CN100349808C - 一种利用微生物降解去除微囊藻毒素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种利用微生物降解去除微囊藻毒素Microcystins，MCs的方法，属于生物技术领域。从滇池底泥中筛选出了1株能够降MCs的食酸戴尔福特菌Delftia acidovoransUSTB02，保存号：CGMCC No.1447，保藏日期：2005年8月25日，解决了当前蓝藻水华污染中造成危害最为严重的MCs难以去除的问题。采用培养的食酸戴尔福特菌USTB02或食酸戴尔福特菌USTB02的酶制剂作为一种生物催化剂，按一定比例投加到受MCs污染的水体使MCs得到快速、安全、高效地降解去除；或作为一种生物药品用于因MCs而引起中毒的动物和人的抢救和解毒。

Description

一种利用微生物降解去除微囊藻毒素的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，一种利用微生物降解去除微囊藻毒素的方法。采用筛选出的1株能够降解微囊藻毒素(Microcystins，简称：MCs)的食酸戴尔福特菌Delftiaacidovorans USTB02(CGMCC No.1447，保藏日期：2005年8月25日)降解去除MCs，其特点是采用培养的食酸戴尔福特菌USTB02细胞或食酸戴尔福特菌USTB02的酶制剂作为一种生物催化剂，按一定比例投加入受MCs污染的水体使MCs得到快速、安全、高效地降解去除；或作为一种生物药剂用于因MCs引起中毒的动物的抢救和解毒。

背景技术

水体富营养化是指湖泊、水库和河流中受纳过多的氮和磷等营养物质，使水体的生态结构与功能发生变化，导致藻类特别是蓝藻的异常繁殖生长而出现的蓝藻水华现象。当蓝藻水华污染严重时，水面形成厚厚的蓝绿色湖靛，散发出难闻的气味，不仅破坏了健康平衡的水生生态系统，而且因藻细胞破裂后释放出了多种藻毒素而对人和动物的饮用水安全构成了严重的威胁。目前，世界上淡水湖泊蓝藻水华发生的频率与严重程度都呈现迅猛的增长趋势，发生的地点遍布全球各地。欧洲、非洲、北美洲和南美洲分别有53％、28％、48％和41％的湖泊存在不同程度的富营养化现象，我国目前有80％以上的湖泊存在不同程度的富营养化现象。自1878年首次报道了动物由于饮用含蓝藻的水而死亡以来，国内外因藻毒素引起的水生动物、鸟类、畜类甚至人类死亡的事件频繁发生。如何控制蓝藻水华污染现象和有效去除藻毒素是摆在我国乃至世界面前的一个环境科学难题。

蓝藻水华污染所带来的主要危害是在有毒蓝藻细胞破裂后向水体中释放多种不同类型的藻毒素，其中MCs是一类在蓝藻水华污染中出现频率最高、产生量最大和造成危害最严重的藻毒素种类。研究结果显示，MCs的主要靶器官是肝脏，能够促发肝脏肿瘤的发生。

虽然微生物降解是去除MCs的一种非常有前途的方法，但MCs的环状结构和间隔双键具有相当的稳定性，一般的多肽分解酶不能对MCs进行分解，只有一些特殊的微生物菌种才具备对MCs的降解能力，这也是MCs在天然水体中能够存在很长时间的一个重要原因。在混合菌种降解去除MCs方面，我国学者采用序批式生物膜反应器对3种类型MCs进行降解的实验显示，混合菌种对MCs有一定的降解能力，而且好氧条件优于厌氧条件，但在3d内MCs的去除量都低于400μg/L。在纯菌种降解去除MCs方面，国外学者发现从天然水体中分离出的铜绿假单胞菌和鞘氨醇单胞菌对MC-LR和RR这2种类型的MCs有降解能力，其中鞘氨醇单胞菌对MC-RR和LR的降解速率分别达到每天13.0和5.4mg/L，这是目前国外报道的最大的MCs生物降解速率。澳大利亚学者研究了鞘氨醇单胞菌对MC-LR的降解途径，发现至少有3种酶参与了MC-LR的催化降解反应，并将对应的基因进行了克隆和分子特点识别。国内学者闫海从云南滇池底泥中分离出了一株日平均降解MC-RR和MC-LR的速率达到16.7和9.4mg/L的微生物纯菌种Ralstonia solanacearum，并研究了此菌种对MC-RR和LR的降解途径，发现至少有两种酶参与了MC-RR和LR的催化降解过程。尽管还有其它国外学者在纯菌种和混合菌种对MCs的可降解性方面进行了研究，但是筛选出能够更加快速、安全、高效地降解去除MCs的新菌种，无论在基础研究还是在应用开发方面都具有非常重要的意义。

