KR20140097621A - 연안 갯벌과 갯지렁이로부터 동정된 복수의 균주 속 미생물을 포함하는 유기물 정화제 - Google Patents

Abstract

본 발명에서는 연안 갯벌과 갯지렁이(Perinereis aibuhitensis)에 내생하고 있는 미생물을 분리 동정하여 유기물 분해능력을 분석하였다. 동정된 미생물은 DNA, agar, starch 그리고 tween의 분해 능력이 있는 것으로 나타났고,
단백질, 탄수화물, 지질 분해능이 뛰어나며 염분에 내성을 갖고 있으므로 유기물로 오염된 갯벌 환경 정화에 응용 가능성이 높은 것으로 나타났다.

Description

연안 갯벌과 갯지렁이로부터 동정된 복수의 균주 속 미생물을 포함하는 유기물 정화제 {A novel microorganism Rhodococcus pyridinovorans and Bacillus spp., identified from lugworm and microbial cleaning agent}

본 발명은 유기물질로 오염된 갯벌의 생물학적 환경정화 전략을 마련하기 위해, 주요 갯벌 오염물질중의 하나인 엔도설판 및 합성폐수 (펩톤과 글루코오스 비율 8:2) 분해능을 가지고 있는 연안갯벌 및 갯지렁이(Perinereis aibuhitensis) 유래의 염분 내성이 있는 신규 균주를 이용한 유기물 정화제에 관한 것이다.

조간대는 인간의 거주지로부터 인접해 있음으로 인해 지속적으로 환경오염의 위험을 받고 있는 곳으로, 연안 생태계에서 가장 민감하게 반응하는 곳이다. 따라서 조간대에 서식하는 생물들에 의해 이루어지는 난분해성 물질의 분해에 대한 이해는 생태학적 관점에서 매우 중요하다.

갯지렁이는 해양 무척추동물로 조간대 갯벌과 강 하구에 넓게 분포되어 있는 저서생물 중의 하나로, 스트레스를 받은 환경 조건에 대한 적응능력 때문에 연구자들은 이들 갯지렁이들을 환경 파수꾼으로서 뿐만 아니라 모니터링 프로그램을 위해 잠재적으로 중요한 생태종으로 간주한다.

여과 섭식을 하는 많은 저서생물들은 흔히 가정이나 수서생태계에서 물의 유기물을 제거하고 정화하는데 흔히 사용되며, 특히 Perinereis sp.를 비롯한 여러 종의 갯지렁이들이 새우 양식장 환경에서 비통제 방식으로 사용되는 것으로 알려져 있다. 조간대에서 세균 군집에 미치는 대형무척추동물의 영향에 대한 연구에서 굴, 대합, 그리고 연체동물들은 비브리오균의 주요 저장소로 알려져 있다.

한편, 엔도설판은 1956년 독일에서 개발된 유기염소계 살충제로서 티오단(Thiodan), 시클로단(Cyclodan), 말릭스(Malix), 지오릭스(Thiolix) 등 여러 상품명으로 알려져 있다. 엔도설판은 소화중독성 살충제로서, 담배, 뽕나무, 배추 등의 작물에 사용되는데, 엔도설판의 2006년 국내생산량은 229톤이며, 2006년 출하량은 원제기준으로 506톤이다. 우리나라에서는 2004년 12월 농약관리법상 엔도설판의 식용작물에 대한 사용을 전면 금지하였으며, 담배, 뽕나무, 토양해충방제 등에만 사용하도록 하였으나, 식용작물에도 여전히 상당량이 사용되고 있어서 전국적인 모니터링 결과 검출되고 있다. 또한 엔도설판은 환경부의 유해화학물질관리법에 의해 제조, 수입 또는 사용금지물질로 지정관리되고 있다.

엔도설판은 가격이 저렴하고 효과가 뛰어나 해충방제를 목적으로, 고독성임에도 불구하고 생산농가에서 사용되어 왔다. 엔도설판은 매우 낮은 농도에서도 담수어종에 상당한 독성을 나타낼 뿐만 아니라 내분계 교란물질로써 인간이나 동물의 호르몬계에 저해를 일으킬 수 있어 위험성이 높다. 그럼에도 불구하고 엔도설판은 최근 까지 우리나라와 미국에서 최근까지 해충 방제용으로 광범위하게 사용되어 온 유기염소계 살충제로 주요한 환경오염의 주요 물질 중의 하나이다.

엔도설판은 급성독성의 고독성 농약으로 특히 어독성이 매우 큰 어독성 1급 농약이다. 앤도설판은 상당히 안정한 화합물로서 자연계에서 태양빛에 의해 분해되지 않으며, 토양에서의 반감기는 최소 6개월에서 최고 9년까지로 잔류성이 매우 강하다. 따라서 농경지에 살포된 후 잔류한 엔도설판이 지하수, 하천 및 연안으로 유입되어 오랜 시간 잔류하며 생태계에 영향을 미칠 수 있다.

엔도설판은 비록 우리나라에서는 식용작물에 사용이 금지되었으나, 미국을 비롯한 여러 나라에서 여전히 사용되고 있어서, 호주, 뉴질랜드로부터 수입한 육우에서 엔도설판이 검출되어 검역당국으로부터 전량 폐기된 예가 있다. 엔도설판은 또한 환경에서 장거리 이동하는 것으로 알려져 사하라 사막, 심지어는 북극에서도 발견된다고 보고된다. 엔도설판의 생물적 분해에 대한 연구 논문은 소수에 지나지 않고 그 내용 또한 극히 제한적이어서 현장에 응용할만한 연구가 시급한 실정이다. 국내에서 endosulfan계 농약은 2008-2009년도 출하량 기준으로 가장 많이 사용되어왔던 농약중의 하나였다. 최근 육상의 오염물질이 바다로 유입되면서 연안 갯벌은 엔도설판 및 합성폐수 등의 유기물질로 오염되고 있다.

