대형화를 거듭해 왔다. 그러나, 이러한 경제의 발달은 쾌적하고 풍요로운 인간 생활의 구현을 위해 극복해야 할 생활환경의 오염문제를 심각하게 야기시키고 있다.
최근 집약적인 축산업의 발달로 국내에서 발생되는 축산폐기물의 연간 배출량은 약 4,500만톤 규모로서, 상기 축산폐기물은 축산농가에서 발생하는 가축분뇨 등의 축산폐기물 뿐만 아니라 축산농가에서 생산되는 원유를 가공하는 가공산업에서 발생하는 산업폐기물까지 포함하는데, 이들 축산폐기물의 일부는 비료자원으로서 재활용되지만, 이는 극히 일부에 불과하고, 대부분의 축산폐기물은 버려지고 있는 실정이다. 이처럼 버려지는 축산폐기물은 정화시설을 통해 정상적으로 처리되어야 하지만, 상기 처리비용으로 인한 생산성의 저하를 핑계로, 이들 축산폐기물의 상당부분은 무단으로 매립하거나 해양에 무단으로 투기되고 있는 실정이다. 이처럼 무단으로 매립 또는 투기되는 축산폐기물에는 통상적인 폐기물에 포함되는 중금속, 유기화합물 등의 오염물질 뿐만 아니라 유제품을 생산하는 특성상 우유로부터 유래된 단백질성 물질을 대량으로 포함하며, 이러한 오염물질에 의하여, 일차적으로는 토양 또는 해양을 오염시키고, 이차적으로는 상기 토양에서 생산되는 작물 또는 해양에서 성장하는 수산물의 내부에 오염물질이 축적되어, 최종적으로는 국민건강을 건강을 위협할 수도 있는 위험성이 날로 증가하고 있는 실정이다. 특히, 무단으로 투기된 축산폐기물로 인하여 발생되는 해양오염은 오염물질이 쉽고 빠르게 확산되기 때문에, 이미 발생된 해양오염을 감소시키는 방법을 개발하여야 할 필요성이 절실히 대두되었다.
해양에 투기된 축산폐기물 중에서, 기름으로 대변되는 지용성 오염물질은 해수의 표면에 막을 형성하여 산소의 유입을 봉쇄함으로써, 해양생물의 생존을 직접적으로 위협하고 있어, 이러한 지용성 오염물질을 제거하는 방법에 대한 연구가 매우 활발히 진행되고 있으며, 일부는 상용화되어 유조선의 사고로 인한 원유유출과 같은 해양사고의 후유증을 최소화하는데 사용되고 있다. 이와 같이, 오염의 발생여부가 육안으로도 확인되어 오염에 대하여 용이하게 인식될 수 있는 지용성 오염물질과는 달리, 단백질성 오염물질은 높은 수용성을 나타내기 때문에 해수에 존재할 경우에도 오염여부를 확인하는 것이 용이하지 않다는 문제점이 있다. 이들 단백질성 오염물질은 아미노기와 카르복실기를 내포하는 구조적인 특성상 다른 오염물질과 용이하게 결합하여 전혀 예상하지 못한 형태의 오염물질을 형성할 가능성이 있기 때문에, 그의 잠재적인 위험성은 막대하다고 평가되고 있으나, 이를 검출하거나 제거하는 방법은 전무한 실정이다.
