CN107478633A - 一种利用三维荧光图谱解析微生物溶藻进程和机制的方法 - Google Patents

一种利用三维荧光图谱解析微生物溶藻进程和机制的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107478633A
CN107478633A CN201710880451.2A CN201710880451A CN107478633A CN 107478633 A CN107478633 A CN 107478633A CN 201710880451 A CN201710880451 A CN 201710880451A CN 107478633 A CN107478633 A CN 107478633A
Authority
CN
China
Prior art keywords
algae
molten
molten algae
microorganism
fluorescence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201710880451.2A
Other languages
English (en)
Inventor
张文艺
董小娜
陈泽慧
郭惠娟
毛林强
王明新
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Changzhou University
Original Assignee
Changzhou University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Changzhou University filed Critical Changzhou University
Priority to CN201710880451.2A priority Critical patent/CN107478633A/zh
Publication of CN107478633A publication Critical patent/CN107478633A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6402—Atomic fluorescence; Laser induced fluorescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6486—Measuring fluorescence of biological material, e.g. DNA, RNA, cells

Abstract

本发明一种利用三维荧光图谱解析微生物溶藻进程和机制的方法，属于溶藻研究的微生物学领域。本发明以铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)为实验对象，建立了一种三维荧光法解析微生物溶藻进程的方法。构建了藻细胞数量‑荧光光强、叶绿素a‑荧光光强关系模型，验证荧光法测定藻液的准确性；根据菌藻混合液三维荧光光谱图，解析了藻细胞分泌物和溶藻(降解)产物。采用荧光强度表征溶藻菌R1溶藻率，10d溶藻率可达89.8％，与chl‑a表征的溶藻率(82.64％)基本一致。本研究建立的这种三维荧光法解析微生物溶藻进程，为从事微生物溶藻研究提供了一种新方法。

