CN110272889A - 溶藻微生物微球及其制备方法和应用 - Google Patents

溶藻微生物微球及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种溶藻微生物微球及其制备方法和应用，步骤包括：将溶藻微生物接种到配制好的培养基中进行培养，得到活化的溶藻微生物的活化菌液，溶藻微生物为巴西弧菌H115或黄杆菌；将溶藻微生物的活化菌液加入离心管中进行离心，弃去上清液；接着向离心管中滴入无机溶剂进行重新悬浮，得到溶藻微生物的重悬菌液；在步骤(2)中的离心管中分别加入30‑80目的玉米芯粉末或秸秆粉末，再加入固定化材料进行混合得到混合菌液；在步骤(3)得到的混合菌液中滴入质量分数为2％‑4％的CaCl2溶液进行交联形成溶藻微生物微球，并将其应用在海洋赤潮控制与治理中。本发明的溶藻微生物微球具有良好的悬浮性和稳定性，且具备溶藻效率高、环境适用性强、无二次污染风险等优点。

Description

溶藻微生物微球及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及海洋生态环境环保领域，尤其涉及一种溶藻微生物微球及其制备方法和应用。
背景技术
赤潮是全球范围内严重的海洋生态环境灾害，已经引起社会各界的广泛关注。由于近年来，沿海污染加剧，导致赤潮频繁爆发，当赤潮藻类大量繁殖时，藻的光合作用消耗了大量的CO2，导致水体的酸碱度发生改变，影响了海洋生物的正常生命活动，同时，由于赤潮生物覆盖在水上层，使阳光很难到达水体深处，降低水体的透明度，导致底层的水草、珊瑚礁及以水草为主食的海洋动物死亡，生物多样性锐减。因此，海域一旦发生富营养化，海洋生态系统的生物种群会发生大变化，生态平衡便被打乱。特别是某些有毒赤潮藻种的爆发，不仅仅会毒害海洋生物，还会对人类健康造成危害，并造成巨大的经济损失。因此，急需研究出一种区别于传统的物理法和化学法的新型而高效的控制赤潮的方法，才能解决当前的赤潮问题。
与传统的物理方法和化学方法相比较，利用生物特别是某些具有杀藻作用的微生物控制赤潮的方法具有高效、安全及专一性强等优点，得到学术界越来越多的关注和研究。利用海洋中具有杀藻作用的微生物可使海洋生态环境保持动态平衡，并能实现对赤潮的预防和控制的目的。其中溶藻细菌作为一种能够通过直接或间接方式来实现对藻类的灭活或溶解被越来越多的学者所关注，许多研究表明有害藻类的生长和消亡与自然水体中存在的某些溶藻细菌有关。溶藻细菌是海洋生态系统中的重要组成部分，能有效维持藻华的生物量平衡。
其中，通过固定化微生物的方法得到新的发展，固定化微生物细胞的方法主要有包埋法、吸附法、共价结合法和交联法等。相比于直接抛洒菌体或者发酵物，固定化微生物处理技术用于杀藻处理中具有处理效果好，运行稳定，可纯化和保持高效优势菌种的优点，但是目前的吸附法固定微生物容易脱落，抗冲击性差，不利于重复使用，且在海洋中，海水的流动性大，容易被冲击，稳定性差，且不能长期地悬浮在海面上，因此，溶藻持续性差和溶藻效果均较差。
发明内容
针对上述技术中存在的不足之处，本发明提供一种溶藻微生物微球及其制备方法和应用，得到的溶藻微生物微球具有良好的悬浮性，且应用于海洋近海海域中，具有良好的微藻赤潮的防控和杀灭的效果。
本发明提供的一种溶藻微生物微球的制备方法，该方法包括：
(1)将溶藻微生物接种到配制好的培养基中进行培养，得到活化的溶藻微生物的活化菌液，所述溶藻微生物为巴西弧菌H115或黄杆菌；
