CN106701630A - 一种溶藻细菌微球的固定化制备和应用 - Google Patents

一种溶藻细菌微球的固定化制备和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及水环境生态修复技术领域，具体涉及一种固定化溶藻细菌微球的制备和应用。将所培养溶藻菌液中菌体细胞分离，并重悬于原取样体积20‑80%的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，选择聚乙烯醇和海藻酸钠为包埋体，氯化钙的饱和硼酸溶液作为交联剂，在4℃下固定化交联16‑32h，制得溶藻细菌微球。同时本发明公布了固定化溶藻细菌微球抑制藻类过度生长的应用。本发明提出的固定化方法适应了溶藻细菌的生长特性，能够长期持续抑制藻类过度生长，避免了溶藻细菌的反复投加，实现了溶藻细菌的一次性投加；改进了营养物质的添加方式，既不会影响溶藻细菌的溶藻抑藻效能，又不会带来水质影响；本发明制作工艺简单，成本低，易于大范围推广，不产生二次污染，固定化溶藻细菌微球为水华治理提供了一条有效的途径。

Description

一种溶藻细菌微球的固定化制备和应用
技术领域
本发明涉及水环境生态修复技术领域，具体涉及一种固定化溶藻细菌微球的制备和应用。
背景技术
由于人类活动，含氮、磷等营养物质的工业废水、农田排水和生活污水大量进入河流、湖泊，导致水体中氮、磷等营养物质增加，水中藻类暴发性增长，给水体生态环境、用水安全、景观效应甚至人类健康带来不利影响。
控制水体中藻类过度繁殖的方法主要有物理方法、化学方法和生物方法。物理方法有人工打捞、超声波除藻、絮凝剂投加(聚合氯化铝，聚硅硫酸铝，磷酸盐粘土)等；化学方法是指直接向水体中投加杀藻剂来除藻，常用的无机物杀藻剂有含铜无机盐（CuSO4和CuCl2等）、高锰酸钾和臭氧等，这些物质易对水体造成二次污染。有机杀藻剂主要指从天然植物中提取的化感物质，或者根据这些化感物质的结构而人工合成的有机物。生物法是近些年受关注比较多的方法，主要有种植水生植物，利用植物的化感作用控制水华；或通过人为构筑的水生生态链来控制水华；或向水体中投入食藻虫摄食藻类而控制水华。生物方法因为其高效性、专一性和环境友好等优点成为藻类水华治理的热点。
溶藻菌是指一类以直接或间接方式抑制藻类生长、杀死藻类或溶解藻细胞的细菌和真菌的统称，是水生生态系统生物种群结构和功能的重要组成部分，对维持藻类生物量平衡具有非常重要的作用。目前，溶藻细菌主要以游离细胞的形式被应用，但游离溶藻细胞在流水条件下易被水流冲走，在静水条件下易被其他生物所食用，由于缺乏细菌附着和生长繁殖的载体，溶藻细菌难以稳定长期发挥抑制藻类生长或杀死藻类的功能。另外，藻类可利用水中无机类的碳氮磷化合物作为生长所需要的物质和能量来源，而溶藻细菌必须摄取有机碳源作为物质和能量的来源，因此，为了维持溶藻细胞的生长以及溶藻活动，在向水中施加游离的溶藻细胞时，往往需要添加有机营养物质，而这些营养物质的加入又反过来会对水体的水质带来影响。
固定化微生物技术是用化学或物理手段将游离微生物定位于限定的空间区域内，增大微生物密度并使其保持活性的方法，能够避免微生物流失，提高稳定性、耐毒害和抗冲击能力。本发明提出将具有抑藻溶藻性能的细菌细胞固定于包埋体材料中，并在包埋体中加入溶藻细菌生长所需的营养物质，建立了一种固定化溶藻细菌微球的制备方法，并提出了其应用方式，在既能够维持溶藻细菌活性前提下，满足固定化溶藻细菌微球长达4-6个月的使用要求，同时又能降低溶藻细菌微球在使用过程对水质带来的影响。
发明内容
本发明的目的是提供一种固定化的溶藻细菌微球。
本发明的再一目的是提供一种固定化溶藻细菌微球的制备方法。
本发明的再一目的是提供一种利用固定化溶藻细菌微球抑制藻类过度生长的方法。