본 발명에서는 이러한, 연안 갯벌의 생물학적 환경정화 전략을 마련하기 위해, 엔도설판을 탄소 및 에너지원으로 이용하는 미생물을 연안 갯벌에서 농화배양을 통해 엔도설판 및 유기물 분해능이 매우 우수한 미생물을 분리하여 그 특성을 분석함으로서, 분리된 균주를 이용한 연안 갯벌 유기물 정화제로서의 활용 가능성을 검토하였다.

국내 등록특허공보 제10-03289130호에는 2,4-디니트로페놀(dinitrophenol)을 분해할 수 있는 로도코커스(Rhodococcus) 속의 새로운 종인 로도코커스 코리엔시스 DNP505 (Rhodococcus koreensis DNP505)에 관한 것으로, 구체적으로는 인체 및 다른 생물체에 유해한 물질인 2,4-디니트로페놀을 분해할 수 있는 특징을 가지고 있어, 2,4-디니트로페놀에 오염된 폐수, 하수 또는 토양 등에 적용시 미생물을 이용한 생분해 과정을 통하여 오염원 내의 2,4-디니트로페놀을 효율적으로 정화하는데 이용될 수 있는 로도코커스 속의 새로운 종인 로도코커스 코리엔시스 DNP505에 관한 구성이 개시되어있다. 국내 등록특허공보 제10-03252520호는 방향족 화합물을 분해할 수 있는 신규 미생물인 로도코커스 피리디노보란스 PDB9(Rhodococcus pyridinovorans PDB9)와 이를 이용한 방향족 화합물의 분해방법 및 상기 미생물을 함유하는 폐수, 하수, 또는 토양 처리제에 관한 것으로, 인체 및 다른 생물체에 유독한 영향을 미치는 방향족 화합물을 분해할 수 있는 신규 미생물인 로도코커스 피리디노보란스 PDB9를 분리, 동정하고, 방향족 화합물 중 유독성이 강한 피리딘의 분해방법을 최적화하여 피리딘이 포함된 폐수, 하수 또는 토양을 정화하는데 이용할 수 있는 처리제에 관한 구성이 개시되어있다. 국내 등록특허공보 제10-04352310호는 1∼37℃의 매우 넓은 온도 범위에서 원유, 디젤 및 휘발유와 같은 유류를 분해하는 로도코커스(Rhodococcus sp.)YHLT-2(KCTC 10203BP)균주 및 이 균주를 이용한 유류로 오염된 토양 및 지하수의 생물학적 정화방법에 관한 구성이 개시되어있다. 또한, 국내등록특허공보 제10-08507430호는 포도상구균에 항균성이 있는 바실러스 서브틸리스 균주 및 이를 이용한 생균제에 관한 구성이 개시되어 있으나, 상기에 개시된 균주들은 육상식물 또는 동물에서 유래하는 종으로 본 발명에서와 같이 염분에 대한 내성을 갖는 해산동물을 기반으로 동정된 것이 아니라는 점에서 큰 차이를 갖는다.

본 발명은 유기물질로 오염된 갯벌의 생물학적 환경정화 전략을 마련하기 위해, 연안 갯벌 유래의 균주 및 갯지렁이(Perinereis aibuhitensis)에 내생하고 있는 미생물 중 영양물질의 소화 및 생물면역과 밀접하게 연관된 것으로 알려져 있는 신규 균주를 동정함으로서 유기물로 오염된 갯벌 환경을 정화하는데 유용하게 쓰일 수 있을 유기물 정화제를 제공하고자 하는 것이다.

본 발명에서는 연안 갯벌에서 엔도설판을 탄소 및 에너지원으로 이용하는 미생물을 분리하기 위하여 10ppm 농도의 엔도설판이 함유된 25 ml BM 배지인 무기영양배지를 준비한 후 해수 시료 또는 연안 토양시료를 5%씩 접종하여 실온(10 ~ 20^oC)에서 농화배양을 실시하였다. 농화배양을 통해 분리된 단일균주를 사용하여 10ppm의 엔도설판을 단일 탄소원 및 에너지원으로 첨가한 BM배지에서 분해능을 HPLC를 이용하여 분석하고, 그 중 분해능이 우수한 균주를 선별하였다.

또한 연안 갯벌에서 유기물 분해능이 매우 우수한 것으로 알려진 갯지렁이(Perinereis aibuhitensis)에 내생하고 있는 미생물 중 영양물질의 소화 및 생물면역과 밀접하게 연관된 것으로 알려져 있는 Bacillus균의 다양성을 배양법에 기초하여 분석하였다.

엔도설판 농화배양액에서 분리한 6균주를 16S rRNA 염기서열에 기초하여 동정한 결과, 5개 속 6종으로 에치니콜라 비에트남엔시스(Echinicola vietnamensis ), 로도코커스 피리디노보란스( Rhodococcus pyridinivorans ), 루에게리아 모빌리스( Ruegeria mobilis ), 탈라소비우스 겔라티노보란스( Thalassobius gelatinovorus ), 탈라소피라 테피디필라( Thalassospira tepidiphila ), 테나바쿨룸 아입타세( Tenacibaculum aiptasiae ) 로 조사되었다.

갯지렁이로부터 선별한 31개의 집락을 별도로 선별하여 순수배양한 후 16S rRNA 염기서열에 기초하여 동정한 결과, Bacillus 속에 포함되는 11 균주를 분리하였으며, Bacills 속(genus)에 포함되는 11 균주의 다양성을 분석한 결과 바실러스 알지콜라(Bacills algicola ), 바실러스 안트라시스( Bacills anthrasis ), 바실러스 아퀴마리스( Bacills aquimaris ), 바실러스 바바리쿠스( Bacills barbaricus ), 바실러스 화진포엔시스( Bacills hwajinpoensis ), 바실러스 난히엔시스( Bacills nanhiensis), 바실러스 비에트남엔시스( Bacills vietnamensis ) 등 모두 7 종 (species)의 Bacillus spp.가 갯지렁이(Perinereis aibuhitensis)에 내생하는 것으로 조사되었다.

