CN103409348B - 具有高效溶藻活性的短小芽孢杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于水体净化领域，涉及具有高效溶藻活性的短小芽孢杆菌及其应用。具有高效溶藻活性的短小芽孢杆菌NMCC46，保藏于国家微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 3378，保藏日期为2009年11月2日。短小芽孢杆菌NMCC46对铜绿微囊藻生长繁殖有很强的抑制作用，7d后抑藻率为97.45%。短小芽孢杆菌NMCC46的发酵上清液在终浓度5‰时就有很好的溶藻效果。其产生的溶藻活性成分具有很好的热稳定性和pH稳定性。因此，所述的短小芽孢杆菌NMCC46可在控制蓝藻水华方面应用。
Description
技术领域
本发明属于水体净化领域，涉及具有高效溶藻活性的短小芽孢杆菌及其应用。
背景技术
水体富营养化，即在人类活动的影响下，生物所需的氮、磷等营养物质大量进入湖泊、河口、海湾等缓流水体，引起藻类及其他浮游生物迅速繁殖，水体溶解氧量下降，水质恶化，鱼类及其他生物大量死亡的现象。这种现象在江河湖泊中称为“水华”，在海洋则称为“赤潮”。近年来，城市建设、工农业的快速发展、植被破坏造成的水土流失以及环境污染等致使自然水体水质急剧恶化，水体富营养化程度加剧，不仅极大地危害人类健康和其他生物安全，也给全球造成巨大的经济损失。在我国131个主要湖泊中，已达富营养程度的湖泊有67个，占51.2%。在39个代表性水库中，富营养程度的有12座，占30%。在五大淡水湖中，太湖、洪泽湖、巢湖已达富营养程度；鄱阳湖、洞庭湖目前虽维持中营养水平，但磷、氮含量偏高，正处于向富营养过渡阶段。富营养化水体中有害藻类最多的属蓝藻和绿藻，其中蓝藻门微囊藻的发生最为普遍，也是最为危害。它持续时间长；产生异味；消耗大量溶解氧，造成水生动物窒息死亡；释放微囊藻毒素，严重影响水环境质量和水体生态安全。因此，如何快速高效的控制和消除有害藻类污染，成为水环境领域亟待解决的热点问题。
目前，防范有害藻类水华、赤潮的基本指导思想是：尽量控制外源性营养物质输入；削减内源性营养物质的负荷，水华、赤潮暴发前后应及时抑藻和除藻；尊重自然规律，加强生态观念。主要方法有物理方法，化学方法，生物方法。物理方法如围隔栅栏、直接过滤法、人工和机械打捞等，虽方法简单，能直接清除水体中的藻类，不会产生二次污染等优点，但费时、费钱、操作困难，该方法的应用仅限于局部水域或小面积的景观水体。化学方法如化学试剂、凝聚剂沉淀、天然矿物絮凝等。它具有操作简单、效果较快、用量少的优点，但不可避免地将造成环境污染或生态平衡的破坏，造成二次污染。目前应用最广的杀藻剂是硫酸铜，主要用于水源水体。硫酸铜容易使藻毒素从藻细胞内释放入水体中，另外，铜离子容易积存，且积存时间长，对水体中的水生生物产生毒害作用。所以化学方法只能是一种特殊的应急措施。生物方法具有廉价、高效、安全、维持水体生态平衡等优势，目前已经成为水体富营养化治理研究的热点。国内外主要的生物控藻法分为：种群竞争及化感作用抑藻、水生动物吞噬除藻、微生物控藻等。随着微生物工程的崛起，其对人类社会的各个方面的影响也越来越深远。真菌、病毒、藻类、细菌等微生物成为调节有害藻类种群动态的重要潜在因子
在水生生态系统中，细菌和微型藻类是数量最多、分布最广的生物，菌藻关系在水生生态系统的碳、氮、磷循环和营养再生中都起着重要的作用。作为水生生态系统生物种群结构和功能的重要组成部分，溶藻细菌对维持藻类的生物量平衡具有非常重要的作用。利用溶藻细菌防治有害藻类已成为一个新的研究方向。目前，分离到的溶藻细菌中50%的菌株属于噬细胞菌属、黄杆菌属、拟杆菌属，45%属于γ‐变形菌门，其它的属于革兰氏阳性菌。
