CN106834264A - 一种实验室用细菌固定化方法 - Google Patents

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Abstract

一种实验室用细菌固定化方法，涉及一种细菌固定化方法。本发明是要解决现有方法中菌体包埋量较低，细菌固定化颗粒的稳定性差，连续反应系统难以长期运行的问题。方法：一、进行细菌培养得到菌液；二、将菌液离心，获得用于固定化的菌体；三、将菌体用生理盐水分散，加入聚乙烯醇溶液混合，获得PVA‑菌体混合溶液；四、使用细菌固定化反应装置进行反应，得到细菌固定化颗粒；五、将步骤四得到的细菌固定化颗粒放入冰水中静置，即完成。本发明方法显著提高了固定化颗粒中菌体的包埋量，可达到15～20g/L，而且能够很好的成型，不破裂、不粘连。固定化颗粒稳定性好，此细菌固定化颗粒用于连续发酵系统时，系统可以稳定至少2个月。本发明用于细菌固定化。

Description

一种实验室用细菌固定化方法
技术领域
本发明涉及一种细菌固定化方法。
背景技术
随着连续发酵的研究及工业应用进程的快速发展，以固定化技术的出现作为分界线可划分为游离细胞的连续发酵时期和固定化细胞的连续发酵时期。游离细胞的连续发酵体系由于游离细胞不断随发酵液排出系统，造成发酵罐中菌体浓度较低，使得发酵所需时间较长，生产速度减慢。而使用固定化细胞进行的连续发酵有效解决了游离细胞连续发酵过程中菌体浓度低、发酵时间长、菌体易被冲走的缺点，从而提高了连续流系统中的菌体浓度。
微生物固定化技术(Immobilized Microorganism Technology)是从20世纪60年代发展起来的一项新技术。它是通过物理或化学手段，将游离细胞或酶定位在某一特定空间范围内，保留其固定的催化活性，且能够被重复和连续使用的现代生物工程技术。微生物固定化技术可以大幅度地提高生物反应器内微生物量，增强其对不利环境或发酵抑制物的耐受程度。发酵细菌通过细胞固定化能够使系统中的发酵菌体不易流失，保持活性高进而提高耐受程度、生产速率、产品浓度等，既而提高生产效率和降低产品纯化难度。
微生物细胞的固定化方法包括吸附法、交联法、包埋法和共价结合法。吸附法是利用吸附载体与微生物细胞之间的物理相互作用力将其吸附在载体表面。影响两者之间吸附的主要因素是微生物细胞壁的组成，带电性质以及载体的组分，所以吸附法存在微生物细胞与载体结合不牢，容易脱落的缺点。共价结合法是细胞表面上功能团和固相支持物表面的反应基团之间形成化学共价键链接，从而成为固定化细胞的方法，也存在着操作复杂，条件不易控制，活性损失较大等问题。包埋法的原理是将微生物细胞截留在水不溶性的凝胶聚合物的网络空间中，通过聚合作用、离子网络、沉淀作用使细胞截留，尽管操作简便，但其机械强度低、使用寿命短、价格较为昂贵。交联法又称为无载体固定化方法，微生物细胞间依靠物理或化学的作用相互结合，尽管细胞固定化效果好，但该法操作较复杂，受限于交联剂价格昂。
现有的交联固定化方法的菌体包埋量较低，细菌固定化颗粒的稳定性差，连续反应系统难以长期运行。
发明内容
本发明是要解决现有方法中菌体包埋量较低，细菌固定化颗粒的稳定性差，连续反应系统难以长期运行的问题，提供一种实验室用细菌固定化方法。
本发明实验室用细菌固定化方法，包括以下步骤：
一、进行细菌培养，使细菌处于对数生长期，得到菌液，以获得足够的菌体用于细菌固定化；
二、将菌液在4℃，9000～12500rpm条件下离心，获得用于固定化的菌体；
三、将步骤二获得的菌体用生理盐水分散，然后加入聚乙烯醇溶液混合均匀，获得PVA-菌体混合溶液；所述PVA-菌体混合溶液中菌体的量为15～20g/L，其中菌体的量为干重，所述PVA-菌体混合溶液中聚乙烯醇的浓度为8～12g/100mL；
四、使用细菌固定化反应装置进行反应，向细菌固定化反应装置的玻璃瓶中加入PVA-菌体混合溶液，向细菌固定化反应装置的烧杯中加入硼酸-磷酸盐交联缓冲液，调节细菌固定化反应装置，使蠕动泵转速为0.1～0.5rpm，磁力搅拌器的转速控制在500～800rpm，进行滴定，滴定结束后，继续在搅拌的情况下反应4～12小时成型，得到细菌固定化颗粒；