为了实现上述的目的，本发明采用以下技术方案：以聚乙烯醇、海藻酸钠为包埋剂，以含有氯化钙的饱和硼酸溶液作为交联剂，在一定包埋比例、交联时间、温度、细菌培养基加入比例的条件下，将溶藻细菌进行固定化，进而进行抑藻。
一种固定化溶藻细菌微球的制备方法，具体包括以下步骤：
（1）配制无菌液体培养基；
（2）将溶藻细菌接种于步骤（1）溶液中，培养，得到培养菌液；
（3）将步骤（2）培养菌液中的菌体细胞分离，并重悬于溶液（1）中；
（4）配制聚乙烯醇-海藻酸钠溶液；
（5）配制氯化钙-硼酸交联剂；
（6）将步骤（4）中溶液与步骤（3）中菌液混合，滴加入步骤（5）溶液中，固定化交联得到溶藻细菌微球。
进一步，步骤（1）中培养基为细菌培养常用的牛肉膏蛋白胨培养基，组成为：氯化钠5g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏5g/L，配制于蒸馏水中，所配培养基用1mol/L氢氧化钠或1mol/L盐酸调节pH值为7.2-7.5，在120℃、110kPa下灭菌，得到无菌液体培养基。
进一步，步骤（2）中溶藻菌为缺陷短波单胞菌（Brevundimonas diminuta，CGMCCNo.11571）、短波单胞菌（Brevundimonas olei，CGMCC No.11572）、黏着剑菌（Ensifer adhaerens，CGMCC No.12458）和粪产碱菌（Alcaligenes faecalis，CGMCC No.12457），培养温度为28-37℃下，培养时间为48-96小时，优选60-80小时。
进一步，步骤（3）中菌液分离后所获得的菌体细胞重悬于原取样体积20-80%的培养基中，优选40-60%。
进一步，步骤（4）中聚乙烯醇的质量浓度为10-12%，海藻酸钠质量浓度为0.25-1.0%，配制于蒸馏水中，先加入聚乙烯醇，再加入海藻酸钠，在80-90℃下溶解，并保持溶液最终温度为25-40℃。
进一步，在步骤（5）中，在25-35℃温度下，将硼酸溶解于蒸馏水中至有结晶析出，所得为硼酸的饱和溶液；用质量浓度15-30%碳酸钠调节溶液pH值为6.7-7.2；按氯化钙质量浓度1.5-2.5%，将氯化钙加入到硼酸饱和溶液中。
进一步，在步骤（6）中，步骤（4）聚乙烯醇-海藻酸钠溶液与步骤（3）中菌液的体积比2:1-1:1，在35-40℃下搅拌均匀，然后滴加入步骤（5）溶液中，并在4℃下固定化交联16-32小时，优选20-24小时。
上述藻类为蓝藻中的微囊藻属，优选铜绿微囊藻、中华微囊藻、水华微囊藻、放射微囊藻、坚实微囊藻、鱼害微囊藻、挪氏微囊藻、假丝微囊藻、史密斯微囊藻、绿色微囊藻、惠氏微囊藻。
上述所制备的细菌微球为直径为3-15mm的类球形颗粒，所得溶藻细菌微球可用无菌水清洗干净后，在4℃保存于生理盐水中，备用。使用时，将溶藻细菌微球填充于镂空容器中，直接投放于含藻水体中。
针对细胞密度为1×108-8×1012个/L的含微囊藻水，投加量N根据下面公式进行估算：
式中，N：投加溶藻细菌微球的个数；α×10n：藻细胞密度，个/L；r：溶藻细菌微球的半径（mm）；V：所需处理的含藻水体积（L）。
本发明提供的一种溶藻细菌微球的固定化的制备方法，它的原理是将游离的溶藻细菌，通过聚乙烯醇和海藻酸钠包埋体包埋在固定化微球中，而且微球中添加了一定量的培养基成份，在增加了溶藻细菌的密度的同时，保持了细菌的活性，能够避免细菌细胞在自然水体中流失，提高溶藻细菌的稳定性、耐毒害和抗冲击的能力，保证溶藻细菌在多种不利的外界条件下，仍然能稳定发挥抑藻杀藻的功效。同时，由于溶藻细菌被包埋在微球内部多孔的结构内，微球能够向外界缓慢的释放溶藻细菌，致使溶藻细菌能长期持续抑制藻类生长，持续时间可达4-6个月。实际水体中，藻类水华爆发的时长大约为4-6个月，这样固定化的溶藻细菌微球持续释放溶藻细菌的时间能够满足实际水体水华控制的需要，从而解决了游离溶藻细菌不能够长期持续抑制藻类过度生长的问题，能够有效控制藻类过度生长。同时，本发明通过改进营养物质的添加方式，在既能保证溶藻细菌溶藻抑藻效能的前提下，减少营养物质的投加量，避免了营养物质的过量加入对水质带来的影响。
