CN105385642B - 短波单胞菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于环境保护技术领域，具体涉及短波单胞菌及其应用。根据本发明的短波单胞菌(Brevundimonas olei)AA10，其保藏编号为CGMCC No.11572。本发明从土壤中筛选具有溶藻效能的菌株，样品采集方便，同时选用廉价的牛肉膏蛋白胨培养基分离纯化溶藻细菌，具有简便、安全等特点；本发明筛选出的溶藻细菌对蓝藻水华中的优势藻种微囊藻有着较强的溶解作用，能够对自然水体中藻类水华发挥溶藻特性，在微囊藻水华治理方面有着广阔的应用前景。

Description

短波单胞菌及其应用
技术领域
本发明属于环境保护技术领域，具体涉及短波单胞菌及其应用。
背景技术
随着社会经济的快速发展，城镇化进程的不断加快，人们对生活品质的要求越来越高，淡水需求量也在日益增大，但生产生活污废水排放中的污染物质未得到有效消减，水环境状况还没有得到根本改善。尤其是含有氮磷的污染物不断地排放到水体中，导致水体自净功能丧失，河流和湖泊的藻类水华频繁爆发，严重破坏了水体生态环境，威胁水生生物，并严重影响着人们的生活、经济生产和身体健康。
藻类水华的爆发使得水体溶解氧减少，水质变臭，水体透明度下降，浮游生物和鱼虾类等水生生物因生存环境恶化而死亡，生物量及种类减少，水体生物多样性结构发生改变，最终影响着人们的生活、经济生产和身体健康。在我国，微囊藻是引起地表水体水华的常见藻种，它属于蓝藻门，通常为球形或椭圆形单细胞聚组成的聚集体，微囊藻中的部分藻种，如铜绿微囊藻和水华微囊藻，能够产生并分泌微囊藻毒素，对水生生物以及人体健康带来很大的环境风险和危害。
控制水体中藻类过度繁殖的方法主要有物理法、化学法和生物法。物理法包括在水华出现时直接进行打捞收集的方法，也包括向水体中投加絮凝性物质的方法，如投加改性粘土，可以将藻体絮凝沉降至水底。化学法主要指投加杀藻剂，常用杀藻剂有硫酸铜和有机农药，但硫酸铜和农药会残留水中，对生态环境造成二次污染，除此外还有人工合成的各种有机杀藻剂，以及生物杀藻剂等。生物法是近些年受关注比较多的方法，主要有种植水生植物，利用植物的化感作用控制水华，例如种植浮萍、菖蒲等；或通过人为构筑的水生生态链来控制水华，例如养殖鲢鱼和鳙鱼等；或向水体中投入溶藻菌类、食藻虫等，通过摄食藻类而控制水华。生物法因为其高效性、专一性及环境友好等优点成为藻类水华治理的热点。
溶藻菌是指一类以直接或间接方式抑制藻类生长或杀死藻类、溶解藻细胞的细菌和真菌的统称，是水生生态系统生物种群结构和功能的重要组成部分，对维持藻类生物量平衡具有非常重要的作用。由于水体藻类水华的爆发是多种因素综合作用的结果，利用溶藻菌治理水华，可使水环境保持生态平衡，从而达到防止藻类水华的目的，并且不增加额外的环境理化污染。溶藻菌广泛存在于水体及自然环境状态下，是一种天然的物质财富，通过溶藻菌可以达到以藻养菌、以菌控藻和原位治藻的目的。因此，筛选以水华藻类或其代谢产物为营养的高效溶藻细菌，并研制溶藻菌剂，具有很好的研究意义和实际运用价值。
目前，在溶藻菌方面，已有从不同的环境中分离出了多种溶藻细菌，筛选出的溶藻菌涉及多个属种，有杆菌、球菌、弧菌等，但是所筛选的菌种主要是针对铜绿微囊藻，而对引起水华的其他微囊藻属也具有溶藻效果的菌剂，还较缺乏。因此，本发明不仅筛选出具有能够溶解铜绿微囊藻的细菌，而且能够对引起水华的其它微囊藻也具有溶解抑制效果，所筛选的菌剂具有易培养、成本低廉，并在微囊藻溶解方面具有高效以及使用操作简便的特点。
发明内容
本发明提供了一株具有溶藻特性的短波单胞菌(Brevundimonas olei)，保藏编号为CGMCC No.11572。
所述短波单胞菌菌株为革兰氏阴性菌，在牛肉膏蛋白胨平板培养基上菌落为灰白色，较为干燥，中间有凸起，类草帽状，过氧化氢酶实验为阳性，甲基红实验为阳性，产氨实验为阳性，柠檬酸盐利用实验为阳性。
上述菌株用于控制蓝藻中的微囊藻水华，将短波单胞菌接种在pH约为7.5的无菌牛肉膏蛋白胨培养基中，37℃条件下培养48h后形成菌液，应用于微囊藻的溶藻中。