五、将步骤四得到的细菌固定化颗粒放入4℃冰水中，静置3天，使颗粒成型稳定，即完成；
其中步骤四所述细菌固定化反应装置包括磁力搅拌器、烧杯、蠕动泵、蠕动泵软管、玻璃瓶、支架、夹子和移液器枪头，所述烧杯放置在磁力搅拌器上，所述移液器枪头通过夹子固定在支架上，所述移液器枪头的滴液口一端向下，并位于烧杯的正上方，所述移液器枪头的另一端通过蠕动泵软管与蠕动泵的出液口连接，蠕动泵的进液口通过蠕动泵软管与玻璃瓶连接，所述玻璃瓶口处设有空气过滤膜。
进一步的，步骤一所述细菌为丙酮丁醇梭菌Clostrdium acetobutylicum、巴西弧菌Vibriobrasiliensis、干酪乳杆菌Lactobacillus casei、大肠杆菌Escherichia coli、酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae等，但并不局限于这些细菌。
进一步的，步骤三中所述聚乙烯醇为片状，低碱醇解型，聚合度为1700～2000，分子量为75000～88000g/mol，醇解度为99mol％。
进一步的，步骤四中硼酸-磷酸盐交联缓冲液的配方为：硼酸70g/L，磷酸二氢钠0.4mol/L，磷酸氢二钠0.1mol/L。
本发明的原理：
硼酸水解成B(OH)4-与聚乙烯醇(PVA)表面的羟基反应生成硼酸酯稳定结构，当PVA与一定浓度的菌液混合后，细菌可以被固定在硼酸酯结构中，进而形成细菌固定化颗粒。本发明使用细菌固定化反应装置进行细菌的固定化，具体是通过蠕动泵把PVA-菌体的混合液抽出来，通过移液枪的枪头一滴一滴的滴到硼酸-磷酸盐交联缓冲液中进行交联，同时硼酸-磷酸盐交联缓冲液不断进行磁力搅拌，使滴入的PVA-菌体混合液在水力剪切作用下形成小球。
本发明的有益效果：
通过本发明中的细菌固定化反应装置，可以克服注射器滴定的人为性，操作简便，可以调整包埋颗粒的大小。该固定化方法适用于多种发酵细菌，是一种适合于实验室操作的细菌固定化方法。
1、本方法制备的固定化颗粒稳定性好，此细菌固定化颗粒用于连续发酵系统时，系统可以稳定至少2个月。
2、本发明仅使用一次交联，减少交联的网状结构占用的空间，制备的固定化菌体颗粒无需洗涤，从冰水中取出后即可直接使用，方法简单，容易操作。
3、现有的使用硼酸和PVA交联进行菌体固定化方法，其包埋量仅为4g/L左右，无法包埋过多的菌体。本发明方法显著提高了固定化颗粒中菌体的包埋量，可达到15～20g/L，而且能够很好的成型，不破裂、不粘连。
4、本发明使用硼酸-磷酸盐交联缓冲液与PVA进行交联，硼酸磷酸盐缓冲溶液的pH值大约为5.5，使用磷酸调节pH值，不会对细菌产生毒性作用。
5、本发明可以通过更换移液器的型号，调整制备的颗粒的粒径大小。制备的细菌固定化颗粒的成型效果好，粒径均一，不粘连，成球性较好。
6、使用本方法固定化后的菌体颗粒，经活化后菌体成活率高，菌体功能也显著提升，固定化细胞的碳源利用率与蛋白质类物质的产量提高。其中固定化后，巴西弧菌H115的杀藻能力明显提高，丁醇生产菌株的碳源利用率明显提高。
7、本方法中所用聚乙烯醇的型号不同，效果也有所不同。其中1799L型PVA与2099L型PVA成型较好，颗粒稳定无交联过度的情况，且成球性较好。当PVA的聚合度大于2000后，交联后的颗粒成球性变差，弹性差且颗粒扁平，影响后续菌体的包埋与固定化颗粒的传质性能。
附图说明
图1为本发明中细菌固定化反应装置的结构示意图；
图2为聚乙烯醇型号对固定化颗粒制备效果的影响；
图3为固定化细胞与悬浮细胞杀藻效果的比较。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：结合图1说明本实施方式，本实施方式实验室用细菌固定化方法，包括以下步骤：
一、进行细菌培养，使细菌处于对数生长期，得到菌液；
二、将菌液在4℃，9000～12500rpm条件下离心，获得用于固定化的菌体；