본 발명에서 갯지렁이로부터 분리하여 선별한 균주는 단백질, 탄수화물, 지질 분해능이 뛰어나고 염분에 내성을 갖고 있고, 연안 갯벌에서 분리된 균주는 염분내성이 있고 엔도설판을 탄소 및 에너지원으로 이용하는 미생물로서 복합적으로 이용함으로서 엔도설판 등의 유기물로 오염된 갯벌 환경을 정화하는데 유용하게 쓰일 수 있는 효과가 있다.

도 1는 농화배양에 의한 엔도설판 분해 미생물의 분리 과정을 나타낸다.
도 2는 갯지렁이 유래 Bacillus 균주의 동정과정을 나타내는 모식도이다.
도 3는 갯벌에서 동정 분리한 로도코커스 피리디노보란스 EDB2 (Rhodococcus pyridinovorans EDB2) 균주의 16S rDNA 서열을 나타낸다.
도 4은 16S rRNA 서열에 의한 EDB2의 계통관계 분석결과를 나타낸다.
도 5은 갯지렁이로부터 분리 동정한 바실러스 균주 CBW4의 16S rDNA 유전자의 염기서열을 나타낸다.
도 6는 갯지렁이로부터 분리 동정한 바실러스 균주 EBW4의 16S rDNA 유전자의 염기서열을 나타낸다.
도 7은 동정된 갯지렁이 유래 바실러스 균주의 계통관계를 나타내는 모식도이다.
도 8는 API 20 E에 의한 EDB2의 생화학적 특성 분석결과를 나타낸다.
도 9는 API 20 NE에 의한 EDB2의 생화학적 특성 분석결과를 나타낸다.
도 10은 API CHB/E에 의한 EDB2의 생화학적 특성 분석결과를 나타낸다.
도 11은 API ZYM에 의한 EDB2의 생화학적 특성 분석결과를 나타낸다.
도 12는 고체 및 액체 배지에서 앤도설판을 이용할 수 있는 균주 EDB-2의 순수배양결과를 나타낸다.
도 13은 HPLC에 의한 균주 EDB2의 엔도설판 분해능 시험결과를 나타낸다.
도 14는 갯벌 유래 복합 균주를 이용하여 미생물제제를 제조 과정을 나타낸다.
도 14는 갯벌 유래 복합 균주를 이용하여 제조된 미생물제제를 나타낸다.
도 15는 갯지렁이 유래 Bacillus sp.균주를 이용하여 제조된 미생물제제의 예를 나타낸다.

본 발명은 연안 갯벌과 해수를 엔도설판 농화배양액에 접종하고 농화배양하여 분리 동정된 기탁번호: KACC91762P의 균주로부터 선택되는 염분 내성이 있고, 온도 25 내지 42℃, pH5 내지 pH10에서 생장하며, 엔도설판, 단백질, 탄수화물, 지질 및 계면활성제 등의 유기물 분해능이 있는 연안 갯벌 유래, 염분내성이 있는 로도코커스 피리디노보란스(Rhodococcus pvridinivorans ) EDB2 균주와 갯지렁이로부터 동정된 기탁번호: KACC91722P와 KACC91749P의 바실러스(Bacillus sp.) 속 균주로부터 배양되는 염분 내성이 있고 단백질, 탄수화물, 지질 및 계면활성제 등의 유기물 분해능이 있는 바실러스 균주를 복합적으로 이용한 갯벌정화용 미생물 정화제를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 균주 배양물을 유효성분으로 함유하는 연안 갯벌 정화용 미생물 제제 및 상기 균주를 사용하여 연안 갯벌에 퇴적된 엔도설판, 단백질, 탄수화물, 지질 및 계면활성제 중에 선택되는 어느 하나 이상의 유기물을 분해시키는 방법을 제공한다.

본 발명에서 동정된 연안 갯벌 유래 로도코커스 피리디노보란스(Rhodococcus pvridinivorans) EDB2 균주는 호기성, 그람 양성, 막대형이며, 핑크빛을 띠고 있다. 생장가능 온도는 20℃~45℃, 최적온도는 약 20℃~42℃로 생장 온도 범위가 비교적 넓은 것으로 나타났다. Casein과 cellulose 가수분해능력은 없지만 DNA, agar, starch 그리고 tween의 분해 능력이 있는 것으로 나타나 지질 분해능이 우수하여 지질로 오염된 환경 정화에 응용가능성이 높은 것으로 나타났다.

이에 본 발명자들은 상기 분리 및 동정된 본 발명의 균주를 2012년 11월 22일자로 국립농업과학원 농업유전자원센터(KACC)에 기탁하여 기탁번호 KACC91762P를 부여받았다.

또한 바실러스 속 균주 CBW2와 CBW4는 본 발명자들에 의해 최초로 분리 동정된 것으로서, 연안 갯벌에서 유기물 분해능이 매우 우수한 것으로 알려진 갯지렁이(Perinereis aibuhitensis)에 내생하고 있는 미생물을 배양법에 기초하여 처음으로 분리 동정하였다.

분리한 균주의 16S rDNA 서열 검색에 의한 분자 유전학적인 방법에 의해 분석하여 동정한 결과, 밝혀진 11개의 Bacillus 균의 16S rRNA 염기서열을 기초로 계통관계를 분석하였을 때 크게 5개 그룹으로 구분되었으며, 그 중 균주 CBW2와 CBW4는 Bacillus vietnamensis 15-1^T 및 Bacillus anthracis ATCC 14578^T와 각각 90.7%와 94.2%의 상동성을 보였으며, EBW4는 Bacillus hwajinpoensis SW-72^T와 96.8%의 상동성을 보여 신종(new species) 균주임을 알 수 있었다.