本发明与现有技术相比显著优点是：
（1）本发明制备的固定化溶藻细菌微球，能够长期持续抑制藻类过度生长，持续时间可达4-6个月，实现溶藻细胞的一次性投加，避免了游离溶藻细菌的反复多次投加，从而能够有效控制藻类水华的爆发；
（2）利用聚乙烯醇和海藻酸钠作为包埋剂，制备的固定化溶藻细菌微球，抗微生物分解性好，机械强度高，化学稳定性好，从而保证溶藻细菌微球在水体环境中有较好的稳定性，为实现溶藻细菌微球长期持续抑制藻类过度生长提供了有力的保障；
（3）本发明所制备的固定化溶藻细菌微球用于抑制藻类生长，可以克服传统投加游离态溶藻细菌的弱点，在静水条件下不易被其他生物所吞噬，维持溶藻细菌数量稳定，有助于其稳定地长期发挥功效；
（4）以聚乙烯醇和海藻酸钠作为包埋材料制备的固定化微球，内部具有多孔结构和网状结构，这种结构适宜微生物的生长和附着，为物质交换提供了空间和条件，而且这种外密内疏的结构可以有效的防止包埋微生物的流失，保证溶藻细胞的生物量维持在相对稳定的水平，有助于其长期持续稳定的抑藻杀藻；
（5）本发明通过改进营养物质的添加方式，在保证溶藻细菌在水体环境生长所需物质和能量的前提下，既保证了溶藻细菌能够长期持续溶藻抑藻，又减少了营养物质的投加量，降低了营养物质进入水体带来的水质影响；
（6）本发明处理方法中采用的固定化溶藻细菌微球制备方法中，采用的原材料不含有害物质，不会对水体造成二次污染；
（7）本发明使用的原料来源丰富，生产工艺简单，容易加工，价格低廉，易于大范围推广。
具体实施方式
实施例1
（1）配制无菌液体培养基，组成为：氯化钠5g、蛋白胨10g、牛肉膏5g，用1mol/L氢氧化钠或1mol/L盐酸溶液调节pH至7.2，在120℃、110kPa下灭菌30min。
（2）将溶藻细菌缺陷短波单胞菌（Brevundimonas diminuta，CGMCC No.11571）接种于步骤（1）溶液中，于37℃下培养72h，得到培养菌液。
（3）将步骤（2）中培养菌液在4800r/min条件下离心10min，将所获得菌体细胞重悬于原取样体积40%的步骤（1）中培养基。
（4）配制质量分数10%的聚乙烯醇溶液，海藻酸钠的质量浓度为0.25%，配制于蒸馏水中，先加入聚乙烯醇，再加入海藻酸钠，在86℃下溶解，并保持溶液最终温度为35℃。
（5）在25℃温度下，将硼酸溶解于蒸馏水中至有结晶析出，所得为硼酸饱和溶液；用质量浓度15%碳酸钠溶液调节饱和硼酸溶液的pH值为6.7；按氯化钙质量浓度1.5%，将氯化钙加入到硼酸饱和溶液中。
（6）将步骤（4）聚乙烯醇-海藻酸钠溶液与步骤（3）中菌液按照体积比2:1混合，在35℃下搅拌均匀，然后滴加入步骤（5）溶液中，在4℃下固定化交联16h，得到溶藻细菌微球。
（7）将上述制备的5000个直径为3mm的溶藻细菌微球填充于镂空容器，直接投入藻细胞密度为4.02×109个/L的10L铜绿微囊藻水中，5天后，微球的溶藻率为54%，20天后，微球的溶藻率为90%。
实施例2
（1）配制无菌液体培养基，组成为：氯化钠5g、蛋白胨10g、牛肉膏5g，用1mol/L氢氧化钠或1mol/L盐酸溶液调pH至7.3，在120℃、110kPa下灭菌30min。
（2）将溶藻细菌缺陷短波单胞菌（Brevundimonas diminuta，CGMCC No.11571）接种于步骤（1）溶液中，于37℃下培养80h，得到培养菌液。
（3）将步骤（2）中培养菌液在4800r/min条件下离心10min，将所获得菌体细胞重悬于原取样体积50%的步骤（1）中培养基。