Description

一种利用三维荧光图谱解析微生物溶藻进程和机制的方法
技术领域
本发明属于蓝藻降解的微生物学领域，涉及一种利用三维荧光图谱解析微生物溶藻进程和机制的方法。
背景技术
传统的浮游藻类微生物溶藻过程、溶藻效率的分析方法主要采用叶绿素(chl-a)含量测定法和藻细胞显微计数法。这2种方法具有工作量大，测量过程比较繁琐，耗费时间较长的缺点。尤其是chl-a含量的测定需要大量提取物，显微镜观测有时辨别不清，误差较大等不足。铜绿微囊藻有很强的荧光特性的藻胆蛋白，是一种卟啉类色素蛋白，卟啉具有π电子结构，在特定的波长照射下有很强的荧光反应。荧光光谱分析方法快速、准确、样品不需要特别处置、简单高效。藻细胞在新陈代谢过程中产生大量的藻类有机物(AOM)，分别为细胞代谢形成的胞外有机物(EOM)和细胞分解后释放的胞内有机物(IOM)，这些产物具有荧光特性，可通过三维荧光光谱进行定性分析。
目前已有学者对三维荧光考查菌株降解藻细胞的的研究进行了报道。《光谱学与光谱分析》2013年第33卷第1期167-171页报道了运用三维荧光光谱分析了Streptomycessp.HJC-D1溶藻过程产物，分析结果显示HJC-D1溶藻产物DOM以类腐殖酸物质为主。《生物学杂志》2017年第34卷第2期21-25页报道了以三维荧光光谱技术为手段，通过区域荧光体积积分的方法，考察了介质阻挡放电等离子体损伤铜绿微囊藻(Microcystic aeruginosa)过程中藻细胞荧光类内含物释放降解的规律。
本发明通过三维荧光技术，考察了铜绿微囊藻的荧光特性，对藻浓度进行了定量分析，构建了藻细胞数量-荧光强度、chl-a含量-荧光强度的关系模型；通过荧光光强变化考察了R1菌液的降解效果；并对Lysinibacillus macroides降解藻类产物进行了分析。
发明内容
本发明的目的：通过三维荧光技术解析微生物溶藻进程及机制。
本发明所采用的的技术方案如下：构建藻细胞数量-荧光光强、叶绿素a-荧光光强关系模型，验证荧光法测定藻液的准确性；通过Em 656nm下荧光激发光谱，考察了溶藻菌R1菌(Lysinibacillus macroides)的溶藻能力；根据菌藻混合液三维荧光光谱图，解析了藻细胞分泌物和溶藻(降解)产物。
利用上述方法解析的方法微生物溶藻进程及机制，按照下述步骤进行：
(1)荧光法测定藻液的准确性验证：分别测定不同配比的铜绿微囊藻混合液的藻细胞数量、chl-a含量、荧光光度，并建立藻细胞数量-荧光光强模型、叶绿素a-荧光光强关系模型，从而验证荧光法测定藻液的准确性；
(2)溶藻菌R1菌(Lysinibacillus macroides)的溶藻能力：固定荧光发射波长(Em)656nm考察菌株混合液的荧光激发光谱，通过荧光光强考察R1菌溶藻能力；
(3)藻细胞分泌物和溶藻(降解)产物考察：每隔一段时间测定菌藻混合液、菌液、及藻液三维荧光光谱图，对荧光图谱进行定性分析，推测溶藻产物及其溶藻活性物质。
本发明的有益效果：
(1)本发明验证了荧光法测定藻细胞浓度的准确性，验证了一种高效准确的藻浓度测定方法。
(2)本发明实践中的应用荧光法测定了R1菌溶藻能力与chl-a表征具有一致性，可作为溶藻效果的表征手段。
(3)本发明解析了利用三维荧光图谱解析微生物溶藻进程和机制，分析了藻细胞分泌物和溶藻(降解)产物，为利用溶藻菌溶藻的产物跟踪提供了借鉴。
附图说明
图1：溶藻产物荧光图谱。
具体实施方案
(1)关系模型建立：分别测定不同配比的铜绿微囊藻混合液的藻细胞数量、chl-a含量、荧光光度，并建立藻细胞数量-荧光光强模型、叶绿素a-荧光光强关系模型，从而验证荧光法测定藻液的准确性。
(2)R1菌溶藻能力考察：取10mL培养24h的R1菌液接种到100mL铜绿微囊藻溶液中，27℃、12h:12h光暗周期下培养，每天定期手动摇晃2-3次，分别取培养了0d、3d、7d、10d、12d的菌藻共培液进行三维荧光光谱分析及chl-a含量测定，计算溶藻率。扫描条件：固定发射波长为Em 656nm；Ex狭缝宽度为5nm；扫描速度为9600nm/s。
(3)溶藻产物考察：对降解后的藻液进行了三维荧光谱扫描。扫描条件：Em 280～550nm，Ex 220～800nm；狭缝宽度为5nm；扫描速度为24000nm/s。
利用上述菌株降解MC-LR的具体实施例如下：
实施例1
(1)藻细胞数量-荧光标线分析：①配制不同配比的铜绿微囊藻液，利用血球计数板及倒置显微镜计取不同浓度下的藻细胞数量。②利用Cary Eclipse荧光分光光度计分别不同配比藻液进行荧光光谱扫描。扫描条件：发射波长(简称Em)范围为280～900nm，激发波长(简称Ex)范围为220～800nm；狭缝宽度为5nm；扫描速度为9600nm/s，以超纯水校正拉曼散射。
(2)叶绿素a-荧光标线分析：①对上述(1)①配制的不同配比的铜绿微囊藻液进行chl-a的提取及测定。②同上(1)②。
结果显示：(1)藻密度与发射波长无关，在某一浓度阀值下，藻细胞的荧光光强与细胞数量及叶绿素a呈线性关系，拟合方程分别为y＝74.814+8.6433×x，R2＝0.9529，n＝12，p＝0.005622；y＝92.167+51.013×x，R2＝0.9706，n＝10，p＝0.001678，p值小于0.01相关性显著。(2)在低浓度下，荧光强度与溶液浓度成正比；在某个浓度阀值，曲线出现了拐点，浓度发生了淬灭，之后的强度值不再增加，可见使用荧光法测定藻液有浓度范围值的限制。
实施例2
取10mL培养24h的R1菌液接种到100mL铜绿微囊藻溶液中，27℃、12h:12h光暗周期下培养，每天定期手动摇晃2-3次，分别取培养了0d、3d、7d、10d、12d的菌藻共培液进行三维荧光光谱分析及chl-a含量测定。结果显示：10d溶藻率为达89.8％，与chl-a表征溶藻了相一致(82.64％)。
实施例3
取R1菌体上清液及其培养了12d的菌藻共培液进行三维荧光光谱分析，扫描条件：Em 280～550nm，Ex 220～800nm；狭缝宽度为5nm；扫描速度为24000nm/s。结果表明：藻类死亡后，藻细胞内物质大量释放到混合液中，其中含有大量的芳香族蛋白质、微生物产生的可溶性物质。溶藻过程中，疏水性氨基酸(hydrophbic acid)(属于富里酸)及类似疏水性酸性物质(related to hydrophobic acid)(属于胡敏酸)大量减少，可能是溶藻过程中腐殖酸分子与藻细胞发生了反应，其官能团发生了变化，如-COOH、-OH基团等减少，推测这些酸性物质其是迫使藻死亡的有效成分。