이에 본 발명자들은 바실러스 화진포엔시스(Bacillus hwajinpoensis SW-72T)와 96.8%의 상동성을 보인 상기 분리 및 동정된 본 발명의 신균주를 "Bacillus sp. EBW4"라고 명명하였으며, 2012년 10월 26일자로 국립농업과학원 농업유전자원센터(KACC)에 기탁하여 기탁번호 KACC91749P를 부여받았다.

또한 본 발명자들은 상기 분리 및 동정된 본 발명의 신균주를 "Bacillus sp. CBW4"라고 명명하였으며, 2012년 6월 8일자로 국립농업과학원 농업 유전자원센터(KACC)에 기탁하여 기탁번호 KACC91722P를 부여 받았다.

이하 엔도설판 등의 유기물 분해능이 우수한 갯지렁이 및 연안 갯벌 유래의 규주의 동정방법 및 생물 화학적 특성에 대하여 다음에서 실시 예를 중심으로 설명한다.

1. 연안 갯벌과 갯지렁이로부터 균주 분리 동정

1.1. 엔도설판 및 유기물 분해 균주 분리 및 배양 조건

엔도설판을 탄소 및 에너지원으로 이용하는 미생물을 분리하기 위하여 10ppm 농도의 엔도설판이 함유된 25 ml BM 배지 (1 M phosphate buffer 10 ml, MgSO₄·7H₂O 0.25 g, CaCl₂·2H₂O 0.02 g, FeSO₄·7H₂O 0.02 g, (NH₄)₂SO₄ 2.38 g, sea salt 30 g, 증류수 990 ml)인 무기영양배지를 준비한 후 해수 시료 또는 연안 토양시료를 5%씩 접종하였다. 농화배양은 실온(10 ~ 20^oC)에서 이루어졌고, 1주일 간격으로 3회에 걸쳐 1 ml의 배양액을 새로운 배지에 접종하여 계대배양을 지속하였다 (도 1). 다양한 엔도설판 분해미생물을 분리하기 위하여 새로운 시료를 사용하여 5회에 걸쳐 위에 언급한 것과 같은 방법으로 별도의 농화배양을 실시하였다.

엔도설판의 경우 7일간 배양한 후, 배양액 1 mL를 새로운 각 배지에 접종하고 같은 조건에서 2차, 3차 배양하는 과정을 반복하여 농화배양을 실시하였다. 합성폐수 분해능은 엔도설판 분해미생물을 대상으로 조사하였기 때문에 별도로 농화배양을 실시하지 않았다. 합성폐수의 분해능은 엔도설판을 분해하는 미생물을 대상으로 합성폐수 10,000ppm이 포함된 BM배지에 접종한 후 시험하였다.

농화배양을 통해 분리된 단일균주를 사용하여 10ppm의 엔도설판을 단일 탄소원 및 에너지원으로 첨가한 BM배지에서 분해능을 HPLC를 이용하여 분석하고, 그 중 분해능이 우수한 균주를 선별하였다.

1.2. 갯지렁이로부터의 균주 분리 및 배양 조건

본 발명에서 균주 분리원으로 사용한 갯지렁이(Perinereis aibuhitensis)는 순천만 잿벌 양식장에서 채취하였다. 도 2는 갯지렁이 유래 Bacillus 균주의 동정과정을 나타내는 모식도이다.

갯지렁이 내부에 존재하는 미생물을 분리하기 위해 살아있는 갯지렁이를 BM buffer (Mikesell et al ., 1993) 50 mL가 포함된 conical tube에 넣은 후, vortex에서 세 번 세척한 후, 70% ethanol에서 짧게 다시 한 번 세척하였다. 세척한 갯지렁이를 멸균된 면도날로 갯지렁이의 복부를 가르고 다시 여러 개의 매우 짧은 마디로 절단한 후, BM buffer 50 mL가 포함된 conical tube에 넣어 격렬하게 vortexing 하여 갯지렁이 내생 미생물이 buffer안으로 빠져나오게 하였다.

이어서, 갯지렁이를 제거한 후 12000 rpm으로 원심분리하여 pellet을 모은 후 2mL의 BM buffer를 첨가하여 잘 섞은 후, 100㎕씩 고체 Bacto marine agar 2216(MA)배지에 접종하여 미생물을 배양하였다. MA배지는 1:10과 1:2로 희석한 배지 및 희석하지 않은 배지를 동시에 사용하여 배양법에 의하여 분석할 수 있는 미생물 다양성을 높이고자 하였다. 기타 환경조건별 균주의 생장 여부를 파악할 때는 분리한 모든 균주가 LB에서 생장할 수 있었기 때문에, LB 또는 LB agar 배지를 기본배지로 사용하였으며, 구체적인 균주 배양조건은 환경 조건별 생장시험에 자세히 나타내었다.

1.3. Total genomic DNA 분리와 정제

각 균주를 50 mL의 LB 배지에 접종하고 30℃에서 180 rpm으로 24시간 동안 배양한 후 원심분리 (6,300 ×g, 10 min, 4℃)하여 세포를 수확하였다. 회수된 배양세포를 5 mL TES buffer [0.1 M Tris-HCl (pH 7.0), 0.01 M EDTA, 1 M NaCl]로 재현탁하고, lysozyme (10 mg/mL)을 200㎕ 첨가하여 37℃에서 15분간 반응시켰다. 10% SDS를 100㎕ 첨가하고, 물리적인 DNA 절단을 방지하기 위하여 천천히 섞어준 후 50㎕ proteinase K (20㎎/㎖)와 5㎕ RNase를 첨가하여 37℃에서 30분간 반응시켰다.