（4）配制质量分数11%的聚乙烯醇溶液，海藻酸钠的质量浓度为0.50%，配制于蒸馏水中，先加入聚乙烯醇，再加入海藻酸钠，在88℃下溶解，并保持溶液最终温度为37℃。
（5）在26℃温度下，将硼酸溶解于蒸馏水中至有结晶析出，所得为硼酸的饱和溶液；用质量浓度20%碳酸钠溶液调节饱和硼酸溶液pH值为6.9；按氯化钙质量浓度2.0%，将氯化钙加入到硼酸饱和溶液中。
（6）将步骤（4）聚乙烯醇-海藻酸钠溶液与步骤（3）中菌液按照体积比1:1混合，在35℃下搅拌均匀，然后滴加入步骤（5）溶液中，在4℃下固定化交联24h，得到溶藻细菌微球。
（7）将上述制备的20000个直径为5mm的溶藻细菌微球填充于镂空容器，直接投入藻细胞密度为9.02×109个/L的20L中华微囊藻水中，4天后，微球的溶藻率为75%，20天后，微球的溶藻率为96%。
实施例3
（1）配制无菌液体培养基，组成为：氯化钠5g、蛋白胨10g、牛肉膏5g，用1mol/L氢氧化钠或1mol/L盐酸溶液调pH至7.5，在120℃、110kPa下灭菌30min。
（2）将溶藻细菌缺陷短波单胞菌（Brevundimonas diminuta，CGMCC No.11571）接种于步骤（1）溶液中，于37℃下培养90h，得到培养菌液。
（3）将步骤（2）中培养菌液在4800r/min条件下离心10min，将所获得菌体细胞重悬于原取样体积60%的步骤（1）中培养基。
（4）配制质量分数12%的聚乙烯醇溶液，海藻酸钠的质量浓度为1.0%，配制于蒸馏水中，先加入聚乙烯醇，再加入海藻酸钠，在90℃下溶解，并保持溶液最终温度为37℃。
（5）在25℃温度下，将硼酸溶解于蒸馏水中至有结晶析出，所得为硼酸的饱和溶液；用质量浓度30%碳酸钠溶液调节饱和硼酸溶液pH值为6.9；按氯化钙质量浓度2.5%，将氯化钙加入到硼酸饱和溶液中。
（6）将步骤（4）聚乙烯醇-海藻酸钠溶液与步骤（3）中菌液按照体积比1:2混合，在39℃下搅拌均匀，然后滴加入步骤（5）溶液中，在4℃下固定化交联30h，得到溶藻细菌微球。
（7）将上述制备的5000个直径为8mm的溶藻细菌微球填充于镂空容器，直接投入藻细胞密度为1.20×1010个/L的5L水华微囊藻水中，6天后，微球的溶藻率为58%，20天后，微球的溶藻率为91%。
实施例4
（1）配制无菌液体培养基，组成为：氯化钠5g、蛋白胨10g、牛肉膏5g，用1mol/L氢氧化钠或1mol/L盐酸溶液调pH至7.4，在120℃、110kPa下灭菌30min。
（2）将溶藻细菌短波单胞菌（Brevundimonas olei，CGMCC No.11572）接种于步骤（1）溶液中，于37℃下培养96h，得到培养菌液。
（3）将步骤（2）中培养菌液在4800r/min条件下离心10min，将所获得菌体细胞重悬于原取样体积45%的步骤（1）中培养基。
（4）配制质量分数10%的聚乙烯醇溶液，海藻酸钠的质量浓度为1.0%，配制于蒸馏水中，先加入聚乙烯醇，再加入海藻酸钠，在88℃下溶解，并保持溶液最终温度为36℃。
（5）在27℃温度下，将硼酸溶解于蒸馏水中至有结晶析出，所得为硼酸的饱和溶液；用质量浓度20%碳酸钠溶液调节溶液pH值为7.0；按氯化钙质量浓度2.0%，将氯化钙加入到硼酸饱和溶液中。
（6）将步骤（4）聚乙烯醇-海藻酸钠溶液与步骤（3）中菌液按照体积比1:1混合，在37℃下搅拌均匀，然后滴加入步骤（5）溶液中，在4℃下固定化交联24h，得到溶藻细菌微球。
（7）将上述制备的60000个直径为15mm的溶藻细菌微球填充于镂空容器，直接投入藻细胞密度为4.50×1010个/L的20L放射微囊藻水中，6天后，微球的溶藻率为72%，20天后，微球的溶藻率为95%。
实施例5
（1）配制无菌液体培养基，组成为：氯化钠5g、蛋白胨10g、牛肉膏5g，用1mol/L氢氧化钠或1mol/L盐酸溶液调pH至7.2，在120℃、110kPa下灭菌30min。