Claims (4)

1.一种利用三维荧光图谱解析微生物溶藻进程和机制的方法。
2.权利要求1所述的一种通过三维荧光技术测定藻浓度的方法，按照下述步骤进行：
①配置不同浓度的藻液，并计取细胞数量及测定chl-a含量；
②构建了藻细胞数量-荧光强度、chl-a含量-荧光强度的关系模型；
③验证荧光法测定藻液的准确性。
3.权利要求1所述的一种通过三维荧光技术考察溶藻进程的方法，按照下述步骤进行：
①荧光扫描条件：固定发射波长为Em 656nm；Ex 220-800nm；狭缝宽度为5nm；扫描速度为9600nm/s；
②取10mL培养24h的R1菌液接种到100mL铜绿微囊藻溶液中，27℃、12h:12h光暗周期下培养，每天定期手动摇晃2-3次；
③分别取培养了0d、3d、7d、10d、12d的菌藻共培液进行三维荧光光谱分析及chl-a含量测定，计算溶藻率；
④对比0d、3d、7d、10d、12d的菌藻共培液的chl-a含量，检查准确性。
4.权利要求1所述的一种通过三维荧光技术解析微生物溶藻机制的方法，按照下述步骤进行：
①荧光扫描条件：Em 280-550nm，Ex 220-800nm；狭缝宽度为5nm；扫描速度为24000nm/s。
②取R1菌体上清液与未加菌液的铜绿微囊藻液进行三维荧光谱扫描；
③溶藻产物考察：对培养了12d的菌藻混合液进行三维荧光谱扫描。
④对比②与③图谱，分析溶藻产物并推测可能的溶藻活性物质。
CN201710880451.2A 2017-09-26 2017-09-26 一种利用三维荧光图谱解析微生物溶藻进程和机制的方法 Pending CN107478633A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710880451.2A CN107478633A (zh) 2017-09-26 2017-09-26 一种利用三维荧光图谱解析微生物溶藻进程和机制的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710880451.2A CN107478633A (zh) 2017-09-26 2017-09-26 一种利用三维荧光图谱解析微生物溶藻进程和机制的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107478633A true CN107478633A (zh) 2017-12-15