5㎖ TES buffer를 더 첨가형 10㎖의 phenol을 첨가하여 잘 섞어주었다. 원심부분리를 통하여 얻어진 상징액을 취하여 새로운 tube로 옮긴 후 동량의 phenol/choroform/isoamyl alcohol로 2회, chlorofrom으로 1회 처리하였다. 상징액을 취하여 새로운 tube로 옮긴 후 1/10 volume의 3M sodium acetate(PH.54)와 2-3 volume의 100% ethanol을 첨가하여 30분간 실온에서 방치하였다.

원심분리 후 상징액을 버리고, 70% ethanol을 처리하여 염류를 씻어낸 후, 다시한번 원심분리하였다. 상징액을 버리고 공기 중에서 ethanol을 제거한 후, 침전물 500㎕의 멸균수에 녹여 다음 실험에 사용하였다. 0.8% agarose gel에 전기영동을 실시하여 DNA band를 확인한 후 UV-spectrophotometer (여 800, Beckman Coulter, Fullerton, USA)를 이용하여 정량하였다. Total DNA의 정제를 위해 crude DNA를 10㎖ cesium chloride용액에서 녹인 후 ethidium bromide를 첨가하여 102,200um membrane filter를 이용하여 30분간 투석하여 DNA 용액을 회수하여 농축한 후 특정 유전자의 증폭 또는 클로닝을 위한 시료를 사용하였다.

1.4. 미생물 분리 결과

1.4.1. 농화배양(enrichment culture)에 의한 엔도설판 분해 미생물 분리 결과

엔도설판 농화배양액에서 분리한 6균주는 5개 속 6종으로 에치니콜라 비에트남엔시스(Echinicola vietnamensis ), 로도코커스 피리디노보란스( Rhodococcus pyridinivorans), 루에게리아 모빌리스( Ruegeria mobilis ), 탈라소비우스 겔라티노보란스( Thalassobius gelatinovorus ), 탈라소피라 테피디필라( Thalassospira tepidiphila), 테나바쿨룸 아입타세( Tenacibaculum aiptasiae ) 등 이었다.

본 발명에서 분리한 균주 EDA5는 아직 보고되지 않은 신속 (new genus)일 가능성이 매우 높은 균주로, 16S RNA 염기서열 기준으로 가장 높은 유연관계를 가지는 균은 Echinicola vietnamensis KMM 6221^T로 단지 92.2%의 상동성을 나타내었다 (표 1). 또한 균주 EDA2와 EDSW1도 신종 (new species)을 가능성이 매우 높은 것으로 사료된다. 본 발명에서는 농화배양액을 구성하는 이들 각각의 미생물에 대한 앤도설판 분해능을 실시한 결과 가장 분해능이 우수한 균주 Rhodococcus sp. EDB2를 선별하여 보다 그 특성을 분석하였다.

16S rRNA 염기서열에 기초한 엔도설판 농화배양에 의해 분리한 미생물

Strain	Closese Relatives	Similarity (%)	Diff/Total nt
EDA2	Thalassobius gelatinovorus IAM 12617T	96.9	42/1360
EDA3	Ruegeria mobilis NBRC 101030T	98.8	16/1361
EDA5	Echinicola vietnamensis KMM 6221T	92.2	110/1414
EDB2	Rhodococcus pyridinivorans PDB9T	99.0	14/1428
EDSW1	Tenacibaculum aiptasiae a4T	97.6	33/1394
EDSW2	Thalassospira tepidiphila 1-1BT	98.4	22/1380

1.4.2. 배양의존성 갯지렁이 내생 미생물 분리 결과

희석법에 의해 3 종류의 영양분의 농도로 조정하여 제조된 MA 배지에 갯지렁이 추출물이 포함된 BM buffer 0.1 mL를 접종하여 분리 배양한 세균들을 분석하였다. MA 배지에서 생장하여 나타난 집락(colony)의 색깔과 모양에 따라 30개의 집락을 별도로 선별하여 순수배양한 후 16S rRNA 염기서열에 기초하여 동정한 결과, 11 균주가 Bacillus 속(genus), 1 균주가 Micrococcus 속, 1 균주가 Pantoea 속, 7 균주가 Shewanella 속, 10 균주가 Vibrio 속에 포함되는 것으로 밝혀졌다 (표 2).

16S rRNA 서열에 기초한 갯지렁이 유래 세균의 동정

Strain	Closest Relatives	Similarity (%)	Diff / Total nt
CBW1	Shewanella marisflavi SW-117T	98.4	23/1441
CBW2	Bacillus vietnamensis 15-1T	90.7	127/1362
CBW3	Bacillus barbaricus V2-BIII-A2T	96.8	46/1419
CBW4	Bacillus anthracis ATCC 14578T	94.2	76/1305
CBW5	Bacillus nanhaiensis JSM 082006T	99.2	11/1429
CBW6	Shewanella marisflavi SW-117T	98.8	18/1441
CBW7	Bacillus nanhaiensis JSM 082006T	99.6	5/1401
CBW8	Vibrio azureus LC2-005T	99.2	10/1298
CBW9	Bacillus algicola KMM 3737T	98.5	22/1443
CBW10	Vibrio azureus LC2-005T	98.8	15/1298
CBW11	Micrococcus yunnanensis YIM 65004T	99.0	13/1393
CBW12	Vibrio azureus LC2-005T	99.2	11/1298
CBW13	Vibrio azureus LC2-005T	99.2	10/1298
CBW14	Bacillus barbaricus V2-BIII-A2T	99.0	14/1419
CBW15	Bacillus vietnamensis 15-1T	98.0	27/1311
CBW16	Shewanella marisflavi SW-117T	98.6	20/1439
CBW17	Shewanella marisflavi SW-117T	97.5	36/1435
CBW18	Pantoea septica LMG 5345T	99.6	5/1340
CBW19	Shewanella marisflavi SW-117T	99.7	4/1416
CBW20	Bacillus aquimaris TF-12T	99.4	8/1403
CBW21	Bacillus aquimaris TF-12T	99.2	11/1401
EBW1	Vibrio azureus LC2-005T	98.5	19/1297
EBW2	Vibrio azureus LC2-005T	99.2	10/1298
EBW3	Vibrio azureus LC2-005T	99.4	8/1295
EBW4	Bacillus hwajinpoensis SW-72T	96.8	47/1446
EBW5	Vibrio azureus LC2-005T	99.2	11/1298
EBW6	Shewanella aquimarina SW-120T	98.0	30/1438
EBW7	Shewanella aquimarina SW-120T	98.0	29/1440
EBW8	Vibrio azureus LC2-005T	99.2	11/1298
EBW9	Vibrio azureus LC2-005T	99.2	10/1298