发明内容

本发明目的在于提供一种利用微生物降解去除微囊藻毒素(Microcystins，MCs)的方法，解决当前蓝藻水华污染中存在的水体中MCs难以去除的问题。

本发明采用1株从天然水体底泥中筛选的食酸戴尔福特菌Delftia acidovoransUSTB02(CGMCC No.1447，保藏日期：2005年8月25日)或食酸戴尔福特菌USTB02菌的酶制剂降解去除MCs，并确定了食酸戴尔福特菌USTB02的培养工艺。

在研究MCs的生物降解工作中，我们从遭受MCs污染的水体的底泥中筛选出1株能够降解MCs的食酸戴尔福特菌Delftia acidovorans USTB02(CGMCC No.1447，保藏日期：2005年8月25日)，它能在2天内将初始浓度分别为90.2mg/L和39.6mg/L的MC-RR和LR全部降解，日均降解速率分别达到45.1mg/L和19.8mg/L；进一步研究显示食酸戴尔福特菌酶对MCs仍然具有催化降解能力，且降解速率更迅速，能在7小时内分别将30mg/L的MC-RR和30mg/L的MC-LR完全降解。食酸戴尔福特菌USTB02是目前发现的除鞘氨醇单胞菌属、铜绿假单胞菌属和Ralstonia solanacearum菌外能够降解MCs的又一新菌种；另外，食酸戴尔福特菌USTB02降解MCs的活性不需MCs的诱导，生长于以葡萄糖和酵母粉为碳源和氮源培养基中的食酸戴尔福特菌USTB02仍然可以保持降解MCs的能力。具体方法为：

1、微生物培养基：培养基组成如下(1000mL去离子水中)：MgSO₄·7H₂O 0.1～1.0g，KH₂PO₄ 0.5～1.0g，K₂HPO₄ 4.0～10g，NaCl 1.0～5.0g，CaCl₂ 10.0～20.0mg，FeSO₄1.0～5.0mg，ZnCl₂ 1.0～5.0mg，MnCl₂·4H₂O 1.0～5.0mg，CuCl₂ 0.1～0.5mg，另外加入葡萄糖10.0～20.0g/L和酵母粉2.0～5.0g/L，或用从蓝藻细胞中提取提纯的20～200mg/L MCs作为微生物生长的碳源和氮源，即为液体培养基。液体培养基中按1.2～1.5％(重量/体积)加入琼脂粉即为对应的固体培养基。培养基经120～130℃高温和0.10～0.15MPa高压蒸汽灭菌15～20分钟，然后在洁净工作台内紫外线照射下灭菌15～20分钟后使用。

2、食酸戴尔福特菌USTB02的筛选：接种经1.0g/L NaCl溶液稀释的湖泊或水库底泥上清液于含有MCs作为微生物生长唯一碳源和氮源的液体培养基中，连续转接培养并逐步提高MCs浓度，每次培养后取样测定MC-RR和LR的浓度变化以确定培养液中存在能够降解MCs的菌种。将经过5～10次培养的菌液稀释10000～100000倍后均匀涂布于对应的固体培养基表面，30～37℃培养3～5天，待菌落长出后，挑取不同形态特征的单克隆菌落接种到含MCs的培养基中培养并取样测定MCs浓度的变化，确定能够降解MCs的单克隆菌落。用此方法成功筛选出1株能高效降解MC-RR和LR的纯菌种，经中国科学院微生物研究所鉴定为食酸戴尔福特菌Delftia acidovorans USTB02(CGMCC No.1447，保藏日期：2005年8月25日)，食酸戴尔福特菌USTB02能在2天内将初始浓度分别为90.2mg/L和39.6mg/L的MC-RR和LR全部降解，日均降解速率分别达到45.1mg/L和19.8mg/L。(图1)

食酸戴尔福特菌Delftia acidovorans是目前发现的除鞘氨醇单胞菌属、铜绿假单胞菌属和Ralstonia solanacearum菌外能够降解MCs的新菌种。进一步研究发现，食酸戴尔福特菌USTB02降解MCs的活性不需MCs的培养诱导，生长于葡萄糖和酵母粉为碳源和氮源培养基中的食酸戴尔福特菌USTB02仍然保持降解MCs的能力。

