CN105462886A - 一株具有抑制绿微囊藻的菌株及其培养方法 - Google Patents

一株具有抑制绿微囊藻的菌株及其培养方法 Download PDF

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Abstract

从富营养化的湖泊水体中筛选的一株能抑制铜绿微囊藻生长的细菌，经过鉴定为气单胞菌属，命名编号为N1菌株；将该菌株与铜绿微囊藻共同培养；当铜绿微囊藻初始藻浓度为1.9*106个/ml至4.87*106个/ml时，N1菌株初始浓度为2.0*107个/ml至2.0*108个/ml时，共培养五天，即可将该细菌用于对铜绿微囊藻的抑制。

Description

一株具有抑制绿微囊藻的菌株及其培养方法
技术领域
本发明属于对铜绿微囊藻具有抑制能力的一株细菌及其培养方法技术领域。
背景技术
水华暴发时大量有害藻类聚居于湖水表层，严重影响了湖水透明度，使得水体其他生物生长受到抑制，其次，大量繁殖的蓝藻使得水体中的总氮、总磷含量以及pH值向适宜其生长的环境条件变化，这也使得水体中其他生物的生存条件受到威胁。有害藻类分泌的次生代谢产物(化感物质、水体异味物质、藻毒素)也会对水体生态系统其他生物的生长产生负面影响。我国普遍存在着水体异味问题,尤其是在滇池、太湖、巢湖、东湖等富营养化湖泊中,一些有害藻类过度繁殖,在生长过程中产生具有异味的挥发性次生代谢产物释放到水体中,使水质与水产品产生刺鼻难闻的气味。藻毒素的释放危害了畜牧生产、渔业生产用水安全，以及人类饮水安全，对人体健康也构成较大危害。
富营养化水体导致的有害藻类暴发，目前日益成为世界范围内的重大环境问题之一，相应的治理有害藻类暴发的理论和技术就成为了各国研究的重点。生物抑藻以其成本低、环境及生态安全性较好而备受关注，其中利用土著溶藻细菌除藻具有较好的利用前景。
发明内容
本发明的目的正是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一株具有抑制绿微囊藻的菌株及其培养方法，这种细菌有助于解决水体藻类污染的问题。
本发明的目的是通过采用如下技术方案实现：
本发明从富营养化的湖泊水体筛选并分离到的细菌，经过鉴定为气单胞菌属(Aeromonassp.)，设编号为N1菌株；将该细菌与铜绿微囊藻进行共同培养，并将培养的细菌用于有效的抑制铜绿微囊藻的生长；具体培养步骤如下：
(1)活化菌种：从平板中挑取少量N1菌株到牛肉膏蛋白胨液体培养基，置于人工气候振荡培养箱培养；
(2)活化藻种：所用藻种为铜绿微囊藻(M.aeruginosa)，购自中国科学院典型培养物保藏委员会淡水藻种库，编号FACHB-905；藻种培养采用BG11培养基培养，培养环境为人工气候箱，光强2000lux，光暗比12h：12h，温度25-30℃左右，每天震荡藻种四至七次；
(3)共同培养：将活化后的藻液用已灭菌的BG11培养基稀释到1.9*106个/ml至4.87*106个/ml浓度，将活化后的菌液用已灭菌的牛肉膏蛋白胨培养基稀释到2.0*107个/ml至2.0*108个/ml的浓度，将菌液和藻液以1:9比例装入已灭菌的三角瓶中培养，对照组中用相同体积牛肉膏蛋白胨培养基取代菌液；培养环境为人工气候箱，光强2000lux，光暗比12h：12h，温度25-30℃左右，培养五天，每天震荡四至七次；
(4)取样：取一定量的藻液，采用显微镜直接计数，重复计数三次，计算细菌对藻液的抑制率，计算公式为：IR＝(1-Nt/Mt)*100％；
Nt：为第t天时处理组藻细胞密度；
Mt：为第t时对照组藻细胞密度；
本发明涉及到的牛肉膏蛋白胨培养基配制方法为，以总体积1L计：
准确称取牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂20-25g，加入蒸馏水充分溶解，定容至1L，121℃高温灭菌30min，冷却后调节PH＝7.0后使用。
本发明涉及到的BG11培养基配制方法为，以总体积1L计：
NaNO31.5g，K2HPO40.04g，MgSO4·7H2O0.075g，CaCl2·2H2O0.036g，Citricacid0.006g，Ferricammoniumcitrate0.006g，EDTA(disodiumsalt)0.001g，NaCO30.02g，微量元素混合液1.0ml，其中微量元素混合液配方(总体积1L)为H3BO32.86g，MnCl2·4H2O
1.81g，ZnSO4·7H2O0.222g，NaMoO4·2H2O0.39g，CuSO4·5H2O0.079g，Co(NO3)2·6H2O49.4g，于容量瓶中混匀，加入蒸馏水定容至1L，121℃高温灭菌30min，冷却后调节PH＝7.0后使用。
本发明的有益效果为，当铜绿微囊藻初始藻密度为浓度为1.9*106个/ml至4.87*106个/ml时，N1菌株初始浓度为2.0*107个/ml至2.0*108个/ml时，菌液与藻液共培养五天时细菌对铜绿微囊藻具有较高的抑制率。
具体实施方式
下面就具体实验结果对本发明做进一步阐释和补充，如下。