1.5. 16S rRNA 유전자 염기서열 및 계통관계 분석

세균의 16S rDNA 염기서열 분석은 분리 균주들을 액체 배지에서 30℃에서 2일-3일 동안 배양한 후 이로부터 추출된 chromosomal DNA를 PCR 반응의 주형으로, 프라이머는 Eub27F : 5' -AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG- 3'와 Eub1522R : 5' -AAG GAG GTG ATC CAR CCG CA- 3'로 이루어진 한 세트를 사용하였다.

PCR 반응은 GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems, CT)를 사용하여 수행하였고, 반응 조건은 95℃에서 5분간 초기 열처리를 한 후, 95℃에서 1분, 55℃에서 1분, 72℃에서 1분씩 30번 반복하여 마지막에는 72℃에서 1분간 처리한 후 4℃에서 보관하였다. 증폭된 DNA는 1.0% agarose gel에서 전기영동한 후 gel extraction kit(SolGent사)에 의해 회수되었다.

회수된 DNA는 pGEM-T easy vector(Promega, Madison, Wisconsin)에 ligation한 후 E. coli JM109에 형질전환하였다. 형질전환된 클론의 플라스미드 DNA를 분리한 후 promoter primer나 SP6 promoter primer를 이용하여 ABI 377 자동염기서열 분석기(Applied Biosystem, Foster, USA)에서 양방향으로 DNA sequencing을 수행하였다.

결정된 염기서열은 Ribosomal Database Project-Ⅱ(http://rdp.cme.msu.edu) GenBankhttp://ncbi.nlm.nih.gov)의 database를 이용하여 분석하였다. 염기서열이 결정된 미생물의 계통관계는 EZtaxon을 이용하여 type 균주들의 16S rNA 염기서열과의 관계를 나타내었다.

1.5.1. 엔도설판 분해균주 EDB2 의 16S rRNA 유전자 분석 결과

도 3은 분리한 로도코커스 피리디노보란스 EDB2 (Rhodococcus pyridinovorans EDB2) 균주의 16S rDNA 서열을 나타낸다. 도 4은 16S rRNA 서열에 의한 EDB2의 계통관계 분석결과를 나타낸다. 16S rDNA 염기서열에 기초한 분자계통분류학적 분석에서 균주 EDB2로 명명된 균주는 계통학적으로 Rhodococcus 속에 포함되었다. Rhodococcus 속에 속하며 biphenyl 분해능이 있는 R. pyridinivorans와 99.6%, R. rhodochrous와 98.5%의 염기서열 유사도를 보여주어, 균주 EDB2를 R. pyridinivorans EDB2로 명명하였다 (도 3). 균주 EDB-2와 가장 높은 상동성을 나타내는 R. pyridinivorans R04는 독성이 매우 강한 방향족 화합물인 biphenyl을 분해하는 것으로 알려져 있으며, R. sp. WTZ-R2는 Di(2-ethylhexyl)phthalate (DEHP)를 매우 효과적으로 제거할 능력이 있는 것으로 밝혀졌다.

따라서 본 발명에서 분리한 균주 R. pyridinivorans EDB2는 갯벌을 오염시키는 난분해성인 다양한 방향족 및 지방족 화합물을 제거하는데 활용할 수 있을 것으로 기대됨에 따라 다음에서 갯벌을 오염시키는 난분해성인 다양한 방향족 및 지방족 화합물을 제거에 대한 특성을 조사하였다.

1.5.2. 갯지렁이 유래 Bacillus 균주의 다양성 및 계통관계 분석

MA 배지에서 생장하여 나타난 집락(colony)의 색깔과 모양에 따라 선별한 31개의 집락을 별도로 선별하여 순수배양한 후 16S rRNA 염기서열에 기초하여 동정한 결과, 바실러스 알지콜라(Bacillus algicola ), 바실러스 안트라시시(Bacillus anthrasis), 바실러스 아퀴마리스( Bacillus aquimaris ), 바실러스 바바리쿠스( Bacillus barbaricus ), 바실러스 화진포엔시스( Bacillus hwajinpoensis ), 바실러스 난히엔시스(Bacillus nanhiensis ), 바실러스 비에트남엔시스(Bacillus vietnamensis) 등의 Bacillus 속에 포함되는 11종의 균주를 분리하였다.