三、将步骤二获得的菌体用生理盐水分散，然后加入聚乙烯醇溶液混合均匀，获得PVA-菌体混合溶液；所述PVA-菌体混合溶液中菌体的量为15～20g/L，其中菌体的量为干重，所述PVA-菌体混合溶液中聚乙烯醇的浓度为8～12g/100mL；
四、使用细菌固定化反应装置进行反应，向细菌固定化反应装置的玻璃瓶7中加入PVA-菌体混合溶液，向细菌固定化反应装置的烧杯2中加入硼酸-磷酸盐交联缓冲液，调节细菌固定化反应装置，使蠕动泵3转速为0.1～0.5rpm，磁力搅拌器1的转速控制在500～800rpm，进行滴定，滴定结束后，继续在搅拌的情况下反应4～12小时成型，得到细菌固定化颗粒；
五、将步骤四得到的细菌固定化颗粒放入4℃冰水中，静置3～4天，即完成；
其中步骤四所述细菌固定化反应装置包括磁力搅拌器1、烧杯2、蠕动泵3、蠕动泵软管9、玻璃瓶7、支架4、夹子5和移液器枪头6，所述烧杯2放置在磁力搅拌器1上，所述移液器枪头6通过夹子5固定在支架4上，所述移液器枪头6的滴液口一端竖直向下，并位于烧杯2的正上方，所述移液器枪头6的另一端通过蠕动泵软管9与蠕动泵3的出液口连接，蠕动泵3的进液口通过蠕动泵软管9与玻璃瓶7连接，所述玻璃瓶7瓶口处设有空气过滤膜8。
本实施方式步骤四中PVA-细菌混合液的滴定速度为0.067～0.33mL/min，使用16#泵管。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一所述细菌为丙酮丁醇梭菌Clostrdium acetobutylicum、巴西弧菌Vibrio brasiliensis、干酪乳杆菌Lactobacilluscasei、大肠杆菌Escherichia coli或酿酒酵母Saccharomycescerevisiae。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：步骤二中将菌液在4℃，10000～11000rpm条件下离心。其它与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤三中所述聚乙烯醇为片状，低碱醇解型，聚合度为1700～2000，分子量为75000～88000g/mol，醇解度为99mol％。其它与具体实施方式一至三之一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：步骤四中硼酸-磷酸盐交联缓冲液的配方为：硼酸70g/L，磷酸二氢钠0.4mol/L，磷酸氢二钠0.1mol/L。其它与具体实施方式一至四之一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤四中蠕动泵转速为0.2～0.4rpm。其它与具体实施方式一至五之一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是：步骤四中磁力搅拌器的转速控制在600～700rpm。其它与具体实施方式一至六之一相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是：步骤四中在搅拌的情况下反应6～10小时成型。其它与具体实施方式一至七之一相同。
下面对本发明的实施例做详细说明，以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方案和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例一：结合图1说明本实施例
本实施例溶藻巴西弧菌Vibrio brasiliensis H115的细菌固定化颗粒的制备方法如下：
一、PVA溶液准备：加入型号为1799L的片状聚乙烯醇9.5g定容至80mL水中，121℃高温反应20min，使聚乙烯醇完全溶解。溶液在无菌环境下趁热搅拌至冷却，使PVA混合均匀，呈透明均匀略黏稠状，得到聚乙烯醇溶液。
二、硼酸-磷酸盐交联缓冲液配制：硼酸70g/L，磷酸二氢钠0.4mol/L，磷酸氢二钠0.1mol/L。若有晶体析出，则加热使其完全溶解，冷却至室温使用。