在富营养化的湖泊例如滇池水体筛选并分离到的细菌，经过鉴定为气单胞菌属(Aeromonassp.)，编号为N1菌株；将该细菌与铜绿微囊藻共同培养，并将该共同培养的细菌用于对铜绿微囊藻生长的抑制；当铜绿微囊藻初始藻密度为浓度为1.9*106个/ml至4.87*106个/ml时，N1菌株初始浓度为2.0*107个/ml至2.0*108个/ml时，共培养五天时可将该培养细菌用于对铜绿微囊藻的抑制，而且具有较高的抑制率。
1、实施例一
(1)活化菌种：从平板中挑取少量N1菌株到牛肉膏蛋白胨液体培养基，置于人工气候振荡培养箱培养，培养环境为：温度30℃，150r/min，培养12h。
(2)活化藻种：所用藻种为铜绿微囊藻(M.aeruginosa)，购自中国科学院典型培养物保藏委员会淡水藻种库，编号FACHB-905。藻种培养采用BG11培养基培养，培养环境为人工气候箱，光强2000lux，光暗比12h：12h，温度30℃，每天震荡藻种五次。
(3)共同培养：将活化后的藻液用已灭菌的BG11培养基稀释到1.9*106个/ml，将活化后的菌液用已灭菌的牛肉膏蛋白胨培养基稀释到2.0*108个/ml、2.0*107个/ml两个浓度，将菌液和藻液以1:9比例分别装入已灭菌的三角瓶中培养，对照组中用相同体积牛肉膏蛋白胨培养基取代菌液。培养环境为为人工气候箱，光强2000lux，光暗比12h：12h，温度30℃，培养五天，每天震荡数次。
(4)取样：取一定量的藻液，采用显微镜直接计数，重复计数三次，计算细菌对藻液的抑制率，计算公式为：IR＝(1-Nt/Mt)*100％；
Nt：为第t天时处理组藻细胞密度；
Mt：为第t时对照组藻细胞密度。
本发明当铜绿微囊藻浓度为1.9*106个/ml时，在共培养五天后，初始N1细菌密度为2.0*108个/ml时，对铜绿微囊藻的抑制率为95.16％；初始N1细菌密度为2.0*107个/ml时，对铜绿微囊藻的抑制率为31.97％。
2、实施例二
(1)活化菌种：从平板中挑取少量N1菌株到牛肉膏蛋白胨液体培养基，置于人工气候振荡培养箱培养，培养环境为：温度30℃，150r/min，培养12h；
(2)活化藻种：所用藻种为铜绿微囊藻(M.aeruginosa)，购自中国科学院典型培养物保藏委员会淡水藻种库，编号FACHB-905；藻种培养采用BG11培养基培养，培养环境为人工气候箱，光强2000lux，光暗比12h：12h，温度30℃，每天震荡藻种五次；
(3)共同培养：将活化后的藻液用已灭菌的BG11培养基稀释到2.58*106个/ml，将活化后的菌液用已灭菌的牛肉膏蛋白胨培养基稀释到2.0*108个/ml、2.0*107个/ml两个浓度，将菌液和藻液以1:9比例分别装入已灭菌的三角瓶中培养，对照组中用相同体积牛肉膏蛋白胨培养基取代菌液。培养环境为为人工气候箱，光强2000lux，光暗比12h：12h，温度30℃，培养五天，每天震荡数次；
(4)取样：取一定量的藻液，采用显微镜直接计数，重复计数三次，计算细菌对藻液的抑制率，计算公式为：IR＝(1-Nt/Mt)*100％；
Nt：为第t天时处理组藻细胞密度；
Mt：为第t时对照组藻细胞密度。
本发明当铜绿微囊藻浓度为2.58*106个/ml时，在共培养五天后，初始N1细菌密度为2.0*108个/ml时，对铜绿微囊藻的抑制率为74.8％；初始N1细菌密度为2.0*107个/ml时，对铜绿微囊藻的抑制率为53.83％。
3、实施例三
(1)活化菌种：从平板中挑取少量N1菌株到牛肉膏蛋白胨液体培养基，置于人工气候振荡培养箱培养，培养环境为：温度30℃，150r/min，培养12h。
(2)活化藻种：所用藻种为铜绿微囊藻(M.aeruginosa)，购自中国科学院典型培养物保藏委员会淡水藻种库，编号FACHB-905。藻种培养采用BG11培养基培养，培养环境为人工气候箱，光强2000lux，光暗比12h：12h，温度30℃，每天震荡藻种五次。
(3)共同培养：将活化后的藻液用已灭菌的BG11培养基稀释到4.87*106个/ml，将活化后的菌液用已灭菌的牛肉膏蛋白胨培养基稀释到2.0*108个/ml、2.0*107个/ml两个浓度，将菌液和藻液以1:9比例分别装入已灭菌的三角瓶中培养，对照组中用相同体积牛肉膏蛋白胨培养基取代菌液。培养环境为为人工气候箱，光强2000lux，光暗比12h：12h，温度30℃，培养五天，每天震荡数次。
(4)取样：取一定量的藻液，采用显微镜直接计数，重复计数三次，计算细菌对藻液的抑制率，计算公式为：IR＝(1-Nt/Mt)*100％；
Nt：为第t天时处理组藻细胞密度；
Mt：为第t时对照组藻细胞密度。
本发明当铜绿微囊藻浓度为4.87*106个/ml时，在共培养五天后，初始N1细菌密度为2.0*108个/ml时，对铜绿微囊藻的抑制率为88.54％；初始N1细菌密度为2.0*107个/ml时，对铜绿微囊藻的抑制率为24.51％。
本发明中生物材料样品的保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2015年3月11日，保藏编号：CCTCCNO：M2015102，完整的分类命名：Aeromonassp.N1。