3、食酸戴尔福特菌USTB02的批量培养：以葡萄糖和酵母粉作为食酸戴尔福特菌USTB02生长的碳源和氮源进行批量培养。培养条件是温度25～35℃，摇床转速为100～300转/分。培养3～5天后离心(5000～10000转/分，10～20分钟)收获对数生长期的食酸戴尔福特菌USTB02细胞。用0.1～0.5％NaCl溶液重新悬浮收获的菌体细胞，此细胞悬浮液即可作为食酸戴尔福特菌USTB02制剂。在此菌制剂中加入40～50％(重量/体积)甘油，可在-20℃～-90℃低温冰箱中长期保存。

4、食酸戴尔福特菌USTB02酶的制备：批量培养食酸戴尔福特菌USTB02并收获对数生长期的菌体细胞，用10～50mM磷酸盐缓冲溶液重新悬浮，用超声波细胞粉碎仪破碎细胞，然后在高速冷冻离心机上离心(10000～20000转/分，温度0～10℃，20～30分钟)。取出上清液即为食酸戴尔福特菌USTB02的无细胞提取液即酶制剂，可放在-20℃～-90℃低温冰箱中长期保存。

USTB02菌酶对MCs具有催化降解能力，且降解速率更加迅速，能在7小时内分别将30mg/L的MC-RR和30mg/L的MC-LR完全降解。

5、在去除天然水体中MCs方面的应用：根据受蓝藻水华污染的饮用水或其它水体中的MCs浓度，将培养的食酸戴尔福特菌USTB02或食酸戴尔福特菌USTB02酶制剂作为一种快速、安全和高效的生物催化剂，按一定比例投加于水体中，可以达到快速、安全并高效地降解去除MCs的目的。

6、在污水处理方面的应用：对于发现有MCs存在的污水，也可以按一定比例投加入食酸戴尔福特菌USTB02制剂或食酸戴尔福特菌USTB02酶制剂，使污水处理厂去除MCs的效率得到大幅度提高。

7、动物解毒的应用：对于因MCs污染而导致急性中毒的动物，可以探索通过口服食酸戴尔福特菌USTB02酶制剂等方式进行抢救和解毒。

本发明从天然水体底泥中筛选出了能够降解MCs的1株食酸戴尔福特菌Delftiaacidovorans USTB02(CGMCC No.1447，保藏日期：2005年8月25日)，此菌种能够在2天内将初始浓度分别为90.2mg/L和39.6mg/L的MC-RR和LR全部降解，日均降解速率分别达到45.1mg/L和19.8mg/L；进一步研究发现食酸戴尔福特菌USTB02酶对MCs的催化降解速率更迅速，在7小时内可以分别将30mg/L的MC-RR和30mg/L的MC-LR完全降解。

本发明的优点在于：采用培养的食酸戴尔福特菌USTB02或食酸戴尔福特菌USTB02的酶制剂作为一种生物催化剂，按一定比例投加到受MCs污染的水体使MCs得到快速、安全、高效地降解去除；或作为一种生物药剂通过口服应用于因MCs所引起中毒的动物的抢救和解毒。

附图说明

图1为食酸戴尔福特菌USTB02降解MC-RR和LR的动力学过程，横坐标为时间天，纵坐标为MCs的浓度mg/L。结果显示食酸戴尔福特菌USTB02能在2天内将初始浓度分别为90.2mg/L和39.6mg/L的MC-RR和LR全部降解，日均降解速率分别达到45.1mg/L和19.8mg/L。

具体实施方式

1、食酸戴尔福特菌USTB02培养基：培养基组成如下(1000mL去离子水中)：MgSO₄·7H₂O 0.1～1.0g，KH₂PO₄ 0.5～1.0g，K₂HPO₄ 4.0～10g，NaCl 1.0～5.0g，CaCl₂10.0～20.0mg，FeSO₄ 1.0～5.0mg，ZnCl₂ 1.0～5.0mg，MnCl₂·4H₂O 1.0～5.0mg，CuCl₂0.1～0.5mg，另外加入葡萄糖10.0～20.0g/L和酵母粉2.0～5.0g/L，或用从蓝藻细胞中提取提纯的20～200mg/L MCs作为微生物生长的碳源和氮源，即为液体培养基。在液体培养基中按1.2％(重量/体积)加入琼脂粉即为对应的固体培养基。培养基经125℃高温和0.12MPa高压蒸汽灭菌20分钟，然后在洁净工作台内紫外线照射下灭菌20分钟后使用。