三、对巴西弧菌H115进行培养，培养温度为37℃，培养24h，摇床转速200rpm，得到巴西弧菌H115菌液，以获得足够的菌体用于细菌固定化。
四、包埋菌体准备：将巴西弧菌H115菌液在4℃，9000rpm条件下离心，获得用于固定化的菌体。
五、细菌固定化颗粒制备：
将步骤四获得的菌体用20mL生理盐水分散，然后加入聚乙烯醇溶液混合均匀，获得PVA-菌体混合溶液；所述PVA-菌体混合溶液中菌体的量为20g/L，其中菌体的量为干重，所述PVA-菌体混合溶液中聚乙烯醇的浓度为9g/100mL；
六、使用细菌固定化反应装置进行反应，向细菌固定化反应装置的玻璃瓶7中加入PVA-菌体混合溶液，向细菌固定化反应装置的烧杯2中加入硼酸-磷酸盐交联缓冲液，调节细菌固定化反应装置，使蠕动泵3转速为0.2rpm，磁力搅拌器1的转速控制在600rpm，进行滴定，滴定结束后，继续在搅拌的情况下反应10小时成型，得到细菌固定化颗粒；
七、将步骤四得到的细菌固定化颗粒放入4℃冰水中，静置3天，使颗粒成型稳定，即完成；
其中步骤四所述细菌固定化反应装置包括磁力搅拌器1、烧杯2、蠕动泵3、蠕动泵软管9、玻璃瓶7、支架4、夹子5和移液器枪头6，所述烧杯2放置在磁力搅拌器1上，所述移液器枪头6通过夹子5固定在支架4上，所述移液器枪头6的滴液口一端向下，并位于烧杯2的正上方，所述移液器枪头6的另一端通过蠕动泵软管9与蠕动泵3的出液口连接，蠕动泵3的进液口通过蠕动泵软管9与玻璃瓶7连接，所述玻璃瓶7瓶口处设有空气过滤膜8。所述玻璃瓶7为血清瓶。
八、细菌固定化颗粒活化：将4℃冰水中放置3天的细菌固定化颗粒转入200mL W1培养基(具体成分见表1)中进行活化，定期检测发酵液pH、碳源利用率、产物及杀藻率。
九、连续/半连续培养：将活化后的细菌固定化颗粒转接至连续/半连续发酵反应器中，进行杀藻物质的生产。
本实施例所述巴西弧菌H115(Vibrio brasiliensis LMG 20546)已经在专利文件中公开，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2015093。
经过本方法制备的固定化细胞的碳源利用率与蛋白质类物质生产情况均高于非固定化细胞(表2)，其中蛋白质类物质的产量是非固定化细胞蛋白质类物质产量的6倍。同时，固定化细胞所生产的发酵液的杀藻能力明显高于非固定化细胞所生产的发酵液。固定化细胞与悬浮细胞杀藻效果的比较结果如图3所示，图3中表示固定化细胞，■表示悬浮细胞。固定化细胞生产的发酵液预达到100％的杀藻效果，添加量仅为0.3％(v/v)；而非固定化细胞生产的发酵液预达到100％的杀藻效果，其添加量需要6％(v/v)，即固定化细胞生产的发酵液的杀藻能力是非固定化细胞生产的发酵液的20倍。
实施例二：本实施例丁醇生产菌株的细菌固定化颗粒的制备方法如下：
对丁醇生产菌株Clostridium acetobutylicumATCC824进行细菌固定化，方法步骤及参数与实施例一相同。并将固定化颗粒用于连续丁醇生产系统，结果如表3所示。当连续丁醇生产系统的水力停留时间(HRT)为12h时，固定化细胞的丁醇生产速率为0.51±0.04g/L/h，是非固定化细胞的1.6倍；固定化细胞的丁醇产量为6.11±0.47g/L，比非固定化细胞丁醇产量高出2.21g/L；同时固定化细胞的碳源利用率比非固定化细胞高出25.9％。
实施例三：聚乙烯醇型号对固定化颗粒制备效果的影响：
采用实施例一的方法，比较1799L PVA、2099L PVA以及2499L PVA三种不同型号的聚乙烯醇对固定化颗粒制备效果的影响，其中L代表低碱醇解性PVA，醇解度为99mol％，其聚合度分别为1700、2000、2400，分子量分别为75000、88000、106000g/mol。固定化颗粒制备过程中控制PVA滴加速度一定、磁力搅拌器转速一定、且滴定高度相同，结果如图2所示，1799L型PVA与2099L型PVA成型较好，颗粒稳定无交联过度的情况，且成球性较好。当PVA的聚合度大于2000后(2499L PVA交联结果为例)，交联后的颗粒成球性变差，弹性差且颗粒扁平，影响后续菌体的包埋与固定化颗粒的传质性能。