이러한 축산폐기물로부터 유래된 단백질성 오염물질로 인한 오염을 제거하는 가장 좋은 방법은 정해진 절차에 따라, 모든 축산폐기물을 정화하는 것이지만, 이같은 정화에 소요되는 비용과 시간이 상당하여 영세한 수준의 축산농가에서는 현실적으로 적용하지 못하고 있다. 차선으로서, 해양에 투기되는 단백질성 오염물질을 정화할 수 있는 방법의 개발이 요구되고 있으나, 오염여부의 검출이 용이하지 않고, 오염물질의 확산속도가 빠른 해양오염의 특성상, 해양에 투기되는 단백질성 오염물질을 정화하기 위하여는 막대한 양의 해수를 대상으로 수행하여야만 하고, 상기 단백질성 오염물질을 축산폐기물에서 정화하는 방법과 오염된 해양에서 제거하는 방법이 서로 상이하여 2중으로 정화작업을 수행하여야만 하므로, 상기 단백질성 오염물질의 정화방법을 개발하더라도, 이를 실용화하기에는 막대한 비용이 소요될 것으로 예상되고 있어, 상기 단백질성 오염물질의 정화방법의 개발이 거의 진행되지 않고 있는 실정이다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 보다 경제적으로 단백질성 오염물질을 제거하는 방법을 개발하고자, 예의 연구노력한 결과, 해수에서 성장 및 증식하면서 외부로 단백질 분해효소를 분비할 수 있는 미생물을 사용할 경우, 축산폐기물에 포함된 단백질성 오염물질과 해수에 포함된 단백질성 오염물질을 모두 제거할 수 있으므로, 상기 미생물을 이용하면 막대한 양의 해수 뿐만 아니라 축산폐기물을 정화할 수 있어, 경제적으로 단백질성 오염물질을 제거할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 신규한 균주 마리노모나스 악티카 PT-1(Marinomonas arctica PT-1)를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 균주 또는 그의 배양산물을 포함하는 단백질 분해용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 단백질 분해용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물 또는 키트를 이용하여 단백질을 분해하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 오염된 해수를 정화하는 방법을 개발하기 위하여 다양한 연구를 수행하던 중, 해수에서 성장할 수 있으면서도 단백질 분해효소를 분비하여 해수에 존재하는 단백질성 오염물질을 제거할 수 있는 미생물에 주목하였다. 상기 미생물은 해수에서 성장 및 증식하면서 외부로 단백질 분해효소를 분비할 수 있고, 분비된 단백질 분해효소는 축산폐기물에 포함된 단백질성 오염물질과 해수에 포함된 단백질성 오염물질을 모두 제거할 수 있으므로, 상기 미생물을 이용하면 막대한 양의 오염된 해수 뿐만 아니라 축산폐기물을 정화할 수 있어, 경제적으로 단백질성 오염물질을 제거할 수 있을 것으로 예상하였는 바, 이에 적합한 미생물을 발굴하고자 하였다.
이를 위하여, 본 발명자들은 갯벌로부터 유래된 균주를 탈지 분유를 포함하는 배지에 배양하여, 상기 균주가 탈지 분유에 대한 분해활성을 나타냄을 확인하였다. 이에, 상기 탈지 분유에 포함된 성분 중에서 상기 균주에 의하여 분해되는 구체적인 성분을 확인하기 위하여, 상기 탈지 분유의 각 성분을 대상으로 상기 균주의 분해활성을 스크리닝한 결과, 탈지 분유에 포함된 카제인과 젤라틴이 상기 균주에 의하여 분해될 수 있음을 확인하였다. 또한, 젤라틴에 대하여도 분해활성을 나타냄을 확인하였다. 이러한 단백질 분해활성을 나타내는 균주가 종래에 알려진 균주인지를 확인하기 위하여, 상기 균주로부터 수득한 16S RNA의 서열을 분석한 결과, 종래에 보고되지 않은 신규한 균주임을 확인하고, 상기 균주의 특성을 분석한 결과, 2.5 내지 5%(w/v)의 KCl 또는 NaCl을 포함하고, 탄소원으로서 갈락토스, 만노스, 자일로스 또는 글루코사민을 포함하는 배지를 사용하여 30 내지 40℃의 통기성 조건하에서 배양할 경우, 성장율을 현저하게 증가시킬 수 있음을 확인하였다. 또한, 상기 균주에서 생산되는 단백질 분해효소는 카제인과 젤라틴에 대한 분해활성을 나타내고, 해수조건하에서 동일한 기질을 사용할 경우에도 시간의 경과에 따라, 생성되는 분해산물이 변화되며, 기질이 상이할 경우에는 동일한 조건에서 배양하더라도 생성되는 분해산물이 상이하다는 특징을 나타냄을 확인하였다.
이에, 본 발명자들은 상기 균주를 "마리노모나스 악티카 PT-1(Marinomonas arctica PT-1)"이라 명명하고, 이를 2013년 8월 8일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하여 기탁번호 KCTC 12465BP를 부여받았다.
상기 본 발명의 균주는 해수조건하에도 카제인 또는 젤라틴에 대한 분해활성을 나타내는 단백질 분해효소를 생산할 수 있으므로, 축산폐기물에 포함된 단백질성 물질을 정화하는데 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 상기 단백질성 물질에 의해 오염된 해수를 정화하는데 사용될 수 있을 것이다.