(2)将溶藻微生物的活化菌液加入离心管中进行离心，弃去上清液；接着向离心管中滴入无机溶剂进行重新悬浮，得到溶藻微生物的重悬菌液；
(3)在步骤(2)中的离心管中分别加入30-80目的玉米芯粉末或秸秆粉末，再加入固定化材料进行混合得到混合菌液；
(4)在步骤(3)得到的混合菌液中滴入质量分数为2％-4％的CaCl2溶液，保持60-120r/min、交联18-24h形成微球；
(5)将步骤(4)中交联好的微球放在30-42℃的烘箱中10-20h烘干，得到固定化的巴西弧菌H115微球或黄杆菌微球。
其中，所述步骤(1)的培养条件为：接种到配制好的100ml2216E培养基中，在30℃、180r/min的摇床中培养12h。
其中，所述步骤(2)中的无机溶剂为超纯水、生理盐水和灭菌海水的其中一种。
其中，所述步骤(2)中的无机溶剂为生理盐水。
其中，步骤(3)中所述玉米芯粉末或秸秆粉末为30目。
其中，在步骤(2)中，所述玉米芯粉末或秸秆粉末与溶藻微生物的质量比为：3％-7％：3％-8％。
其中，在步骤(2)中，所述固定化材料为质量分数为1％-3％的海藻酸钠。
本发明还提供一种将加溶藻微生物微球在海洋赤潮的控制与治理中应用。
本发明的有益效果是：与现有技术相比，本发明提供的溶藻微生物微球及其制备方法和应用，具有以下有益效果：
(1)本发明所提供的溶藻微生物微球具有悬浮性好，性能稳定，且溶藻效率高、环境适用性强、无二次污染风险等优点；
(2)本发明的溶藻微生物微球对溶藻巴西弧菌和黄杆菌等功能菌具有保护作用，避免溶藻巴西弧菌和黄杆菌完全暴露在海洋的赤潮污染环境中，使溶藻巴西弧菌和黄杆菌污水冲击性提高，确保海洋赤潮处理工艺的稳定。
附图说明
图1为本发明的实施1得到的溶藻微生物微球1的成型图
图2为本发明的实施2得到的溶藻微生物微球1的成型图；
图3为本发明的溶藻微球1-4，对照例1-2的悬浮率的折线图；
图4为本发明的溶藻微球1-4，对照例1的杀藻率的折线图；
图5为本发明的哈卡藻存活状态下的电镜图；
图6为本发明的哈卡藻溶解状态下的电镜图；
图7为本发明测试一的杀藻率的的折线图；
图8为本发明测试二的杀藻率的的折线图。
具体实施方式
为了更清楚地表述本发明，下面结合附图对本发明作进一步地描述。
本发明的一种溶藻微生物微球，该方法包括：
(1)将溶藻微生物接种到配制好的培养基中进行培养，得到活化的溶藻微生物的活化菌液；
(2)将溶藻微生物的活化菌液加入离心管中进行离心，弃去上清液；接着向离心管中滴入无机溶剂进行重新悬浮，得到溶藻微生物的重悬菌液；
(3)在步骤(2)中的离心管中分别加入30-80目的玉米芯粉末或秸秆粉末，再加入固定化材料进行混合得到混合菌液；
(4)在步骤(3)得到的混合菌液中滴入质量分数为2％-4％的CaCl2溶液，保持60-120r/min、交联18-24h形成微球；
(5)将步骤(4)中交联好的微球放在30-42℃的烘箱中10-20h烘干，得到固定化的溶藻微生物微球。
优选地，在步骤(1)的溶藻微生物为溶藻巴西弧菌或黄杆菌的其中一种，溶藻巴西弧菌的保藏编号为M2015093，黄杆菌的保藏编号为M2017262，这两种弧菌均具有溶藻能力，但是单纯地将溶藻巴西弧菌或黄杆菌投放到海洋中，容易流失，本发明将溶藻巴西弧菌或黄杆菌以玉米芯或秸秆粉末为载体，先将溶藻巴西弧菌或黄杆菌接种到配制好的100ml2216E培养基中，在30℃、180r/min的摇床中培养12h，得到活化的溶藻微生物的活化菌液，再通过固定化材料进行固定、交联后形成微球，使其稳定性更好；而且玉米芯或秸秆粉末大小对最后形成的微球的悬浮性具有一定的影响，最优选地将玉米芯或秸秆粉碎至目数为30-80目，最佳为30目，玉米芯粉末或秸秆粉末与溶藻微生物的质量比为：3％-7％：3％-8％；进一步地，固定化材料为质量分数为1％-3％海藻酸钠，海藻酸钠简称为SA,是天然壁材中应用最广泛的一种，SA的凝胶过程温和，同时具有良好的生物相容性，使它使用于包埋药物、微生物培养、固定化酶、蛋白质类物质。