表1 W1培养基组成
成份 浓度(g/L)
蛋白胨 7
酵母提取物 4
葡萄糖 0.5
硫酸镁 0.2
氯化钙 0.2
硫酸亚铁 0.004
氯化钾 0.1
高磷酸铁 0.1
磷酸氢二钾 0.1
磷酸二氢钾 0.1
硫酸钠 18.75
氯化钠 18.25
表2固定化细胞与非固定化细胞碳源利用与生产能力的比较
pH 碳源利用率(％) 蛋白质产量(mg/L)
固定化细胞 8.15 100 178.43
悬浮细胞 7.18 90.8 29.27
表3悬浮细胞与固定化细胞对于丁醇浓度的影响
表3中a：非固定化细胞，b：固定化细胞。

Claims (8)

1.一种实验室用细菌固定化方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
一、进行细菌培养，使细菌处于对数生长期，得到菌液；
二、将菌液在4℃，9000～12500rpm条件下离心，获得用于固定化的菌体；
三、将步骤二获得的菌体用生理盐水分散，然后加入聚乙烯醇溶液混合均匀，获得PVA-菌体混合溶液；所述PVA-菌体混合溶液中菌体的量为15～20g/L，其中菌体的量为干重，所述PVA-菌体混合溶液中聚乙烯醇的浓度为8～12g/100mL；
四、使用细菌固定化反应装置进行反应，向细菌固定化反应装置的玻璃瓶(7)中加入PVA-菌体混合溶液，向细菌固定化反应装置的烧杯(2)中加入硼酸-磷酸盐交联缓冲液，调节细菌固定化反应装置，使蠕动泵(3)转速为0.1～0.5rpm，磁力搅拌器(1)的转速控制在500～800rpm，进行滴定，滴定结束后，继续在搅拌的情况下反应4～12小时成型，得到细菌固定化颗粒；
五、将步骤四得到的细菌固定化颗粒放入4℃冰水中，静置3～4天，即完成；
其中步骤四所述细菌固定化反应装置包括磁力搅拌器(1)、烧杯(2)、蠕动泵(3)、蠕动泵软管(9)、玻璃瓶(7)、支架(4)、夹子(5)和移液器枪头(6)，所述烧杯(2)放置在磁力搅拌器(1)上，所述移液器枪头(6)通过夹子(5)固定在支架(4)上，所述移液器枪头(6)的滴液口一端向下，并位于烧杯(2)的正上方，所述移液器枪头(6)的另一端通过蠕动泵软管(9)与蠕动泵(3)的出液口连接，蠕动泵(3)的进液口通过蠕动泵软管(9)与玻璃瓶(7)连接，所述玻璃瓶(7)瓶口处设有空气过滤膜(8)。
2.根据权利要求1所述的一种实验室用细菌固定化方法，其特征在于步骤一所述细菌为丙酮丁醇梭菌Clostrdium acetobutylicum、巴西弧菌Vibrio brasiliensis、干酪乳杆菌Lactobacillus casei、大肠杆菌Escherichia coli或酿酒酵母Saccharomycescerevisiae。
3.根据权利要求1所述的一种实验室用细菌固定化方法，其特征在于步骤二中将菌液在4℃，10000～11000rpm条件下离心。
4.根据权利要求1所述的一种实验室用细菌固定化方法，其特征在于步骤三中所述聚乙烯醇为片状，低碱醇解型，聚合度为1700～2000，分子量为75000～88000g/mol，醇解度为99mol％。
5.根据权利要求1所述的一种实验室用细菌固定化方法，其特征在于步骤四中硼酸-磷酸盐交联缓冲液的配方为：硼酸70g/L，磷酸二氢钠0.4mol/L，磷酸氢二钠0.1mol/L。
6.根据权利要求1所述的一种实验室用细菌固定化方法，其特征在于步骤四中蠕动泵转速为0.2～0.4rpm。
7.根据权利要求1所述的一种实验室用细菌固定化方法，其特征在于步骤四中磁力搅拌器的转速控制在600～700rpm。
8.根据权利要求1所述的一种实验室用细菌固定化方法，其特征在于步骤四中在搅拌的情况下反应6～10小时成型。
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