芽孢杆菌，隶属于革兰氏阳性菌，广泛存在于自然界中，形成的孢子具有很强的抗逆性，其能释放多种脂肽类化合物及聚酮类化合物等次生代谢物质，从而促进植物生长和抑制植物病原菌，是目前生防细菌中研究和应用较多的一类细菌。目前，对于芽孢杆菌在富营养化水环境中的有害藻类控制方面的运用还处于初始阶段。因此，寻找具有高效溶藻活性的芽孢杆菌菌株及对该菌株进行深入研究和应用具有深远的意义。
发明内容
本发明的目的是为克服物理和化学方法控制水华中的高成本、高难度和二次污染等问题，提供具有高效溶藻活性的芽孢杆菌菌株，将该菌株及其发酵液用于控制蓝藻水华。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
具有高效溶藻活性的短小芽孢杆菌NMCC46，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No3378，保藏日期为2009年11月2日。
短小芽孢杆菌NMCC46的形态、生理生化特点包括：革兰氏染色阳性细菌，细胞呈直杆状，产生球形或椭圆形芽孢，需氧或兼性厌氧，以周生鞭毛运动，无荚膜，多数溶血，通常过氧化氢酶阳性。
所述的短小芽孢杆菌NMCC46在控制蓝藻水华方面的应用。
本发明与现有技术相比的有益效果在于：
（1）短小芽孢杆菌NMCC46对铜绿微囊藻生长繁殖有很强的抑制作用，7d后抑藻率为97.45%。
（2）短小芽孢杆菌NMCC46的发酵上清液在终浓度5‰时就有很好的溶藻效果。
（3）短小芽孢杆菌NMCC46产生的溶藻活性成分具有很好的热稳定性和pH稳定性。其在100℃处理30min后抑藻率仍有80.28%，在各pH处理后抑藻率均维持在90%以上。
（4）短小芽孢杆菌NMCC46环境相容性好，该菌属于芽孢杆菌，因此具有生防细菌的廉价、高效、安全、维持水体生态平衡等优势，同时拓宽了芽孢杆菌的生防范围，填补了市场空白，在市场上有很大的竞争力，不仅可以带来直接的经济效益，而且还有巨大的生态、环境和社会效益。
基于以上特点，短小芽孢杆菌NMCC46含菌发酵液以及发酵上清液或者以它们为核心所开发成的制剂，均可以用于新型杀藻剂开发和商品化生产，修复富营养化水体和湖泊水华或海洋蓝藻控制和治理。
附图说明
图117株芽孢杆菌菌株对铜绿微囊藻生长繁殖的抑制作用
图2液体和平板中短小芽孢杆菌NMCC46的溶藻效果
图3NMCC46发酵液不同处理方式的的溶藻效果
图4不同浓度的NMCC46发酵上清液对铜绿微囊藻生长繁殖的影响
图5NMCC46发酵上清液的热稳定性研究
图6NMCC46发酵上清液的pH稳定性研究
生物材料保藏信息
NMCC46，分类命名为短小芽孢杆菌Bacillus pumilus，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏号为CGMCC No.3378，保藏日期为2009年11月2日。
具体实施方式
实施例1.具有溶藻活性芽孢杆菌菌株的筛选
将实验室前期从西藏土样中分离的具有生防能力的17株芽孢杆菌菌株活化后，用牙签挑取单菌落，接种到20ml LB培养基中，在37℃，200rpm振荡培养24h；转接200μl于20ml Landy培养基中，在30℃，200rpm振荡培养发酵38h。将150μl发酵液添加到30ml的处于对数生长期的铜绿微囊藻藻液中，之后置于光照强度2500lx、温度28℃、光暗比16h:8h的光照培养箱中静置培养，每天定时摇动2次。7天后测定各处理的叶绿素a含量，计算抑藻率，并采用SPSS统计软件进行方差分析统计。结果表明：17株芽孢杆菌菌株对铜绿微囊藻的生长繁殖均有不同程度的抑制作用，其中芽孢杆菌NMCC46溶藻效果最好，其抑藻率为97.45%（见图1）。