2、食酸戴尔福特菌USTB02的筛选：称取3g滇池底泥，用去离子水稀释至10mL混匀，待其自然沉降后取1mL上清液接种于含有30mg/L MC-RR和20mg/L MC-LR作为微生物生长碳源和氮源的10mL液体培养基中进行批量培养。培养条件是：摇床转速200转/分，温度30℃，培养3天。取10μL培养物液转接到另一瓶80mg/L MC-RR和50mg/L MC-LR的液体培养基继续进行批量培养，重复培养转接5次，每次培养3天后取样测定藻毒素MC-RR和MC-LR的浓度变化。将第5次培养的菌液稀释10000倍后均匀涂布于对应的固体培养基表面，在温度30℃下静置培养3天，待单克隆菌落长出后，挑取不同形态特征的单克隆菌落接种到含MCs的液体培养基中培养，条件同上。培养3天后取样测定MCs浓度的变化，以MCs去除速度最快来确定降解MCs能力最强的单克隆菌落。用此方法成功筛选出1株能高效降解MC-RR和LR的纯菌种，经中国科学院微生物研究所鉴定为食酸戴尔福特菌Delftia acidovorans USTB02(CGMCC No.1447，保藏日期：2005年8月25日)。

挑取食酸戴尔福特菌USTB02的单克隆菌落接种于MC-RR和LR初始浓度分别为90.2和39.6mg/L的液体培养基中培养，定时取样测定MCs的浓度变化。结果表明MC-RR和LR在2天内被全部降解，日均降解速率分别达到45.1和19.8mg/L。(图1)

以葡萄糖和酵母粉作为唯一碳源和氮源批量培养食酸戴尔福特菌USTB02，收获的菌体细胞仍然可以快速高效降解MCs，说明食酸戴尔福特菌USTB02不需要MCs培养诱导就可以生物降解MCs。

3、食酸戴尔福特菌USTB02的批量培养：以20g/L的葡萄糖和5g/L的酵母粉作为食酸戴尔福特菌USTB02生长的碳源和氮源，在洁净工作台内无菌条件下，接种1mL食酸戴尔福特菌USTB02液于装在1000mL三角瓶内的200mL微生物培养基中进行批量培养。培养条件：恒温振荡培养箱中，转速200转/分，温度30℃。批量培养4天后，离心(12000转/分，15分钟)后倒去上清液，收获食酸戴尔福特菌USTB02细胞。用0.5％NaCl溶液重新悬浮收获的菌体细胞，此细胞悬浮液即可作为食酸戴尔福特菌USTB02制剂，可在菌制剂中加入50％(重量/体积)的甘油，放在-80℃低温冰箱中长期保存。

4、食酸戴尔福特菌USTB02酶的制备：批量培养食酸戴尔福特菌USTB02菌并收获菌体细胞，方法同上。用50mM磷酸盐缓冲溶液重新悬浮，转移至一玻璃管中，将管插入冰浴中保持低温，用超声波细胞粉碎仪破碎细胞，条件如下：破碎10秒，间隔2秒，破碎时间20分钟。细胞破碎后，用高速冷冻离心机离心，条件：15000转/分，20分钟，4℃。小心取出上清即为食酸戴尔福特菌USTB02的无细胞提取液(酶制剂)，可放在-80℃低温冰箱中长期保存。

食酸戴尔福特菌USTB02酶对MCs具有催化降解能力，且降解速率更迅速，能在7小时内分别将30mg/L的MC-RR和30mg/L的MC-LR完全降解。

5、在去除天然水体中MCs方面的应用：根据受蓝藻水华污染的饮用水或其它水体中的MCs浓度，将培养的食酸戴尔福特菌USTB02或食酸戴尔福特菌USTB02酶制剂作为一种快速、安全和高效的生物催化剂，按一定比例进行投加入水体中后，可以达到快速、安全并高效地降解去除MCs的目的。

6、在污水处理方面的应用：在污水处理场，对于发现有MCs存在的污水，也可以按一定比例投加食酸戴尔福特菌USTB02制剂或食酸戴尔福特菌USTB02酶制剂，使污水处理厂去除MCs的效率得到大幅度提高。

7、动物的解毒：对于因MCs污染而导致急性中毒的动物，可以探索采用通过口服食酸戴尔福特菌USTB02酶制剂等方式进行抢救和解毒的应用途径。

Claims (1)

1、一种利用微生物降解去除微囊藻毒素的方法，其特征在于：利用从遭受微囊藻毒素污染的天然水体底泥中筛选出的1株食酸戴尔福特菌(Delfta acidovorans)USTB02，保藏号为：CGMCC No.1447，食酸戴尔福特菌降解去除MCs，培养出高细胞浓度的食酸戴尔福特菌(Delftaacidovorans)USTB02液作为一种生物催化剂，通过投加的方式去除水体中的MCs，或者应用于有MCs存在的污水生物处理工艺中的降解去除MCs。

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