상기 본 발명의 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 신규한 균주 마리노모나스 악티카 PT-1(Marinomonas arctica PT-1)(KCTC 12465BP)를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 갯벌로부터 유래된 균주가 탈지 분유에 대한 분해활성을 나타내므로, 탈지분유에 포함된 성분 중에서 상기 균주에 의하여 분해되는 구체적인 성분을 확인한 결과, 탈지분유에 포함된 카제인과 젤라틴이 상기 균주에 의하여 분해될 수 있음을 확인하였다(도 1). 또한, 상기 균주의 형태를 투과전자현미경으로 관찰한 결과, 하나의 긴 편모를 갖는 단극모 형태의 균주임을 확인할 수 있었고(도 2), 이의 16S RNA 분석을 수행한 결과, Marinomonas 속 균주 중에서 Marinomonas foliarum 균주와 98.08% 의 상동성을 나타내고, 이외에도 M. pontica, M. rhizomae, M. alcarazii, M. primoryensis, M. arenicola, M. pollencensis, M. posidonica 균주와 97% 이상의 상동성을 나타냄을 확인하여, 상기 균주는 Marinomonas 속에 속하는 신규한 균주임을 알 수 있었다(도 3). 이에, 상기 균주를 "마리노모나스 악티카 PT-1(Marinomonas arctica PT-1)"이라 명명하고, 이를 2013년 8월 8일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하여 기탁번호 KCTC 12465BP를 부여받았다.
아울러, 상기 균주의 특성을 분석한 결과, 2.5 내지 5%(w/v)의 KCl 또는 NaCl을 포함하는 배지에서 배양할 경우, 성장율을 현저하게 증가시킬 수 있고(도 4 및 5), 30 내지 40℃의 통기성 조건하에서 배양할 경우, 성장율을 현저하게 증가시킬 수 있으며(도 6), 탄소원으로서 갈락토스, 만노스, 자일로스 또는 글루코사민을 포함하는 배지를 사용하여 배양할 경우, 성장율을 현저하게 증가시킬 수 있음을 확인하였다(도 7).
상기 본 발명의 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 균주 또는 그의 배양산물을 포함하는 단백질 분해용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 제공하는 마리노모나스 악티카 PT-1 균주는 카제인, 젤라틴 등의 단백질을 분해할 수 있으므로, 상기 조성물에 포함된 마리노모나스 악티카 PT-1 균주의 배양산물은 단백질 분해활성을 나타내는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 상기 균주의 배양물, 배양상등액, 파쇄물, 이들의 분획물 등이 될 수 있다. 이때, 상기 배양상등액은 마리노모나스 악티카 PT-1 균주의 배양물을 원심분리하여 수득할 수 있고, 상기 파쇄물은 마리노모나스 악티카 PT-1 균주를 물리적으로 또는 초음파처리하여 수득할 수 있으며, 상기 분획물은 상기 배양물, 배양상등액, 파쇄물 등을 원심분리, 크로마토그래피 등의 방법에 적용하여 수득할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 마리노모나스 악티카 PT-1 균주를 기질로서 탈지분유 또는 카제인을 포함하는 해수배지에서 3 내지 7일동안 배양한 결과, 탈지분유 또는 카제인의 분해산물을 생성할 수 있었다(도 8).
상기 본 발명의 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 단백질 분해용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 상기 조성물을 포함하여 단백질을 분해하는데 사용될 수 있는데, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 반응에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있고, 바람직하게는 상기 조성물에 포함된 마리노모나스 악티카 PT-1 균주 배양용 배지, 단백질 분해반응에 사용되는 완충액, 상기 분해반응을 수행하기 위한 반응용기, 상기 분해반응을 수행하기 위한 온도조절기, 상기 분해반응을 수행하기 위한 타이머 등을 포함할 수 있다.
구체적인 일례로서, 본 발명의 단백질 분해용 키트는 마리노모나스 악티카 PT-1 균주, 상기 균주 배양용 배지, 단백질 분해반응에 사용되는 완충액(pH 6.0) 및 단백질 분해반응에 사용되는 항온 반응용기를 포함할 수 있다.
상기 본 발명의 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 조성물 또는 키트를 이용하여 단백질을 분해하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명의 단백질 분해방법은 분해대상인 단백질을 포함하는 시료를 마리노모나스 악티카 PT-1 균주, 그의 배양산물, 상기 조성물 또는 상기 키트와 반응시켜서, 상기 시료에 포함된 단백질을 분해하는 단계를 포함한다. 이때, 상기 마리노모나스 악티카 PT-1 균주의 배양산물은 상기 균주의 배양물, 배양상등액, 상기 균주의 파쇄물, 상기 파쇄물의 분획물 등이 될 수 있고; 상기 반응온도는 바람직하게는 30 내지 40℃, 보다 바람직하게는 35 내지 40℃, 가장 바람직하게는 37℃가 될 수 있고; 상기 반응시간은 바람직하게는 1 내지 48시간, 보다 바람직하게는 12 내지 36시간, 가장 바람직하게는 24시간이 될 수 있으며; 상기 반응의 pH 조건은 바람직하게는 pH 4.0 내지 10.0, 보다 바람직하게는 pH 8.0 내지 9.0, 가장 바람직하게는 pH 8.5가 될 수 있다.
상기 본 발명의 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 균주 또는 그의 배양산물을 포함하는 정화용 조성물 또는 상기 조성물을 이용하여 오염된 해수를 정화하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명의 오염된 해수의 정화방법은 단백질성 오염물질을 포함하는 해수시료를 마리노모나스 악티카 PT-1 균주, 그의 배양산물 또는 상기 조성물과 반응시켜서, 상기 해수시료에 포함된 단백질을 분해하여 상기 해수를 정화하는 단계를 포함한다. 이때, 마리노모나스 악티카 PT-1 균주의 배양산물, 온도조건, pH 조건, 시간조건 등은 상술한 바와 동일하다.
본 발명의 마리노모나스 악티카 PT-1 균주는 해수를 포함하는 배지에서도 단백질을 분해할 수 있으므로, 단백질성 물질로 오염된 해수에서 단백질성 물질을 분해하여 오염된 해수를 정화하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 용어 "단백질성 물질"이란, "단백질성 오염물질"이라고도 하고, 단백질로부터 유래되어 해수를 오염시킴으로써, 해양생태계를 교란시킬 수 있는 오염원인으로 사용되는 물질을 의미한다. 상기 단백질성 물질은 특별히 이에 제한되지 않으나, 단백질, 펩타이드 등의 성분을 포함하고 해양생태계를 교란시킬 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 스테로이드유도체, 페놀유도체 등의 지질과 단백질이 결합되어 해수표면에 막을 형성할 수 있는 지질단백질, 미생물 또는 해양생물로부터 분비되어 다른 해양생물에 유독성을 나타내는 독성단백질, 산소에 의해 변성되어 해수내의 산소의 함량을 저하시킬 수 있는 산화단백질 등이 될 수 있다.
상기 본 발명의 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 정화용 조성물을 이용하여 폐기물을 정화하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명의 폐기물을 정화하는 방법은 단백질성 오염물질을 포함하는 폐기물을 상기 마리노모나스 악티카 PT-1 균주, 그의 배양산물 또는 상기 조성물과 반응시켜서, 상기 폐기물에 포함된 단백질을 분해하여 상기 폐기물을 정화하는 단계를 포함한다. 이때, 마리노모나스 악티카 PT-1 균주의 배양산물, 온도조건, pH 조건, 시간조건 등은 상술한 바와 동일하다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 마리노모나스 악티카 PT-1 균주는 우유로부터 유래된 카제인, 젤라틴 등의 단백질을 분해할 수 있으므로, 단백질성 오염물질을 포함하는 폐기물에서 카제인, 젤라틴 등의 단백질을 분해하여 폐기물을 정화하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 용어 "폐기물"이란, 생활 또는 산업적인 측면에서 더 이상 사용될 수 없는 물질을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 폐기물은 카제인, 젤라틴 등의 우유로부터 유래된 단백질을 포함하여, 마리노모나스 악티카 PT-1 균주에 의해 분해될 수 있는 폐기물로 이해될 수 있는데, 바람직하게는 축산농가로부터 배출되어 우유성분을 포함하는 축산 폐기물이 될 수 있고, 보다 바람직하게는 축산농가로부터 배출되는 폐우유, 산폐유 등이 될 수 있다.
본 발명의 신규한 마리노모나스 악티카 PT-1 균주를 이용하면 축산폐기물 또는 오염된 해수에 포함된 카제인, 젤라틴 등의 단백질성 물질을 분해할 수 있으므로, 단백질성 물질을 포함하는 축산폐기물 또는 오염된 해수의 정화에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명의 균주를 탈지분유, 카제인 또는 젤라틴을 기질로서 포함하는 고체배지에서 배양한 결과를 나타내는 사진이다.
도 2는 본 발명의 균주를 투과전자현미경으로 관찰한 결과를 나타내는 사진이다.
도 3은 본 발명의 균주의 16S RNA의 염기서열을 이용한 계통수 분석결과를 나타내는 개략도이다.
도 4는 배지에 포함된 KCl의 농도에 따른 본 발명의 균주의 성장율을 나타내는 그래프이다.
도 5는 배지에 포함된 NaCl의 농도에 따른 본 발명의 균주의 성장율을 나타내는 그래프이다.
도 6은 배양온도 및 대기조건에 따른 본 발명의 균주의 성장율을 나타내는 그래프이다.
도 7은 탄소원의 종류에 따른 본 발명의 균주의 성장율을 나타내는 그래프이다.
도 8은 본 발명의 균주에 의해 분해된 카제인의 분해산물을 FPLC를 사용하여 분석한 결과를 나타내는 분석 프로필로서, (a)는 표준마커의 FPLC 분석 프로필을 나타내고(1 콘알부민 75kDa, 2 오브알부민 43kDa, 3 탄산무수화효소 29kDa, 4 리보뉴클레아제 13.7kDa, 5 아프로티닌 6.5kDa, 6 블루덱스트란 2kDa), (b)는 카제인을 포함하는 인공해수배지에서 3일동안 배양한 후 생성된 분해산물의 FPLC 분석 프로필을 나타내며, (c)는 카제인을 포함하는 해수배지에서 7일동안 배양한 후 생성된 분해산물의 FPLC 분석 프로필을 나타내고, (d)는 카제인을 포함하는 인공해수배지에서 7일동안 배양한 후 생성된 분해산물의 FPLC 분석 프로필을 나타내며, (e)는 탈지분유를 포함하는 인공해수배지의 FPLC 분석 프로필을 나타낸다.
도 9는 본 발명의 균주에 의해 나타나는 단백질 분해효소의 반응속도를 탈지분유를 기질로서 사용하여 측정하고, 이를 Woolf-Augustinsson-Hofstee plot으로 표시한 결과를 나타내는 그래프이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 균주의 분리
갯벌에서 채취한 시료를 해수를 포함하는 해수고체배지(pH 8.5)에 도말하고 55℃에서 배양하여 콜로니를 생성하고, 상기 생성된 각각의 콜로니를 0.5 내지 2%의 탈지분유를 포함하는 해수고체배지(pH 8.5)에 각각 접종하고 55℃에서 배양하여, 배지중의 탈지분유를 분해하여 배지에 투명환을 형성하는 균주를 선별하였다. 이때, 상기 해수고체배지는 해수에 bactoagar 0.8 내지 1.5%를 가하고, 121℃에서 20분간 가열하여 멸균시킨 다음, 이를 냉각시켜서 제조하였다.
상기 선별된 균주를 각각 0.5 내지 2%의 탈지분유, 카제인 및 젤라틴을 모두 포함하는 해수고체배지(pH 8.5)에 접종하여 55℃에서 3일 동안 1차 배양하여 투명환을 형성하는 균주를 재선별하고, 상기 재선별된 균주를 각각 0.5 내지 2%의 탈지분유, 카제인 또는 젤라틴을 포함하는 각각의 해수고체배지(pH 8.5)에 접종하여 55℃에서 하룻밤 동안 2차 배양한 다음, 각 배지에서 투명환의 형성여부를 확인하였다(도 1). 그 결과, 도 1에서 보듯이, 본 발명의 균주는 짧은 배양시간 동안 탈지분유를 충분히 분해하지 못하였으나, 카제인과 젤라틴은 충분히 분해하는 활성을 나타냄을 알 수 있었다.
다만, 계대배양을 통해 탈지분유 함유 고체배지에서는 12 내지 24시간 내에 투명환이 발생함이 관찰되었으므로, 이로부터 액체배지와 고체배지에 배양하는 조건에 따라 활성의 차이가 있음을 알 수 있었다.
실시예 2: 균주의 동정
상기 실시예 1에서 최종 선별한 균주를 투과전자현미경(Transmission Electron Microscope, TEM, 서울대학교 농생명과학공동기기원 소재, 80kv)에 적용하여 형태적인 특징을 관찰하였다(도 2). 도 2에서 보듯이, 상기 균주는 하나의 긴 편모를 갖는 단극모 형태의 균주임을 확인하였다.
아울러, 상기 균주로부터 16S RNA를 추출하고, 이의 염기서열을 결정한 결과 939bp의 16S RNA의 염기서열을 확인하였으며, 상기 16S RNA의 염기서열을 이용한 계통수 분석을 수행하였다(도 3). 그 결과, 도 3에서 보듯이, 본 발명의 균주는 Marinomonas 속에 속하는 세균으로 판단되었다. 구체적으로, 현재 22종 (2013년 3월 기준)이 존재하는 Marinomonas 속 균주 중에서 Marinomonas foliarum 균주와 98.08% 의 상동성을 나타내고, 이외에도 M. pontica, M. rhizomae, M. alcarazii, M. primoryensis, M. arenicola, M. pollencensis, M. posidonica 균주와 97% 이상의 상동성을 나타냄을 확인하였으므로, 본 발명의 균주는 Marinomonas 속에 속하는 신규한 균주임을 알 수 있었다.