Claims (4)

1.一株具有抑制绿微囊藻的菌株及其培养方法，其特征在于：
从富营养化的湖泊水体中筛选的一株能抑制铜绿微囊藻生长的细菌，经过鉴定为气单胞菌属，命名编号为N1菌株；将该菌株与铜绿微囊藻共同培养；当铜绿微囊藻初始藻浓度为1.9*106个/ml至4.87*106个/ml时，N1菌株初始浓度为2.0*107个/ml至2.0*108个/ml时，共培养五天，即可将该细菌用于对铜绿微囊藻的抑制。
2.根据权利要求1所述的一株具有抑制绿微囊藻的菌株及其培养方法，其特征在于，具体培养步骤为：
(1)活化菌种：从平板中挑取少量N1菌株到牛肉膏蛋白胨液体培养基，置于人工气候振荡培养箱培养；
(2)活化藻种：所用藻种采用铜绿微囊藻(M.aeruginosa)，购自中国科学院典型培养物保藏委员会淡水藻种库，编号FACHB-905；藻种培养采用BG11培养基培养，培养环境为人工气候箱，光强2000lux，光暗比12h：12h，温度25-30℃左右，每天震荡藻种四至七次；
(3)共同培养：将活化后的藻液用已灭菌的BG11培养基稀释到1.9*106个/ml至4.87*106个/ml浓度，将活化后的菌液用已灭菌的牛肉膏蛋白胨培养基稀释到2.0*107个/ml至2.0*108个/ml的浓度，将菌液和藻液以1:9比例装入已灭菌的三角瓶中培养，对照组中用相同体积牛肉膏蛋白胨培养基取代菌液；培养环境为人工气候箱，光强2000lux，光暗比12h：12h，温度25-30℃左右，培养五天，每天震荡藻种四至七次；
(4)取样：取一定量的藻液，采用显微镜直接计数，重复计数三次，计算细菌对藻液的抑制率，计算公式为：IR＝(1-Nt/Mt)*100％；
Nt：为第t天时处理组藻细胞密度；
Mt：为第t时对照组藻细胞密度。
3.根据权利要求2所述的一株具有抑制绿微囊藻的菌株及其培养方法，其特征在于，牛肉膏蛋白胨培养基配制方法为，以总体积1L计：
准确称取牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂20-25g，加入蒸馏水充分溶解，定容至1L，121℃高温灭菌30min，冷却后调节PH＝7.0后使用。
4.根据权利要求2所述的一株具有抑藻能力的菌株，其特征在于，BG11培养基配制方法为，以总体积1L计：
NaNO31.5g，K2HPO40.04g，MgSO4·7H2O0.075g，CaCl2·2H2O0.036g，Citricacid0.006g，Ferricammoniumcitrate0.006g，EDTA(disodiumsalt)0.001g，NaCO30.02g，微量元素混合液1.0ml，其中微量元素混合液配方(总体积1L)为H3BO32.86g，MnCl2·4H2O1.81g，ZnSO4·7H2O0.222g，NaMoO4·2H2O0.39g，CuSO4·5H2O0.079g，Co(NO3)2·6H2O49.4g，于容量瓶中混匀，加入蒸馏水定容至1L，121℃高温灭菌30min，冷却后调节PH＝7.0后使用。
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