（2）将溶藻细菌短波单胞菌（Brevundimonas olei，CGMCC No.11572）接种于步骤（1）溶液中，于37℃下培养92h，得到培养菌液。
（3）将步骤（2）中培养菌液在4800r/min条件下离心10min，将所获得菌体细胞重悬于原取样体积50%的步骤（1）中培养基。
（4）配制质量分数10%的聚乙烯醇溶液，海藻酸钠的质量浓度为1.0%，配制于蒸馏水中，先加入聚乙烯醇，再加入海藻酸钠，在90℃下溶解，并保持溶液最终温度为35℃。
（5）在27℃温度下，将硼酸溶解于蒸馏水中至有结晶析出，所得为硼酸的饱和溶液；用质量浓度30%碳酸钠溶液调节饱和硼酸溶液pH值为7.0；按氯化钙质量浓度1.5%，将氯化钙加入到硼酸饱和溶液中。
（6）将步骤（4）聚乙烯醇-海藻酸钠溶液与步骤（3）中菌液按照体积比1:1混合，在38℃下搅拌均匀，然后滴加入步骤（5）溶液中，在4℃下固定化交联16h，得到溶藻细菌微球。
（7）将上述制备的4000个直径为5mm的溶藻细菌微球填充于镂空容器，直接投入藻细胞密度为3.62×109个/L的15L坚实微囊藻水中，6天后，微球的溶藻率为62%，20天后，微球的溶藻率为88%。
实施例6
（1）配制无菌液体培养基，组成为：氯化钠5g、蛋白胨10g、牛肉膏5g，用1mol/L氢氧化钠或1mol/L盐酸溶液调pH至7.5，在120℃、110kPa下灭菌30min。
（2）将溶藻细菌短波单胞菌（Brevundimonas olei，CGMCC No.11572）接种于步骤（1）溶液中，于37℃下培养72h，得到培养菌液。
（3）将步骤（2）中培养菌液在4800r/min条件下离心10min，所获得菌体细胞重悬于原取样体积60%的步骤（1）中培养基。
（4）配制质量分数10%的聚乙烯醇溶液，海藻酸钠的质量浓度为0.50%，配制于蒸馏水中，先加入聚乙烯醇，再加入海藻酸钠，在88℃下溶解，并保持溶液最终温度为37℃。
（5）在25℃温度下，将硼酸溶解于蒸馏水中至有结晶析出，所得为硼酸的饱和溶液；用质量浓度10%碳酸钠溶液调节饱和硼酸溶液pH值为7.2；按氯化钙质量浓度2.0%，将氯化钙加入到硼酸饱和溶液中。
（6）将步骤（4）聚乙烯醇-海藻酸钠溶液与步骤（3）中菌液按照体积比1:2混合，在36℃下搅拌均匀，然后滴加入步骤（5）溶液中，在4℃下固定化交联20h，得到溶藻细菌微球。
（7）将上述制备的60000个直径为3mm的溶藻细菌微球填充于镂空容器，直接投入藻细胞密度为1.50×1011个/L的15L鱼害微囊藻水中，7天后，微球的溶藻率为62%，20天后，微球的溶藻率为98%。
实施例7
（1）配制无菌液体培养基，组成为：氯化钠5g、蛋白胨10g、牛肉膏5g，用1mol/L氢氧化钠或1mol/L盐酸溶液调pH至7.4，在120℃、110kPa下灭菌30min。
（2）将溶藻细菌黏着剑菌（Ensifer adhaerens，CGMCC No.12458）接种于步骤（1）溶液中，于28℃下培养96h，得到培养菌液。
（3）将步骤（2）中培养菌液在4800r/min条件下离心10min，所获得菌体细胞重悬于原取样体积40%的步骤（1）中培养基。
（4）配制质量分数10%的聚乙烯醇溶液，海藻酸钠的质量浓度为1.0%，配制于蒸馏水中，先加入聚乙烯醇，再加入海藻酸钠，在90℃下溶解，并保持溶液最终温度为28℃。
（5）在25℃温度下，将硼酸溶解于蒸馏水中至有结晶析出，所得为硼酸的饱和溶液；用质量浓度30%碳酸钠溶液调节饱和硼酸溶液pH值为6.9；按氯化钙质量浓度2.5%，将氯化钙加入到硼酸饱和溶液中。
（6）将步骤（4）聚乙烯醇-海藻酸钠溶液与步骤（3）中菌液按照体积比1:1混合，在35℃下搅拌均匀，然后滴加入步骤（5）溶液中，在4℃下固定化交联24h，得到溶藻细菌微球。
（7）将上述制备的50000个直径为4mm的溶藻细菌微球填充于镂空容器，直接投入藻细胞密度为4.53×1010个/L的15L挪氏微囊藻水中，7天后，微球的溶藻率为62%，20天后，微球的溶藻率为94%。
实施例8
（1）配制无菌液体培养基，组成为：氯化钠5g、蛋白胨10g、牛肉膏5g，用1mol/L氢氧化钠或1mol/L盐酸溶液调pH至7.4，120℃、110kPa下灭菌30min。
（2）将溶藻细菌粪产碱菌（Alcaligenes faecalis，CGMCC No.12457）接种于步骤（1）溶液中，于37℃下培养90h，得到培养菌液。
（3）将步骤（2）中培养菌液在4800r/min条件下离心10min，所获得菌体细胞重悬于原取样体积50%的步骤（1）中培养基。
（4）配制质量分数12%的聚乙烯醇溶液，海藻酸钠的质量浓度为0.25%，配制于蒸馏水中，先加入聚乙烯醇，再加入海藻酸钠，在86℃下溶解，并保持溶液最终温度为40℃。
（5）在28℃温度下，将硼酸溶解于蒸馏水中至有结晶析出，所得为硼酸的饱和溶液；用质量浓度15%碳酸钠溶液调节溶液pH值为6.8；按氯化钙质量浓度2.0%，将氯化钙加入到硼酸饱和溶液中。
（6）将步骤（4）聚乙烯醇-海藻酸钠溶液与步骤（3）中菌液按照体积比1:2混合，在40℃下搅拌均匀，然后滴加入步骤（5）溶液中，在4℃下固定化交联32h，得到溶藻细菌微球。
（7）将上述制备的360000个直径为10mm的溶藻细菌微球填充于镂空容器，直接投入藻细胞密度为3.50×1012个/L的5L假丝微囊藻水中，5天后，微球的溶藻率为53%，20天后，微球的溶藻率为95%。
实施例9
（1）配制无菌液体培养基，组成为：氯化钠5g、蛋白胨10g、牛肉膏5g，用1mol/L氢氧化钠或1mol/L盐酸溶液调pH至7.2，120℃、110kPa下灭菌30min。
（2）将溶藻细菌粪产碱菌（Alcaligenes faecalis，CGMCC No.12457）接种于步骤（1）溶液中，于37℃下培养80h，得到培养菌液。
（3）将步骤（2）中培养菌液在4800r/min条件下离心10min，所获得菌体细胞重悬于原取样体积50%的步骤（1）中培养基。
（4）配制质量分数10%的聚乙烯醇溶液，海藻酸钠的质量浓度为0.50%，配制于蒸馏水中，先加入聚乙烯醇，再加入海藻酸钠，在88℃下溶解，并保持溶液最终温度为37℃。
（5）在28℃温度下，将硼酸溶解于蒸馏水中至有结晶析出，所得为硼酸的饱和溶液；用质量浓度30%碳酸钠溶液调节饱和硼酸溶液pH值为6.9；按氯化钙质量浓度2.0%，将氯化钙加入到硼酸饱和溶液中。
（6）将步骤（4）聚乙烯醇-海藻酸钠溶液与步骤（3）中菌液按照体积比1:2混合，在38℃下搅拌均匀，然后滴加入步骤（5）溶液中，在4℃下固定化交联24h，得到溶藻细菌微球。
（7）将上述制备的2000个直径为5mm的溶藻细菌微球填充于镂空容器，直接投入藻细胞密度为8.52×108个/L的50L史密斯微囊藻水中，3天后，微球的溶藻率为67%，20天后，微球的溶藻率为93%。
实施例10
（1）配制无菌液体培养基，组成为：氯化钠5g、蛋白胨10g、牛肉膏5g，用1mol/L氢氧化钠或1mol/L盐酸溶液调pH至7.3，120℃、110kPa下灭菌30min。
（2）将溶藻细菌粪产碱菌（Alcaligenes faecalis，CGMCC No.12457）接种于步骤（1）溶液中，于37℃下培养90h，得到培养菌液。
（3）将步骤（2）中培养菌液在4800r/min条件下离心10min，所获得菌体细胞重悬于原取样体积40%的步骤（1）中培养基。
（4）配制质量分数11%的聚乙烯醇溶液，海藻酸钠的质量浓度为0.25%，配制于蒸馏水中，先加入聚乙烯醇，再加入海藻酸钠，在86℃下溶解，并保持溶液最终温度为40℃。