SA主要是从海洋大型藻类-褐藻中提取，其结构主要单元分为古洛糖醛酸和甘露糖醛酸，这两个单元通过糖苷键相连接聚合成高分子聚合物，SA的结构单元中含有的大量的羧基和羟基，容易与二价阳离子凝合成胶球，将交联剂定为CaCl2溶液，将海藻酸钠溶液缓慢滴进CaCl2中，使Ca2+与SA反应固化，同时溶液中H+也会渗透胶囊内部，与CaCO3的CO3 2-反应生成CO2气泡，这样更多的Ca2+与SA结合，使胶囊球内部彻底固化，使固定后的溶藻微球稳定性更好；
具体地，将制备好的溶藻微生物微球应用在海洋赤潮的控制与治理的当中，由于海洋中的自然环境海水冲击力度大，本发明将溶藻微生物进行固定化后，具有良好的稳定性及悬浮率，且保证了溶藻微生物自身具有的杀藻性，即保证溶藻微生物的存活率，具有良好的抗冲击能力，使得本发明的经过固定化的溶藻微生物能够应用在海洋赤潮控制与治理的当中。
观察不同目数的载体对悬浮性及溶藻效果的影响，具体通过以下实施例体现：
实施例1：
前培养：将H115菌种从-80℃冰箱中取出，接种到配制好的100ml2216E培养基中，在30℃、180r/min的摇床中培养12h，得到前培养的H115菌种；
主培养：将前培养的H115菌液分别用移液器取出1ml加入到4瓶100ml 2216E培养基中，在37℃、180r/min的摇床中培养24h，并分别编号为①、②、③和④；
重悬：将主培养的H115菌液①分两次装入50ml的离心管中，在10000r/min的条件下离心10min，接着滴入20ml生理盐水进行重新悬浮，得到重悬菌液①；
混合菌液的配制：在装有重悬菌液①的离心管中加入1g 20目玉米芯，同时，离心管中加入0.3g海藻酸钠，在180r/min的摇床中30min，使之混合均匀，得到混合菌液①；
固化剂的配制:称取30gCaCl2固体溶入1L超纯水中，配制成3％的CaCl2溶液；
固定化：在烧杯中加入200ml的CaCl2溶液，并加入转子，调节转速在80r/min。取一50ml的针管，去掉针头吸取配制好的混合菌液①，缓慢滴加到CaCl2溶液中，待完全滴入后，保持80r/min，交联20h，得到交联后的溶藻微球①；
烘干：将交联好的微球①放在40℃的烘箱中12h烘干，得到溶藻微生物微球1。
实施例2
重悬：将实施例1中主培养的H115菌液②分两次装入50ml的离心管中，在10000r/min的条件下离心10min，弃去上清液，在离心管中滴入20ml生理盐水进行重新悬浮，得到重悬菌液②；
混合菌液的配制：在装有重悬菌液②的离心管中加入1g 30目玉米芯，同时，在离心管中加入0.3g海藻酸钠，在180r/min的摇床中30min，使之混合均匀，得到混合菌液②；
固化剂的配制:称取30gCaCl2固体溶入1L超纯水中，配制成3％的CaCl2溶液；
固定化：在烧杯中加入200ml的CaCl2溶液，并加入转子，调节转速在80r/min。取一50ml的针管，去掉针头吸取配制好的混合菌液②，缓慢滴加到CaCl2溶液中，待完全滴入后，保持80r/min，交联20h，得到交联好的微球②；
烘干：将交联好的微球②放在40℃的烘箱中12h烘干，得到溶藻微生物微球2。
实施例3