通过PCR扩增16S rDNA(引物序列为正向引物:5’‐AG AGTTTGATCMTGGCTCAG‐3’，反向引物:5’‐GGYTACCTTGTTACGACTT‐3’)和gyrB基因（引物序列为正向引物:5’‐AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT‐3’,反向引物:5’‐GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA‐3’），并测序比对后，得知NMCC46的16S rDNA与Bacillus pumilus XJSL4‐9相似度为100%；gyrB基因与Bacillus pumilus ATCC27142相似度为98%，因此鉴定NMCC46为短小芽孢杆菌。
实施例2.抑藻机理的探索
将芽孢杆菌发酵液4℃12000rpm离心10min，收集上清液，所得上清液即发酵上清液。离心后的菌体加灭菌水还原到原来的体积，即菌体悬液。分别将150μL发酵液、菌体悬液、发酵上清液接种于30mL铜绿微囊藻藻液中，对照Control为Landy培养基，进行溶藻实验，7d后测定叶绿素a含量，计算抑藻率，比较发酵液不同处理方式对铜绿微囊藻的影响。结果：发酵上清液的抑藻率在98.0%，而菌体悬浮液的抑藻率仅为10.23%（见图3）。表明短小芽孢杆菌NMCC46主要是通过分泌胞外物质的间接方式起到溶藻作用。
实施例3.不同发酵上清液浓度对铜绿微囊藻生长的影响
为了研究不同浓度的短小芽孢杆菌NMCC46发酵上清液对铜绿微囊藻的溶藻效果，寻求发酵上清液的最佳使用剂量，我们取发酵上清液300μl、150μl、30μl、15μl添加到30ml铜绿微囊藻藻液中，使其终浓度为1%、5‰、1‰、0.5‰四个梯度，并以不添加发酵上清液处理的为对照Control。每隔1d用90%丙酮萃取的方法测定叶绿素a含量，并通过连续观察处理7d时的叶绿素a含量的变化来判断它们的溶藻效果。结果：发酵上清液在所供试的浓度下对铜绿微囊藻生长均有一定的抑制作用。在浓度1%和0.50%时，叶绿素a含量呈下降趋势，在浓度0.10%和0.05%时，叶绿素a含量虽然仍呈上升趋势，但相对于对照已有所下降。表明发酵上清液的使用剂量需超过一定限值5‰，才可以表现出较为明显的溶藻效果（见图4）。
实施例4.溶藻活性成分的热稳定性和pH稳定性检测
为了研究NMCC46发酵上清液中溶藻活性成分在不同的地理环境气候和水质中使用时的稳定性，我们将发酵上清液分别在4℃、20℃、30℃、50℃、70℃、100℃温度下处理30min；将发酵上清液通过添加HCl或NaOH调节其pH为4、5、6、7、8、9，分别接种150μL各pH发酵上清液于30mL铜绿微囊藻藻液中，来检测这些处理对铜绿微囊藻生长繁殖的抑制作用。结果：NMCC46发酵上清液100℃处理后，溶藻率只有80.28%，其他温度处理后溶藻率仍在95%以上（见图5）；发酵上清液调为各pH值处理后，均不影响溶藻活性成分，溶藻率都在90%以上（见图6）。表明起到有效抑藻作用的胞外分泌物包括具有热稳定性的非蛋白类物质和蛋白类物质，非蛋白类物质起到主要抑藻作用。且起到有效抑藻作用的胞外分泌物在偏酸或偏碱的条件下均不影响其活性。溶藻活性成分具有很好的热稳定性和pH稳定性。
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