Family

ID=60587397

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710880451.2A Pending CN107478633A (zh) 2017-09-26 2017-09-26 一种利用三维荧光图谱解析微生物溶藻进程和机制的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107478633A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108732142A (zh) * 2018-02-09 2018-11-02 秦皇岛红燕光电科技有限公司 基于三维荧光光谱的海水藻类赤潮及毒性检测方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101481670A (zh) * 2009-01-20 2009-07-15 南京大学 具有溶藻活性铜绿假单胞菌及在蓝藻水华控制中的应用
CN102888353A (zh) * 2012-08-06 2013-01-23 常州大学 溶藻细菌及其去除铜绿微囊藻的方法
CN102888354A (zh) * 2012-08-06 2013-01-23 常州大学 纺锤形赖氨酸芽孢杆菌及利用其降解铜绿微囊藻的方法
CN103409348A (zh) * 2013-07-25 2013-11-27 南京厚稷生物科技有限公司 具有高效溶藻活性的短小芽孢杆菌及其应用
CN104726336A (zh) * 2015-02-27 2015-06-24 河南城建学院 一种优化冻干溶藻细菌np23菌粉保护剂的方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101481670A (zh) * 2009-01-20 2009-07-15 南京大学 具有溶藻活性铜绿假单胞菌及在蓝藻水华控制中的应用
CN102888353A (zh) * 2012-08-06 2013-01-23 常州大学 溶藻细菌及其去除铜绿微囊藻的方法
CN102888354A (zh) * 2012-08-06 2013-01-23 常州大学 纺锤形赖氨酸芽孢杆菌及利用其降解铜绿微囊藻的方法
CN103409348A (zh) * 2013-07-25 2013-11-27 南京厚稷生物科技有限公司 具有高效溶藻活性的短小芽孢杆菌及其应用
CN104726336A (zh) * 2015-02-27 2015-06-24 河南城建学院 一种优化冻干溶藻细菌np23菌粉保护剂的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
孔赟 等: "Streptomyces sp.HJC-D1 溶藻过程产物光谱学特征及机理", 《光谱学与光谱分析》 *
王金霞: "溶藻细菌S7溶藻特性、机理及影响因素的研究", 《中国博士学位论文全文数据库 工程科技I辑》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108732142A (zh) * 2018-02-09 2018-11-02 秦皇岛红燕光电科技有限公司 基于三维荧光光谱的海水藻类赤潮及毒性检测方法
CN108732142B (zh) * 2018-02-09 2021-03-02 秦皇岛红燕光电科技有限公司 基于三维荧光光谱的海水藻类赤潮及毒性检测方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Falco et al. In vivo observation of chlorophyll fluorescence quenching induced by gold nanoparticles
Trouillon et al. Chemical analysis of single cells
Dron et al. Light–dark (12: 12) cycle of carbon and nitrogen metabolism in Crocosphaera watsonii WH8501: relation to the cell cycle
Li et al. A Hg (II)-specific probe for imaging application in living systems and quantitative analysis in environmental/food samples
Spielmeyer et al. Dimethylsulfide sources from microalgae: Improvement and application of a derivatization-based method for the determination of dimethylsulfoniopropionate and other zwitterionic osmolytes in phytoplankton
Duncan et al. Influence of culture regime on arsenic cycling by the marine phytoplankton Dunaliella tertiolecta and Thalassiosira pseudonana
CN106495770A (zh) 一种利用农林废弃物的高效快速堆肥发酵方法
Liu et al. Aggregation and deaggregation of rhodamine fluorescent probe for sequential recognition of Hg (II) and Cys with green emission
CN102879381B (zh) 抗菌药呋喃唑酮和呋喃西林的表面增强拉曼光谱检测方法
Wang et al. Carbon-dot-based probe designed to detect intracellular pH in fungal cells for building its relationship with intracellular polysaccharide
Kanwal et al. Recent advances in green carbon dots (2015–2022): synthesis, metal ion sensing, and biological applications
Ma et al. Efficient imaging of Saccharomyces cerevisiae based on B-and N-doped carbon dots
CN104502303A (zh) 用于快速帧检细菌的亚太赫兹纳米生物传感器及其检测方法
CN107478633A (zh) 一种利用三维荧光图谱解析微生物溶藻进程和机制的方法
CN105445248A (zh) 一种快速测定蓝藻细胞凋亡率的方法
Evans et al. Development of approaches for deuterium incorporation in plants
Tachapermpon et al. Dual mode of cyanide detection by Fluorescein-Based “Turn-ON” Bi-Signaling fluorescence and colorimetric sensing: Agricultural product and cellular studies
Zhu et al. Intracellular kynurenine promotes acetaldehyde accumulation, further inducing the apoptosis in soil beneficial fungi Trichoderma guizhouense NJAU4742 under acid stress
Zhang et al. Effect of phosphate loading on the generation of extracellular organic matters of Microcystis aeruginosa and its derived disinfection by-products
Minich et al. Vital activity of Lactuca sativa and soil microorganisms under fluorescent films
CN104990878A (zh) 一种绿色微囊藻细胞抑制率的测定方法
CN104222098A (zh) 一种甲酰胺酚嗪生物杀菌剂的制备方法
Xu et al. Quorum sensing regulation in Microcystis aeruginosa: Insights into AHL-mediated physiological processes and MC-LR production
Riss et al. Evaluation of real time cell viability assays multiplexed with other methods
Zhang et al. Temperature rise increases the bioavailability of marine synechococcus-derived dissolved organic matter

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20171215

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication