CN102352326B - 一种利用气单胞菌去除水华蓝藻的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用气单胞菌去除水华蓝藻的方法，所述气单胞菌Aeromonas sp.DS-1菌株，保藏编号为CCTCC No:M 2011180，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2011年5月23日。取Aeromonas sp.DS-1菌体细胞加入到含106-107个细胞/ml蓝藻的水样中，在温度为20℃-35℃、pH值为6-7.5条件下，混匀后静置，处理4-10天，对目前危害较大的三类代表性蓝藻铜绿微囊藻、鱼腥藻、节球藻均有明显彻底的去除效果，可应用于实际水体蓝藻水华的控制。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用气单胞菌去除水华蓝藻的方法，尤其涉及一种利用细菌降解铜绿微囊藻的方法，属于环保技术领域。
背景技术
近年来，我国国内淡水水体富营养化现象严重，水华现象频发，严重影响了水体水质，也危害了我国城乡居民的身体健康。在我国大多数发生水华的水体中，主要优势藻种为蓝藻，其中以铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)较常见。水体中藻类的去除方法一般包括物理法、化学法与生物法三大类。物理法主要包括机械除藻、气浮除藻、过滤除藻和活性炭吸附除藻等；化学法主要指投加某些化学药剂，破坏某些藻类的细胞壁、细胞膜及细胞内含物而使其灭活甚至解体，从而可杀灭活体藻细胞。物理法与化学法因其水处理成本较高、容易产生有毒副产物导致水体二次污染等原因限制了它们在实际应用中的广泛性。与物理法、化学法相比，对环境友好的生物控藻法受到越来越多的关注。生物控藻技术包括水中鱼类及浮游动物对藻类的捕食、水生植物的化感作用以及微生物溶藻等。其中微生物由于来源广泛、易于繁殖等特点，使得微生物控藻具有较高的应用潜力。溶藻微生物主要包括细菌(溶藻细菌)、病毒(噬藻体)、原生动物、真菌和放线菌等，其中研究较多的是溶藻细菌(Algae-lysingbacteria)，溶藻细菌是指一类以直接或间接方式抑制藻类生长，或杀死藻类、溶解藻细胞的细菌。目前，关于溶藻细菌的研究主要停留在实验室阶段，对于实际应用中有关应对藻污染的属、种、株多样性问题，水华爆发时高密度藻污染问题，投放溶藻菌是否带来二次污染问题少有涉及，因而离实际应用尚有距离，目前未见有关报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种利用细菌去除以铜绿微囊藻为代表的水华蓝藻的方法，以解决目前国内淡水水体富营养化带来的蓝藻水华的危害。
术语说明：
水华蓝藻：是指产生水华的一类蓝藻，主要包括铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)、鱼腥藻(Anabaena)、节球藻(Nodularia)等。
蓝藻水华：是指富营养化的淡水水体中上述蓝藻大量繁殖的现象，也称水华。
本发明是从天然淡水水体中筛选并获得一株对铜绿微囊藻、鱼腥藻、节球藻等水华蓝藻具有溶藻效果的细菌Aeromonas sp.DS-1菌株，在温度为20-35℃、pH为6.0-7.5的条件下，该菌株对106-107细胞/mL高密度水华蓝藻，包括铜绿微囊藻、鱼腥藻、节球藻，有较高的去除能力。
本发明的技术方案如下：
一种气单胞菌Aeromonas sp.DS-1菌株，保藏编号为CCTCC No：M2011180，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2011年5月23日。
一种气单胞菌Aeromonas sp.DS-1菌株的筛选方法，步骤如下：
从池塘或湖泊天然淡水水体取水样，采用牛肉膏蛋白胨细菌培养基富集培养，通过平板涂布或平板划线分离，纯化，然后筛选具有高效溶藻活性的菌株；
筛选方法为：取纯化的菌单菌落2环与5mL浓度为106细胞/mL水华蓝藻藻液混合，25℃培养5后，测定藻密度减小率，其中使藻密度减小率最高的为筛选出的高效溶藻菌株，编号为DS-1；将该菌株液体培养物中加入20wt％的甘油，-20℃以下长期保存。经鉴定，该菌株为气单胞菌Aeromonas sp.，命名为Aeromonas sp.DS-1。