重悬：将实施例1中主培养的H115菌液③分两次装入50ml的离心管中，在10000r/min的条件下离心10min，弃去上清液，在离心管中滴入20ml生理盐水进行重新悬浮，得到重悬菌液③；
混合菌液的配制：在装有重悬菌液③的离心管中加入1g 60目玉米芯，同时，离心管中加入0.3g海藻酸钠，在180r/min的摇床中30min，使之混合均匀，得到混合菌液③；
固化剂的配制:称取30g CaCl2固体溶入1L超纯水中，配制成3％的CaCl2溶液；
固定化：在烧杯中加入200ml的CaCl2溶液，并加入转子，调节转速在80r/min。取一50ml的针管，去掉针头吸取配制好的混合菌液③，缓慢滴加到CaCl2溶液中，待完全滴入后，保持80r/min，交联20h，得到交联好的微球③；
烘干：将交联好的微球③放在40℃的烘箱中12h烘干，得到溶藻微生物微球3。
实施例4
重悬：将实施例1中主培养的H115菌液④分两次装入50ml的离心管中，在10000r/min的条件下离心10min，弃去上清液，在离心管中分别加入20ml生理盐水进行重新悬浮，得到重悬菌液④；
混合菌液的配制：在装有重悬菌液④的离心管中加入1g 80目玉米芯，同时，离心管中加入0.3g海藻酸钠，在180r/min的摇床中30min，使之混合均匀，得到混合菌液④；
固化剂的配制:称取30g CaCl2固体溶入1L超纯水中，配制成3％的CaCl2溶液；
固定化：在烧杯中加入200ml的CaCl2溶液，并加入转子，调节转速在80r/min。取一50ml的针管，去掉针头吸取配制好的混合菌液④，缓慢滴加到CaCl2溶液中，待完全滴入后，保持80r/min，交联20h，得到交联好的微球④；
烘干：将交联好的微球④放在40℃的烘箱中12h烘干，得到溶藻微生物微球4。
对照例1
在50ml的离心管中加入20ml生理盐水；
混合液的配制：在装有生理盐水的离心管中加入1g 60目玉米芯，同时，离心管中加入0.3g海藻酸钠，在180r/min的摇床中30min，使之混合均匀，得到混合液；
固化剂的配制:称取30g CaCl2固体溶入1L超纯水中，配制成3％的CaCl2溶液；
固定化：在烧杯中加入200ml的CaCl2溶液，并加入转子，调节转速在80r/min。取一50ml的针管，去掉针头吸取配制好的混合液，缓慢滴加到CaCl2溶液中，待完全滴入后，保持80r/min，交联20h，得到交联后的对照微球；
烘干：将交联好的对照微球放在40℃的烘箱中12h烘干，得到对照微球1。
对照例2
前培养：将H115菌种从-80℃冰箱中取出，接种到配制好的100ml2216E培养基中，在30℃、180r/min的摇床中培养12h，得到前培养的H115菌种；
主培养：将前培养的H115菌液分别用移液器取出1ml加入到4瓶100ml 2216E培养基中，在37℃、180r/min的摇床中培养24h得到主培养的活化H115菌液；
重悬：将主培养的H115菌液分两次装入50ml的离心管中，在10000r/min的条件下离心10min，接着滴入20ml生理盐水进行重新悬浮，得到重悬菌液；
混合菌液的配制：在装有重悬菌液的离心管中加入0.3g海藻酸钠，在180r/min的摇床中30min，使之混合均匀，得到混合菌液；
固化剂的配制:称取30gCaCl2固体溶入1L超纯水中，配制成3％的CaCl2溶液；
固定化：在烧杯中加入200ml的CaCl2溶液，并加入转子，调节转速在80r/min。取一50ml的针管，去掉针头吸取配制好的混合菌液，缓慢滴加到CaCl2溶液中，待完全滴入后，保持80r/min，交联20h，得到交联后的溶藻微球；