본 발명에서 밝혀진 11개의 Bacillus 균의 16S rRNA 염기서열을 기초로 계통관계를 분석하였을 때 크게 5개 그룹으로 구분되었으며, 그 중 균주 그 중 Bacillus 균주 바실러스 안트레시스(이하 "CBW4" 라 한다)와 바실러스 화진포엔시스(이하 "EBW4" 라 한다)의 특성을 분석하였다. 특히 균주 CBW2와 CBW4는 Bacillus vietnamensis 15-1^T 및 Bacillus anthracis ATCC 14578^T와 각각 90.7%와 94.2%의 상동성을 보였으며, EBW4는 Bacillus hwajinpoensis SW-72^T와 96.8%의 상동성을 보여 신종(new species) 균주로 밝혀졌다. 도 5는 갯지렁이로부터 분리 동정한 바실러스 균주 CBW4의 16S rDNA 유전자의 염기서열을 나타내고, 도 6은 갯지렁이로부터 분리 동정한 바실러스 균주 EBW4의 16S rDNA 유전자의 염기서열을 나타낸다. 도 7은 동정된 갯지렁이 유래 Bacillus sp. 균주의 계통관계를 나타내는 모식도이다. 갯지렁이에 내생하는 미생물에 대한 발명은 본 발명에서 처음 밝혀진 것으로 이들 미생물군의 기능과 관련해서는 심층적인 분석이 이루어질 필요가 있다.

본 발명에서 갯지렁이(Perinereis aibuhitensis)로부터 분리한 세균 중 우점종으로 나타난 다양한 Bacillus에 대한 정보는 본 발명에서 처음으로 보고하는 것으로 파악됨에따라 유기물 분해능이 뛰어나 선별한 두 개의 Bacillus 균주 CBW4와 EBW4에 대한 특성을 자세히 조사하였다.

2. 연안 갯벌 및 갯지렁이에서 동정한 균주의 환경조건별 생장 특성

2.1. 환경 조건별 균주 생장 시험

본 발명에서는 온도, PH, 염도 등 세 가지 환경 조건을 달리하여 균주의 생장 여부를 조사하였다. 균 생장의 적정 온도 범위를 정하기 위해 균주를 LB 배지에 접종한 후 4℃, 20℃, 30℃, 37, 42℃, 45℃에서 배양하였으며, 30℃이하는 LB 고체 배지에, 40℃부터는 LB 액체 배지에 균주를 접종한 후 수조(water bath)에서 배양하면서 생장 여부를 관찰하였다.

균 생장의 적정 염도범위는 sodium chloride를 이용하여 LB 배지의 염도를 0%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%로 조정하였고, 균 생장의 적정 pH 범위는 NaOH와 HCl을 이용하여 LB 배지의 pH를 pH3에서 pH11까지 pH1 단위로 조정하여 사용하였다. 균주의 생장 여부는 균주 접종 후 각 균주의 적정 생장 온도에서 5일간 배양하면서 생장여부를 확인하였다.

2.2. 연안 갯벌 및 갯지렁이에서 동정한 균주의 환경조건별 생장 특성

2.2.1. 연안 갯벌에서 동정한 균주의 환경조건별 생장 특성

가. EDB2 의 배지생장 시험 결과

균주 EDB2가 어떤 배지에서 생장할 수 있는 지를 분석하기 위하여, marine agar (MA), Luria-Bertani (LB), nutrient agar (NA), R₂A, tryptic soy broth (TSA) 등 5개의 다른 배지를 사용하여 분석한 결과, 시험한 모든 배지에서 잘 생장하는 것으로 나타났다 (표 3).

다양한 배지에서 균주 EDB-2의 생장능 시험

Medium	MA	LB	NA	R2A	TSA
EDB2	+++	+++	+++	+++	+++

나. 온도가 균주 EDB2의 생장에 미치는 영향

균주 EDB2가 생장할 수 있는 온도 범위를 조사하기 위하여, 4℃에서 45℃ 범위에서 생장여부를 조사하였다. 균주 EDB2는 25℃에서 42℃ 범위에서 생장하는 것으로 나타났다(표 4).

균주 EDB-2의 생장에 미치는 온도의 영향

Temp (℃)	4	10	25	30	37	42	45
EDB2	-	-	+++	+++	+++	+++	-

다. pH가 균주 EDB2의 생장에 미치는 영향

균주 EDB2가 생장할 수 있는 pH 범위를 조사하기 위하여, pH4에서 pH11 범위에서 생장여부를 조사하였다. 균주 EDB2는 pH5에서 pH10 범위에서 생장하는 것으로 나타났다(표 5).

균주 EDB-2의 생장에 미치는 온도의 영향

pH	4	5	6	7	8	9	10	11
EDB2	-	+++	+++	+++	+++	+++	+++	-

라. 염도가 균주 EDB2의 생장에 미치는 영향

균주 EDB2가 생장할 수 있는 염분도의 범위를 결정하기 위하여 0-12% Zobell sea salts가 포함된 배지에서 균주 EDB2의 생장 여부를 관찰하였다. 균주 EDB2는 염분이 없이도 성장하였으나, 10% 이상의 염분도에서는 생장하지 않았다 (표 6).

균주 EDB-2의 생장에 미치는 염도의 영향

Salinity (%)	0	1	2	3	4	5	6	7
EDB2	+++	+++	+++	+++	+++	+++	+++	+++

2.2.2. 갯지렁이에서 동정한 Bacillus 균주의 배지 이용능 시험 결과

본 발명에서 선별한 두 Bacillus 균주를 MA(marine agar), NA(nutrient agar), TSA (tryptic soy agar), R₂A, LB (Luria-Bertani)배지에서 이용한 생장능을 시험한 결과, CBW4와 EBW4는 일부는 육상 혹은 담수에서 유래한 Bacillus 균주와는 다르게 LB, TSA, 또는 NA 배지에서 생장하지 못하는 것으로 나타났고, 시험한 두 균주 모두 다량의 염분을 포함하고 있는 MA배지에서 생장하는 것으로 나타나 염분 요구성이 모두 큰 것으로 나타났다(표 7).