本发明的主要效果及优点：本发明从土壤中筛选具有溶藻效能的菌株，样品采集方便，同时选用廉价的牛肉膏蛋白胨培养基分离纯化溶藻细菌，具有简便、安全等特点；本发明筛选出的溶藻细菌对蓝藻水华中的优势藻种微囊藻有着较强的溶解作用，能够对自然水体中藻类水华发挥溶藻特性，在微囊藻水华治理方面有着广阔的应用前景。
附图说明
图1是不同的菌液浓度对实际水体微囊藻进行溶藻10天后的叶绿素a含量。
图2是不同的菌液浓度对实际水体微囊藻进行溶藻10天后的叶绿素a去除率。
图3是用光学显微镜观察下的微囊藻细胞变化情况。a为实际水样溶藻前的藻细胞；b为实际水样溶藻前的藻细胞中性红染色，显示为阴性，细菌未死亡；c为溶藻后的藻细胞；d为溶藻后的藻细胞中性红染色，显示为阳性，细胞死亡。
图4是用扫描电子显微镜观察下的微囊藻细胞变化情况。a为实际水样溶藻前的藻细胞，b为第10天对照样中的藻细胞，c和d为溶藻第10天的藻细胞。
短波单胞菌(Brevundimonas olei)AA10，于2015年11月3日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏编号是：CGMCC No.11572。
具体实施方式
实施例1菌株分离
溶藻菌的筛选与鉴定
1、土样的处理
将采来的土样放到烧杯中，大约占到烧杯容积的2/3，加入无菌水，搅拌均匀，静置2h，取上清液，备用。
2、培养基配制
牛肉膏蛋白胨培养基：蛋白胨5.0g、NaCl 5.0g、牛肉膏5.0g、蒸馏水1000ml，pH约为7.5，对于固体培养基，需再添加琼脂粉2.0％(m/v)，并加热溶解，所用的培养基均要在120℃、0.11Mpa条件下灭菌30min。
微囊藻使用的为BG11培养基：NaNO3 1500mg/L、K2HPO4 40mg/L、MgSO4·7H2O75mg/L、CaCl2·2H2O 36mg/L、柠檬酸6mg/L、柠檬酸铁铵6mg/L、Na2EDTA 1mg/L、Na2CO320mg/L、H3BO32.86mg/L、MnCl2·4H2O 1.81mg/L、ZnSO4·7H2O 0.222mg/L、NaMoO4·2H2O 0.39mg/L、CuSO4·5H2O 0.079mg/L、Co(NO3)2·6H2O 0.0494mg/L；pH约为7.1-7.5，在120℃、0.11Mpa条件下灭菌30min。
3、分离筛选方法
取步骤1的上清液10ml，加入到100ml灭菌后的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在37℃条件下培养48h后，取培养后的菌液10ml，加入到100ml的微囊藻藻液中，于30℃、2000lx、14h/10h光暗比条件下培养，5-7天后，取藻液黄化的样品进行后续实验。
将黄化后的藻液逐级稀释，然后涂布在灭菌后的牛肉膏蛋白胨固体平板培养基上，37℃条件下培养48h，挑取不同的单个菌落，在灭菌后的牛肉膏蛋白胨固体平板培养基上划线培养，37℃条件下培养48h，再挑取菌落进行划线培养，得到纯化的菌株，纯菌株接种于灭菌后的牛肉膏蛋白胨斜面培养基中，在4℃冰箱内保存备用。
将获得的纯种菌接种到10ml灭菌后的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃条件下培养48h，再将形成的菌液转接到100ml灭菌后的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃条件下培养48h，用牛肉膏蛋白胨液体培养基调节菌液浓度为108CFU/mL。另取处于对数期的藻液，用BG11培养基调节藻液的细胞密度为109个/mL，将10ml菌液加到100ml的藻液中，以不加菌液的藻样为对照，培养5-7天后，加菌的藻液变黄，对照不变黄，则该细菌为溶藻菌。
按照上述方法得到了一株溶藻效率较高的溶藻细菌AA10。
4、溶藻细菌的鉴定
使用引物27F(AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG)和1492R(TAC GGC TAC CTTGTTACGACT T)，使用PCR技术，扩增16S rDNA片段，得到该菌株的16S rDNA序列，通过将菌株的16Sr DNA序列进行比对，结合菌株的形态特征和生理生化特征，鉴定该菌株为短波单胞菌(Brevundimonas olei)。所述短波单胞菌菌株为革兰氏阴性菌，在牛肉膏蛋白胨平板培养基上菌落为灰白色，较为干燥，中间有凸起，类草帽状，过氧化氢酶实验为阳性，甲基红实验为阳性，产氨实验为阳性，柠檬酸盐利用实验为阳性。