该菌株为好氧菌，革兰氏染色阴性，杆菌，大小为0.3-0.5×1.2-2μm，极生鞭毛，丁二醇脱氢酶反应阴性，V.P(产乙酰甲基甲醇)阴性，氧化酶阳性，产吲哚试验阴性，明胶液化实验阳性，不能利用葡萄糖或甘油产气，可利用蔗糖、阿拉伯糖、半乳糖或甘露醇产气，赖氨酸脱羧酶反应阴性；能够在以精氨酸、组氨酸、谷氨酸、丝氨酸、丙氨酸或天门冬氨酸作为唯一碳源的无机盐培养基上生长。
本发明Aeromonas sp.DS-1菌株的16S rRNA基因扩增：
使用引物27F：5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’、1492R：5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’从Aeromonas sp.DS-1菌株的基因组DNA中扩增得到其16S rRNA基因序列1449bp片段，经DNA测序分析，得到该菌株的16S rRNA基因序列为SEQ.ID.No.1。
一种利用气单胞菌去除水华蓝藻的方法，步骤如下：
(1)将Aeromonas sp.DS-1菌株活化，将所得的培养液涂布于平板，在30℃下静置培养45-50h，将平板上长出的菌苔刮下，得菌体细胞；
(2)取步骤(1)的菌体细胞加入到含106-107个细胞/ml蓝藻的水样中，菌体细胞加量为20-100mg/100ml，在温度为20℃-35℃、pH值为6-7.5条件下，混匀后静置，处理4-10天对铜绿微囊藻的去除效率达100％，处理7-10天对鱼腥藻和节球藻去除效率达100％。
所述水样中的蓝藻是铜绿微囊藻、鱼腥藻、节球藻之一或混合。当三种藻同时存在时适宜的浓度比为铜绿微囊藻∶鱼腥藻∶节球藻为(3-10)∶2∶(0.5-1)。特别优选的，所述水样中的蓝藻是铜绿微囊藻。
按本领域常规，所述菌体细胞加量均以湿重计，本发明中全部做此同样的解释。
所述步骤(2)的菌体细胞加量优选如下：
a.含106个细胞/ml蓝藻的水样菌体细胞加量为25-70mg/100ml，以菌体细胞湿重计；
b.含107个细胞/ml蓝藻的水样菌体细胞加量为80-100mg/100ml，以菌体细胞湿重计。
所述步骤(2)的处理条件优选为温度为30℃、pH值6.5。
根据本发明上述去除水华蓝藻的方法，优选的，步骤如下：
步骤(1)是将Aeromonas sp.DS-1菌株活化后所得的培养液0.5mL涂布于9cm平板，固体培养基为牛肉膏蛋白胨培养基，牛肉膏蛋白胨固体培养基配方为：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，，琼脂15g，去离子水1000ml；在30℃下静置培养48h后，将菌苔刮下，得菌体细胞；
(2)取步骤(1)的菌体细胞加入到含1-6×106个细胞/ml蓝藻的水样中，水样中的蓝藻是铜绿微囊藻、鱼腥藻或节球藻；菌体细胞加量为湿重25-50mg/100ml，在温度为30℃、pH值为6.5条件下，混匀后静置，每天早晚再各混匀一次，处理4-6天对铜绿微囊藻的去除效率达100％，处理7-8天对鱼腥藻和节球藻去除效率达100％。
实验证明菌株Aeromonas sp.DS-1对铜绿微囊藻、鱼腥藻、节球藻均具有去除能力，随着时间延长去除效果增强，水样中蓝藻含量大时相应增大菌体细胞的加量。
对菌株Aeromonas sp.DS-1除藻机制研究，发现该菌制成悬液经0.22μm滤膜过滤除菌、滤液经蛋白酶K处理、滤液经高温处理均有除藻效果，证明该菌株通过分泌胞外分泌物除藻。经该菌株作用后的藻细胞可呈现细胞破裂、类囊体膜断裂、胞内物质流出等特征。
本发明的优良效果在于：
1、Aeromonas sp.DS-1溶藻菌的筛选方法是以池塘、湖泊等天然淡水水体为溶藻细菌分离来源，该筛选方法不强调分离溶藻细菌来源水体的富营养程度，尤其适用于在待处理的存在藻污染的原位水体采集水样，从而保证了筛选获取溶藻菌的普遍性，以及使用时的安全性。
2、实验证明培养液中所含某些营养物质本身抑制藻生长，会对除藻实验造成假阳性结果。本发明Aeromonas sp.DS-1溶藻菌的除藻方法，是采用固相发酵培养溶藻菌株，将菌株细胞投放于藻液中，避免了培养液中所含营养物质成分进入藻液，使得实验结果更加真实反映了除藻效果。避免在实际应用中造成新的污染。
3、本发明Aeromonas sp.DS-1溶藻菌对目前危害较大的三类代表性蓝藻：铜绿微囊藻、鱼腥藻、节球藻在高藻密度下有明显的去除效果，在一定时间内可达到彻底的去除效果，对于实际水体蓝藻水华的控制非常有应用价值。
附图说明
图1气单胞菌Aeromonas sp.DS-1去除铜绿微囊藻，空心图标代表接种气单胞菌后铜绿微囊藻的浓度，实心黑色图标代表不接种菌对照。横坐标是处理时间(单位：天)，纵坐标是铜绿微囊藻的浓度(单位：106细胞/ml)。其中，三角形空心图标的曲线对应于实施例1的处理条件，方形空心图标的曲线对应于实施例5的处理条件。
图2经气单胞菌Aeromonas sp.DS-1处理4天后的铜绿微囊藻细胞透射电镜照片，放大25000倍。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，但不限于此。实施例中蓝藻藻种是铜绿微囊藻FACHB927、鱼腥藻FACHB245、节球藻FACHB377(中国科学院典型培养物保藏委员会淡水藻种库，武汉珞珈山东湖南路7号)
实施例1、
一、菌株筛选：
本实施例是以济南市植物园人工池塘为溶藻细菌分离来源，经富集培养后，采用涂布及反复划线分离，得到多个菌株，分别扩大培养后，加入100ml含铜绿微囊藻(106细胞/ml)的水样中，温度为25℃，pH值为6.5，考察各菌株的溶藻效果，处理5天，测定藻密度减小率，其中使藻密度减小率最高的为筛选出的高效溶藻菌株DS-1。经生理生化及16S rRNA基因序列分析，鉴定该菌株为Aeromonas sp.，命名为Aeromonas sp.DS-1，将该菌株液体培养物中加入20％(w/w)甘油，-20℃以下长期保存。
细菌培养采用牛肉膏蛋白胨液体培养基，其配方为：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，去离子水1000ml，自然pH。牛肉膏蛋白胨固体培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂15g，去离子水1000ml，自然pH。
二、利用菌株Aeromonas sp.DS-1去除铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)
将菌株Aeromonas sp.DS-1接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基，在30℃，200rpm条件下培养16h后，取0.5mL培养液涂布于9cm平板，在30℃下静置培养48h后，将菌苔刮下，得菌体细胞。取约30mg菌体细胞(湿重)加入100ml含铜绿微囊藻(4.6×106细胞/ml)的水样中，温度为30℃，pH值为6.5，混匀后静置，每天早晚再各混匀一次，处理4天铜绿微囊藻去除效率可达到100％。如附图1中三角形空心图标的曲线所示。
实施例2、利用菌株Aeromonas sp.DS-1去除鱼腥藻(Anabaena flos-aquae)
将菌株Aeromonas sp.DS-1接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基，在30℃，200rpm条件下培养16h后，取0.5mL培养液涂布于9cm平板，在30℃下静置培养48h后，将菌苔刮下，27mg菌体细胞(湿重)加入100ml含鱼腥藻(5×106细胞/ml)的水样中，温度为30℃，pH值为6.5，混匀后静置，每天早晚再各混匀一次，处理7天鱼腥藻去除效率可达100％。
实施例3、利用菌株Aeromonas sp.DS-1去除节球藻(Nodularia spumigena)
将菌株Aeromonas sp.DS-1接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基，在30℃，200rpm条件下培养16h后，取0.5mL培养液涂布于9cm平板，在30℃下静置培养48h后，将菌苔刮下，33mg菌体细胞(湿重)加入100ml含节球藻(1.1×106细胞/ml)的水样中，温度为30℃，pH值为6.5，混匀后静置，每天早晚再各混匀一次，处理7天节球藻去除效率可达到100％。
实施例4、利用菌株Aeromonas sp.DS-1去除铜绿微囊藻(M.aeruginosa)
将菌株Aeromonas sp.DS-1接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基，在30℃，200rpm条件下培养16h后，取0.5mL培养液涂布于9cm平板，在30℃下静置培养48h后，将菌苔刮下，40mg菌体细胞(湿重)加入100ml含铜绿微囊藻(5×106细胞/ml)的水样中，温度为20℃，pH值为6.5，混匀后静置，每天早晚再各混匀一次，处理10天铜绿微囊藻去除效率可达到100％。