이에, 본 발명자들은 상기 균주를 "마리노모나스 악티카 PT-1(Marinomonas arctica PT-1)"이라 명명하고, 이를 2013년 8월 8일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하여 기탁번호 KCTC 12465BP를 부여받았다.
실시예 3: 균주의 특성분석
상기 실시예 2에서 기탁한 마리노모나스 악티카 PT-1 균주의 특성을 다음과 같이 분석하였다.
실시예 3-1: 배지 중 염농도
해수에 0.05%(w/v) 트립톤, 0.05%(w/v) MgSO4, 0.05%(w/v) 효모추출물 및 0.05%(w/v) dibasic sodium phosphate를 가하고, 이에 포함된 KCl의 농도를 0, 2.5, 5, 10 또는 20%(w/v)로 적정한 각 해수배지를 제조하였다. 상기 제조된 각 해수배지에 마리노모나스 악티카 PT-1를 접종한 다음 24시간 동안 배양하여, KCl의 농도에 따른 마리노모나스 악티카 PT-1의 성장율을 비교하였다(도 4). 그 결과, 도 4에서 보듯이, 2.5%(w/v)의 KCl을 포함하는 배지에서 마리노모나스 악티카 PT-1의 성장율이 최대값을 나타냄을 확인하였다.
또한, KCl 대신에 NaCl을 사용하는 것을 제외하고는, 상술한 것과 동일한 방법으로 NaCl의 농도에 따른 마리노모나스 악티카 PT-1의 성장율을 비교하였다(도 5). 그 결과, 도 5에서 보듯이, 2.5 내지 5%(w/v)의 NaCl을 포함하는 배지에서 마리노모나스 악티카 PT-1의 성장율이 최대값을 나타냄을 확인하였다.
실시예 3-2: 배양온도
상기 실시예 3-1의 결과에 따라, 해수에 0.05%(w/v) 트립톤, 0.05%(w/v) MgSO4, 0.05%(w/v) 효모추출물 및 0.05%(w/v) dibasic sodium phosphate를 가하고 KCL의 농도가 2.5%(w/v)가 되도록 적정하여 제조한 해수배지에 마리노모나스 악티카 PT-1를 접종하고 4℃, 실온, 37℃ 배양기, 37℃ 및 5% CO2 배양기, 45℃ 및 60℃의 조건에서 각각 24시간 동안 배양하고, 마리노모나스 악티카 PT-1의 성장율을 비교하였다(도 6). 그 결과, 도 6에서 보듯이, 37℃ 및 5% CO2 배양기에서 배양된 균주가 가장 우수한 성장율을 나타내었으므로, 본 발명의 균주는 30 내지 40℃의 통기성 조건하에서 배양함이 바람직함을 알 수 있었다.
실시예 3-3: 탄소원
해수에 0.05%(w/v) 트립톤, 0.05%(w/v) MgSO4, 0.05%(w/v) 효모추출물 및 0.05%(w/v) dibasic sodium phosphate를 가하고 KCL의 농도가 2.5%(w/v)가 되도록 적정한 다음, 다양한 탄소원(글루코스, 갈락토스, 만노스, 자일로스, 프럭토스, 글루코사민, 갈락토사민, 만노사민, 아세틸글루코사민, 아세틸만노사민, 수크로스, 락토스, 말토스, B(6.5kDa의 키토산) 또는 S(3kDa의 키토산))을 0.5%(w/v)가 되도록 가하여 제조한 해수배지에 마리노모나스 악티카 PT-1를 접종하고 37℃ 및 5% CO2 배양기에서 배양하여, 마리노모나스 악티카 PT-1의 성장율을 비교하였다(도 7). 그 결과, 도 7에서 보듯이, 탄소원으로서, 갈락토스, 만노스, 자일로스 및 글루코사민을 포함하는 배지에서 배양된 균주가 우수한 성장율을 나타냄을 확인하였다.