以下提供本发明利用上述菌株处理微囊藻的实施例
实施例2利用溶藻效率较高的溶藻细菌AA10菌株处理微囊藻
本实施例处理的是100ml新鲜的中华微囊藻藻液，按照1:10(v/v)的比例投加菌液。具体实施步骤如下：将短波单胞菌接种于10ml灭菌后牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于37℃条件下培养48h，再将菌液转接到100ml灭菌后牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃下培养48h，调节菌液密度约为109CFU/mL，然后按照菌藻体积比1:10的投菌量将菌液加入到藻液中，测定藻液叶绿素a的初始浓度为999μg/L，投加菌液10天后，叶绿素浓度为78.3μg/L，溶藻效率为92.2％。
实施例3利用溶藻效率较高的溶藻细菌AA10菌株处理微囊藻
本实施例处理的是100ml新鲜的铜绿微囊藻藻液，按照3:10(v/v)的比例投加菌液。具体实施步骤如下：将短波单胞菌接种于10ml灭菌后牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于37℃条件下培养48h，再将菌液转接到100ml灭菌后牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃下培养48h，调节菌液密度约为109CFU/mL，然后按照菌藻体积比3:10的投菌量将菌液加入到藻液中，测定藻液叶绿素a的初始浓度为853μg/L，投加菌液10天后，叶绿素浓度为46.0μg/L，溶藻效率为94.6％。试验结果参见图1-4
实施例4利用溶藻效率较高的溶藻细菌菌株AA10处理微囊藻
本实施例处理的是100ml新鲜的惠氏微囊藻藻液，按照5:10(v/v)的比例投加菌液。具体实施步骤如下：将短波单胞菌接种于10ml灭菌后牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于37℃条件下培养48h，再将菌液转接到100ml灭菌后牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃下培养48h，调节菌液密度约为109CFU/mL，然后按照菌藻体积比5:10的投菌量将菌液加入到藻液中，测定藻液叶绿素a的初始浓度为720μg/L，投加菌液10天后，叶绿素浓度为9.4μg/L，溶藻效率为98.7％。
与现有的假单胞菌(Pseudomonadaceae sp.)相比，将假单胞菌接种于10ml灭菌后牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于37℃条件下培养48h，再将菌液转接到100ml灭菌后牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃下培养48h，调节菌液密度约为109CFU/mL，然后按照菌藻体积比5:10的投菌量将菌液加入到藻液中，测定藻液叶绿素a的初始浓度为855μg/L，投加菌液10天后，叶绿素浓度为719μg/L，跟对照样藻的死亡率基本一致，该菌株并没有溶藻能力，而本发明的溶藻细菌菌株AA10具有优良的溶藻能力。

Claims (4)

1.短波单胞菌(Brevundimonas olei)AA10，其特征在于，其保藏编号是：CGMCCNo.11572。
2.权利要求1所述短波单胞菌(Brevundimonas olei)AA10用于溶解微藻的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述微藻为中华微囊藻、铜绿微囊藻或惠氏微囊藻。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，短波单胞菌(Brevundimonas olei)AA10菌液与微藻液的比例为1:10v/v～5:10v/v。
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