实施例5、利用菌株Aeromonas sp.DS-1去除铜绿微囊藻(M.aeruginosa)
将菌株Aeromonas sp.DS-1接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基，在30℃，200rpm条件下培养16h后，取培养液涂布于平板，每9cm平板需0.5mL培养液，在30℃下静置培养48h后，将菌苔刮下，约90mg菌体细胞(湿重)加入100ml含铜绿微囊藻(1.45×107细胞/ml)的水样中，温度为30℃，pH值为6.5，混匀后静置，每天早晚再各混匀一次，处理5天铜绿微囊藻去除效率可达到100％。如附图1中方形空心图标的曲线所示。
实施例6、利用菌株Aeromonas sp.DS-1去除铜绿微囊藻、鱼腥藻、节球藻
如实施例1所述，所不同的是，100ml水样中含铜绿微囊藻(5×106细胞/ml)、鱼腥藻(2×106细胞/ml)和节球藻(1×106细胞/ml)，加入Aeromonas sp.DS-1的菌体细胞(湿重)约80mg，温度为30℃，pH值为6.5，混匀后静置，每天早晚再各混匀一次，处理6天铜绿微囊藻去除效率可达到100％，处理7天鱼腥藻去除效率可达到100％，处理9天节球藻去除效率可达到100％。
Claims (9)
1.一种气单胞菌（Aeromonas sp.）DS-1菌株，保藏编号为CCTCC No:M2011180，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2011年5月23日。
2.权利要求1所述气单胞菌（Aeromonas sp.）DS-1菌株，其特征在于该菌株具有SEQ.ID.No.1所示的基因序列。
3.一种利用气单胞菌去除水华蓝藻的方法，步骤如下：
（1）将权利要求1所述Aeromonas sp.DS-1菌株活化，将所得的培养液涂布于平板，在30℃下静置培养45-50h，将平板上长出的菌苔刮下，得菌体细胞；
（2）取步骤（1）的菌体细胞加入到含106-107个细胞/ml蓝藻的水样中，菌体细胞加量为20-100mg/100ml，以菌体细胞湿重计，在温度为20℃-35℃、pH值为6-7.5条件下，混匀后静置，处理4-10天对铜绿微囊藻的去除效率达100%，处理7-10天对鱼腥藻和节球藻去除效率达100%。
4.如权利要求3所述利用气单胞菌去除水华蓝藻的方法，其特征在于所述水样中的蓝藻是铜绿微囊藻、鱼腥藻、节球藻之一或混合。
5.如权利要求3所述利用气单胞菌去除水华蓝藻的方法，其特征在于所述水样中的蓝藻是铜绿微囊藻。
6.如权利要求4所述利用气单胞菌去除水华蓝藻的方法，其特征在于当水样中铜绿微囊藻、鱼腥藻、节球藻三种藻同时存在时，浓度比为铜绿微囊藻：鱼腥藻：节球藻为（3-10）:2:（0.5-1）。
7.如权利要求3所述利用气单胞菌去除水华蓝藻的方法，其特征在于所述步骤（2）的菌体细胞加量如下：
a.含106个细胞/ml蓝藻的水样，菌体细胞加量为25-70mg/100ml，以菌体细胞湿重计；
b.含107个细胞/ml蓝藻的水样，菌体细胞加量为80-100mg/100ml，以菌体细胞湿重计。
8.如权利要求3所述利用气单胞菌去除水华蓝藻的方法，其特征在于所述步骤（2）的处理条件为温度30℃、pH值6.5。
9.如权利要求3所述利用气单胞菌去除水华蓝藻的方法，其特征在于步骤如下：
（1）将Aeromonas sp.DS-1菌株活化后接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基，牛肉膏蛋白胨固体培养基配方为：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂15g，去离子水1000ml；将所得的培养液0.5mL涂布于9cm平板，在30℃下静置培养48h后，将菌苔刮下，得菌体细胞；
（2）取步骤（1）的菌体细胞加入到含1-6×106个细胞/ml蓝藻的水样中，水样中的蓝藻是铜绿微囊藻、鱼腥藻或节球藻；菌体细胞加量为湿重25-50mg/100ml，在温度为30℃、pH值为6.5条件下，混匀后静置，每天早晚再各混匀一次，处理4-6天对铜绿微囊藻的去除效率达100%，处理7-8天对鱼腥藻和节球藻去除效率达100%。
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