烘干：将交联好的微球放在40℃的烘箱中12h烘干，得到对照微球2。
对悬浮率的测定：取实施例1-4、对比例1-2的100颗微球置于烧杯各加入40ml海水，观察各烧杯中微球的沉浮情况，结果见后附图3，对照例2未加玉米芯的干燥的对照微球2不具有悬浮性；实施例1-4的溶藻微生物微球相比，随着玉米芯目数增加，悬浮率降低，而实施例2的玉米芯目数太低,存在长条形玉米芯屑,虽能固定成型,但在固定过程中容易出现残次片品,成球率低,如附图1，而实施例3的溶藻微生物微球如附图2，成球性好，且结合附图3具有良好的悬浮率；其中实施例3的60目玉米芯包菌微球和对比例1的60目玉米芯空白微球相比，悬浮率有所下降，虽然由于菌的重量增加了微球的质量，但是仍然具有良好的悬浮率，满足悬浮在海面上的要求；
对溶藻率的测定：取对数期的哈卡藻藻液和海洋水体各20ml于烧杯中，哈卡藻是海洋中最常见的一种藻类，其在电镜下的图像见附图4，溶解后的图像如附图5，向烧杯中添加实施例1-4、对比例1-2的100颗微球，实验时间为48h，试验期间不再投加固定化溶藻微生物，结果如附图6所述；固定后的对比例2的空白微球不具有杀藻效果；实施例2的30目玉米芯包菌微球、实施例3的60目玉米芯包菌微球和实施例4的80目玉米芯包菌微球均具有较好的杀藻效果，其中实施例2的30目玉米芯包菌微球和实施例3的80目玉米芯包菌微球较为最好，而实施例1的20目的玉米芯的悬浮率也较差；对比例1的60目玉米芯空白微球也具有一定的杀藻效果，可能由于加入玉米芯固定化后，微球对哈卡藻有一定的吸附作用；
结合悬浮率和杀藻率来看，实施例2的30目玉米芯包菌微球达到最佳的效果，是最适选择。
关于重悬步骤中无机溶剂对悬浮率和杀藻率的影响：
实施例5
将实施例2中的重悬步骤中的无机溶剂改为超纯水，其他步骤和条件与实施例1相同，固化后得到得到固定化的溶藻微生物微球5。
实施例6
将实施例2中的重悬步骤中的无机溶剂改为灭菌海水，其他步骤和条件与实施例1相同，固化后得到固定化的溶藻微生物微球6。
实施例7
将实施例2中的重悬步骤中的无机溶剂改为100ml 2216E培养基，其他步骤和条件与实施例1相同，固化后得到得到固定化的溶藻微生物微球7。
杀藻率的测试：
测试1，对溶藻率的测定：取对数期的50ml哈卡藻藻液于烧杯中，向烧杯中添加0.5g对照例1、实施例2、实施例5-7的固定化的对照微球1、溶藻微生物微球2、5-7，在不同的时间测试杀藻率，结果见附图7及下表1所示：
测试2，对溶藻率的测定：取对数期的50ml哈卡藻藻液于烧杯中，向烧杯中添加1.5g对照例1实施例2、实施例5-8的固定化的溶藻微球2、5-8，在不同的时间测试杀藻率，结果见附图8及下表二所示：
溶藻微球2 溶藻微球5 溶藻微球6 溶藻微球7 对照微球1
0min 0％ 0％ 0％ 0％ 0％
10min 79％ 83％ 80％ 67％ 14％
30min 85％ 90％ 86％ 77％ 18％
60min 100％ 100％ 100％ 100％ 19％
在实施例2、5-7的固定化的溶藻微生物微球均具有不错的杀藻效果，加入12h后可达到100％的杀藻率，其中生理盐水为最佳无机溶剂；测试一中，显微镜下能观察到有物质不断从微球中释放出来，且30min即可达到90％的杀藻率(一般杀藻率能达到90％即为很强的杀藻效果)，说明固定的H115菌体微球属于急速作用物质；从测试一和二中可以看出，微球中H115菌体产生的活性物质在微球中缓慢释放，且活性物质在藻液中的扩散需要一定的时间，当释放的活性物质达到一定浓度时，杀藻率可达到100％；而测试二相比于测试一，加入的溶藻微球的质量增加，前期的溶藻效果相应较好，但最终测试一和测试一均能达到100％。