（5）在25℃温度下，将硼酸溶解于蒸馏水中至有结晶析出，所得为硼酸的饱和溶液；用质量浓度20%碳酸钠溶液调节饱和硼酸溶液pH值为7.0；按氯化钙质量浓度2.0%，将氯化钙加入到硼酸饱和溶液中。
（6）将步骤（4）聚乙烯醇-海藻酸钠溶液与步骤（3）中菌液按照体积比1:2混合，在37℃下搅拌均匀，然后滴加入步骤（5）溶液中，在4℃下固定化交联16h，得到溶藻细菌微球。
（7）将上述制备的2000个直径为8mm的溶藻细菌微球填充于镂空容器，直接投入藻细胞密度为1.50×109个/L的50L惠氏微囊藻水中，4天后，微球的溶藻率为51%，20天后，微球的溶藻率为88%。

Claims (9)

1.一种溶藻细菌微球的固定化制备和应用，其特征在于，包括以下步骤：
（1）配制无菌液体培养基；
（2）将溶藻细菌接种于步骤（1）溶液中，培养，得到培养菌液；
（3）将步骤（2）培养菌液中的菌体细胞分离，并重悬于溶液（1）中；
（4）配制聚乙烯醇-海藻酸钠溶液；
（5）配制氯化钙-硼酸交联剂；
（6）将步骤（4）中溶液与步骤（3）中菌液混合，滴加入步骤（5）溶液中，固定化交联得到溶藻细菌微球。
2.如权利要求1所述的方法，步骤（1）中培养基为牛肉膏蛋白胨培养基，组成为：氯化钠5g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏5g/L，配制于蒸馏水中，pH值为7.2-7.5。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中溶藻细菌为缺陷短波单胞菌（Brevundimonas diminuta，CGMCC No.11571）、短波单胞菌（Brevundimonas olei，CGMCCNo.11572）、黏着剑菌（Ensifer adhaerens，CGMCC No.12458）和粪产碱菌（Alcaligenes faecalis，CGMCC No.12457），培养温度为28-37℃下，培养时间为48-96小时，优选60-80小时。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中菌液分离后所获得的菌体细胞重悬于原取样体积20-80%的培养基中，优选40-60%。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）中聚乙烯醇的质量浓度为10-12%，海藻酸钠质量浓度为0.25-1.0%，先在蒸馏水中加入聚乙烯醇，再加入海藻酸钠，在80-90℃下溶解，并保持溶液最终温度为25-40℃。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（5）中，用质量浓度15-30%碳酸钠溶液调节硼酸饱和溶液pH值为6.7-7.2，加入氯化钙，使其质量浓度为1.5-2.5%。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（6）中聚乙烯醇-海藻酸钠溶液与步骤（3）中菌液的体积比2:1-1:1，在35-40℃下搅拌均匀，并在4℃下固定化交联16-32小时，优选20-24小时。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述藻类为蓝藻中的微囊藻属，优选铜绿微囊藻、中华微囊藻、水华微囊藻、放射微囊藻、坚实微囊藻、鱼害微囊藻、挪氏微囊藻、假丝微囊藻、史密斯微囊藻、绿色微囊藻、惠氏微囊藻。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，使用时，将溶藻细菌微球填充于镂空容器中，直接投放于含藻水体中。
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