실시예 3-4: 단백질 분해효소
0.2㎛의 필터로 여과한 해수로 구성된 해수배지 또는 인공해수배지(24.7g/ℓNaCl, 6.6g/ℓ KCl, 4.7g/ℓ MgCl2·H2O, 8.48g/ℓ MgCl2·6H2O, 1.9g/ℓ CaCl2·2H2O, 6.3g/ℓ MgSO4·7H2O, 3.07g/ℓ MgSO4 및 0.18g/ℓ NAHCO3)에 1%(w/v) 카제인 또는 탈지분유를 가하여 4종의 시료배지를 제조하였다. 이어, 상기 제조된 각 시료배지에 마리노모나스 악티카 PT-1를 접종하고 37℃ 및 5% CO2 배양기에서 3일 또는 7일 동안 배양하였으며, 배양이 종료된 후, 배지에 포함된 단백질 분해효소 및 카제인의 분해산물을 FPLC를 이용하여 분석하였다(FPLC 장비: Waters486, Millipore TM 600 controller, Millipore TM 626 pump, Waters 486 (Millipore) UV 검출기(280 nm); 컬럼: Superdex 75 10/300 GL column chromatography, 25ml; 용출액: 10 mM 인산완충액(pH 7.0), 10 mM NaCl; 유속: 1.0 ml/min; 분석시간: 30-120분)(도 8). 그 결과, 상기 도 8의 (b) 및 (d)에서 보듯이, 동일한 기질과 배지를 사용할 경우에도 배양시간의 경과에 따라, 생성되는 분해산물이 변화되고; 도 8의 (c) 및 (d)에서 보듯이, 배지에 따른 차이는 나타나지 않음을 알 수 있었다.
실시예 4: 단백질 분해효소의 활성 분석
상기 균주로부터 발현되는 단백질 분해효소의 활성을 분석하였다.
실시예 4-1: 기질 특이성
단백질 분해효소의 활성은 기질로서 탈지분유, 카제인 또는 젤라틴을 사용하여 측정하였다. 구체적으로, 25 mM Tris·HCl 완충액(pH 8.5) 1ml, 효소용액 0.05ml 및 기질 10mg을 포함하는 반응혼합물을 150rpm으로 교반하면서 37℃에서 30분동안 반응을 수행하였다. 상기 반응혼합물에 10%(w/v) TCA 0.5 mL을 가하여 반응을 종료시키고, 이를 30분 동안 얼음에서 보관하였다. 그런 다음, 상기 반응혼합물을 13,000 rpm으로 10분동안 원심분리하고, 상층액의 흡광도를 280 nm에서 측정하였다. 이때, 대조군은 반응전에 TCA를 반응혼합물에 가한 것을 사용하고, 단백질 분해효소의 활성단위 1U는 반응표준조건하에서 280nm에서 0.1의 흡광도가 증가하는 양으로 정의하였다(표 1).
단백질 분해효소의 기질 특이성
기질 특이활성(U/㎍)
아조카제인 0.56 x 10-5 ± 0.8 x 10-7
카제인 0.12 x 10-5 ± 0.8 x 10-7
탈지분유 0.44 x 10-4 ± 0.6 x 10-7
젤라틴 0.77 x 10-3 ± 0.9 x 10-7
실시예 4-2: 효소반응 속도
상기 실시예 4-1의 방법을 이용하여, 기질로서 탈지분유를 사용한 경우 효소의 반응속도를 측정하고, 이를 초기반응속도에 대한 기질의 농도에 대한 효소의 반응속도간의 상관성을 Woolf-Augustinsson-Hofstee plot으로 표시하였다(도 9).
실시예 4-3: 효소활성 억제제의 효과
상기 균주로부터 발현되는 단백질 분해효소의 활성에 있어서, 다양한 금속이온 또는 효소반응 억제제가 어떠한 영향을 나타내는지를 확인하고자 하였다.
구체적으로, 25 mM Tris·HCl 완충액(pH 8.5) 1ml, 효소용액 0.05ml 및 기질(탈지분유 또는 젤라틴) 10mg을 포함하는 반응혼합물에 1mM의 금속이온(NaCl, KCl, CaCl2, MnCl2, MgCl2 또는 ZnSO4) 또는 효소반응 억제제(EDTA 5mM, SDS 0.1%(w/v), SDS 0.5%(w/v), Triton-X 0.1%(v/v), Triton-X 0.5%(v/v), DMSO 1%(v/v) 또는 DMSO 5%(v/v))를 가하고, 150rpm으로 교반하면서 37℃에서 30분동안 반응을 수행하였다. 상기 반응혼합물에 10%(w/v) TCA 0.5 mL을 가하여 반응을 종료시키고, 이를 30분 동안 얼음에서 보관하였다. 그런 다음, 상기 반응혼합물을 13,000 rpm으로 10분동안 원심분리하고, 상층액의 흡광도를 280 nm에서 측정하였다. 이때, 대조군은 금속이온 또는 효소반응 억제제를 처리하지 않은 반응물을 사용하고, 단백질 분해효소의 활성단위 1U는 반응표준조건하에서 280nm에서 0.1의 흡광도가 증가하는 양으로 정의하였다(표 2).