测试3，固定化的溶藻微球的杀菌持久性
分别取1ml的哈卡藻液加入到三个10ml的烧杯中，编号为烧杯1-3，往烧杯1中加入经实施例2固定化的保存当天的溶藻微球、往烧杯1中加入经实施例2固定化的保存1个月后的溶藻微球，烧杯3的哈卡藻液作为空白对照，观察0-120min，哈卡藻液的存活情况如下：
从上表可以看出固定后的溶藻微球，在放置约60天后仍具有很好的杀藻效果，因此，固定化后的溶藻微球可存放较长时间，方便随时取用，而不需现在制备，满足市场的需求。
以上公开的仅为本发明的一个或几个具体实施例，但是本发明并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种溶藻微生物微球的制备方法，其特征在于，该方法包括：
(1)将溶藻微生物接种到配制好的培养基中进行培养，得到活化的溶藻微生物的活化菌液，所述溶藻微生物为巴西弧菌H115或黄杆菌；
(2)将溶藻微生物的活化菌液加入离心管中进行离心，弃去上清液；接着向离心管中滴入无机溶剂进行重新悬浮，得到溶藻微生物的重悬菌液；
(3)在步骤(2)中的离心管中分别加入30-80目的玉米芯粉末或秸秆粉末，再加入固定化材料进行混合得到混合菌液；
(4)在步骤(3)得到的混合菌液中滴入质量分数为2％-4％的CaCl2溶液，保持60-120r/min、交联18-24h形成溶藻微生物微球。
2.根据权利要求1所述的溶藻微生物微球的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)的培养条件为：接种到配制好的100ml2216E培养基中，在30℃、180r/min的摇床中培养12h。
3.根据权利要求1所述的溶藻微生物微球的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中的无机溶剂为超纯水、生理盐水和灭菌海水的其中一种。
4.根据权利要求3所述的溶藻微生物微球的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中的无机溶剂为生理盐水。
5.根据权利要求1所述的溶藻微生物微球的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述玉米芯粉末或秸秆粉末为30目。
6.根据权利要求1所述的溶藻微生物微球的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述玉米芯粉末或秸秆粉末与溶藻微生物的质量比为：3％-7％：3％-8％。
7.根据权利要求1所述的溶藻微生物微球的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述固定化材料为质量分数为1％-3％的海藻酸钠。
8.根据权利要求1所述的溶藻微生物微球的制备方法，在步骤(4)得到溶藻微生物微球后，还包括：将步骤(4)中交联好的微球放在30-42℃的烘箱中10-20h烘干，得到干燥的巴西弧菌H115微球或黄杆菌微球。
9.一种权利要求1-8任一项所述制备方法得到的溶藻微生物微球。
10.一种如权利要求9所述的溶藻微生物微球的应用，其特征在于，所述的溶藻微生物微球在海洋赤潮控制与治理中的应用。
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