단백질 분해활성에 대한 금속이온 및 효소반응 억제제의 효과
처리물질
 처리농도
(mM 또는 %)		 상대적 활성도(%)
탈지분유 젤라틴
대조군 - 100 100
금속이온
NaCl 1 98.8 103.3
KCl 1 95.5 102.4
CaCl2 1 97.5 100
MnCl2 1 33.3 98.4
MgCl2 1 97.7 97.3
ZnSO4 1 95.3 98.2
억제제
EDTA 5 3.6 97.7
SDS 0.1%(w/v) 70.6 129.6
SDS 0.5%(w/v) 17.7 193.2
Triton-X 0.1%(v/v) 105.5 66.7
Triton-X 0.5%(v/v) 104.9 69.5
DMSO 1%(v/v) 83.9 67.0
DMSO 5%(v/v) 72.1 74.2
상기 표 2에서 보듯이, MnCl2를 제외한 대부분의 금속이온은 본 발명의 균주로부터 발현되는 단백질 분해효소의 활성에 별다른 영향을 나타내지 않았으나, 일부 효소반응 억제제는 상기 단백질 분해효소의 활성을 억제하는 효과를 나타내었다. 또한, 상기 MnCl2 및 효소반응 억제제의 효과는 기질에 따라 상이함을 알 수 있었다.
구체적으로, MnCl2 또는 EDTA를 처리한 경우, 탈지분유를 기질로 사용한 효소반응을 현저하게 억제하였으나, 젤라틴을 기질로 사용한 효소반응에는 미세한 억제효과를 나타내었고; SDS를 처리한 경우, 탈지분유를 기질로 사용한 효소반응을 현저하게 억제하였으나, 젤라틴을 기질로 사용한 효소반응은 오히려 증가시키는 효과를 나타내었으며; Triton-X를 처리한 경우, 탈지분유를 기질로 사용한 효소반응을 증가시켰으나, 젤라틴을 기질로 사용한 효소반응은 현저하게 억제시키는 효과를 나타내었고; DMSO를 처리한 경우, 탈지분유를 기질로 사용한 효소반응과 젤라틴을 기질로 사용한 효소반응을 모두 일정수준 억제하는 효과를 나타내었다.
이같은 결과는, 본 발명의 균주로부터 발현되는 탈지분유를 기질로 사용하는 단백질 분해효소와 젤라틴을 기질로 사용하는 단백질 분해효소는 서로 상이하다는 점과 본 발명의 균주는 적어도 2종 이상의 단백질 분해효소를 발현한다는 점을 시사하는 것으로 분석되었다.
한국생명공학연구원 생물자원센터 KCTC12465BP 20130808

Claims (9)

  1. 마리노모나스 악티카 PT-1(Marinomonas arctica PT-1) 균주(KCTC 12465BP).
  2. 제1항의 마리노모나스 악티카 PT-1 균주 또는 그의 배양산물을 포함하는 카제인 또는 젤라틴 분해용 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 배양산물은 마리노모나스 악티카 PT-1의 배양물, 배양상등액, 파쇄물 및 이들의 분획물로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  4. 제2항에 있어서,
    카제인 또는 젤라틴을 포함하는 축산폐기물 또는 오염된 해수의 정화에 사용되는 것인 조성물.
  5. 제2항의 조성물을 포함하는 카제인 또는 젤라틴 분해용 키트.
  6. 제5항에 있어서,
    마리노모나스 악티카 PT-1 균주 배양용 배지, 카제인 또는 젤라틴 분해반응에 사용되는 완충액, 상기 분해반응을 수행하기 위한 반응용기, 상기 분해반응을 수행하기 위한 온도조절기, 상기 분해반응을 수행하기 위한 타이머 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 구성요소를 포함하는 것인 키트.
  7. 카제인 또는 젤라틴을 포함하는 시료를 제1항의 마리노모나스 악티카 PT-1 균주, 그의 배양산물, 제2항의 조성물 또는 제5항의 키트와 반응시켜서, 상기 시료에 포함된 카제인 또는 젤라틴을 분해하는 단계를 포함하는 카제인 또는 젤라틴 분해방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 시료는 카제인 또는 젤라틴을 포함하는 축산폐기물 또는 오염된 해수인 것인 방법.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 카제인 또는 젤라틴을 분해하는 단계는 30 내지 40℃ 및 pH 4.0 내지 10.0의 조건에서 수행되는 것인 방법.

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