다양한 배지에서 생장능 시험

Strain	MA	LB	TSA	NA	R 2 A
CBW4	+	+	+	-	+
EBW4	+	-	-	+	+

3. 연안갯벌 및 갯지렁이에서 동정한 신규주의 생리, 생화학적 특성

3.1. 연안 갯벌에서 동정한 균주의 세균의 형태적, 생리, 생화학적 특성 분석

세균의 형태적, 생리적 특성을 보기 위해 균주들을 sea salts가 첨가된 LBSS 고체배지에 접종하여 25℃에서 배양하였다. 먼저 5-7일 동안 배양하면서 형성되는 단일 콜로니의 형태, 색깔, 크기를 관찰하였으며, 균주의 형태와 크기는 광학 현미경과 주사전자현미경을 이용하여 관찰하였다. 전자현미경 관찰 시, 배양된 세균을 4% glutaraldehyde로 2시간 동안 고정시킨 후 50mM phosphate 완충용액 (pH 7.2)을 이용하여 세척하였다.

그리고 2% osmium tetroxide 용액에 1시간 고정한 후 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100% 에탄올로 탈수시킨 후 동결건조 시켰다. 이 후 ion sputter를 이용하여 gold coating을 한 후 전자현미경을 이용하여 관찰하였다. 균주의 운동성은 0.4%의 agar를 포함시킨 semisolid 배지에서 확인하였고, 산소 대사와 관계된 oxidase는 Oxidase Reagent Kit(BioMㅹrieux)를 이용하여 콜로니색의 변화로 분석하였다. Catelase는 3% 과산수소를 균체에 떨어뜨려 거품이 발생 유, 무로 판단하였다.

기타 분리 균주의 생리, 생화학적 특성은 여러 가지 API kit(BioMㅹrieux)를 하용하였으며, API 20E, APL 20NE, API 50CHB, 그리고 API ZYM kit를 동시에 이용하여 균주의 특성을 조사하였다. 이때 균주는 LBSS 고체배지를 이용하여 25℃에서 2일-3일간 배양하였으며, 성장된 균체는 멸균된 3% sea salt 용액에 현탁하여 제조회사의 지시에 따라 수행하였다. 주요 조사 항목으로는 nitrate 환원반응, esterase(C4), esterase lipase(C8), leucine arylamidase, acid phosphatase, naphtol-AS-Bi-phosphohydrolase, glucose acidification, gelatin 액화, arginine dihydrolase, urease, β-glucosidase, β-galactosidase, alkalin phosphatase, lipase(C14) 등이 효소활성 유무, indole 생성 여부 등을 들 수 있다. 또한 탄소원 mannitol, gluconate, malate, citrate, glucose, arabinose, mammose, N-acetyl-glucosamine, maltose, caprate, adipate, phenyl-acetate 등의 동화 여부 등에 대하여 조사하였다.

도 8은 API 20 E에 의한 EDB2의 생화학적 특성 분석결과를 나타내고, 도 9는 API 20 NE에 의한 EDB2의 생화학적 특성 분석결과를 나타내며, 도 10은 API CHB/E에 의한 EDB2의 생화학적 특성 분석결과를 나타낸다. 또한 도 11은 API ZYM에 의한 EDB2의 생화학적 특성 분석결과를 나타낸다.

가. API 20 E에 의한 EDB2 생화학적 특성 분석 결과

균주 EDB2의 생화학적 특성을 API 20 E kit의 20 가지 기질을 사용하여 분석한 결과, 균주 EDB2는 urease를 갖고 있어 urea를 이용하였고, Voges-Proskauer 시험을 통해 당을 발효하여 acetoin을 생산할 수 있는 능력이 있음을 확인하였다. 여러 당 기질을 사용하여 산화-발효 실험 결과 시험한 9개 기질 (amygdalin, arabinose, glucose, inositol, mannitol, melibiose, rhamnose, sorbitol, sucrose)을 사용하였을 때 모두 산화나 발효 반응을 나타내지 않았다 (도 8).

나. API 20 NE 에 의한 EDB2 생화학적 특성 분석 결과

균주 EDB2의 생화학적 특성을 API 20 NE kit의 20 가지 기질을 사용하여 분석한 결과, 균주 EDB2는 nitrate reduction 능력을 갖고 있으며, PNPG를 기질로 하였을 때 β-galactosidae 양성 반응을 나타내었다. Mannitol과 malate 이용능이 있었다(도 9).

다. API CHB/E에 의한 EDB2 생화학적 특성 분석 결과

균주 EDB2의 생화학적 특성을 API CHB/E kit의 48 가지 기질을 사용하여 분석한 결과, 균주 EDB2는 sorbitol과 esculin 양성 반응을 나타내었고, 나머지 기질에 대해서는 음성반응을 보였다(도 10).

라. API ZYM에 의한 EDB2 생화학적 특성 분석 결과

균주 EDB2의 생화학적 특성을 API ZYM kit의 20 종류의 효소능을 측정한 결과, 균주 EDB2는 alkaline phosphatase, esterase lipase, leucine arylamidase, trypsin, acid phosphatase, α-glucosidase, 그리고 β-glucosidase 효소를 갖고 있음이 밝혀졌다(도 11).

3.2. 갯지렁이에서 동정한 균주의 형태적, 생리, 생화학적 특성 분석

세균의 형태적, 생리적 특성을 보기 위해 균주들을 MA(marine agar) 고체배지에 접종하여 25℃에서 배양하였다. 먼저 5-7일 동안 배양하면서 형성되는 단일 콜로니의 형태, 색깔, 크기를 관찰하였으며, 균주의 형태와 크기는 광학 현미경과 주사전자현미경을 이용하여 관찰하였다. 전자현미경 관찰시, 배양된 세균을 4% glutaraldehyde로 2시간 동안 고정시킨 후, 50mM phosphate 완충용액 (pH 7.2)을 이용하여 세적하였다. 그리고 2% osmium tetroxide 용액에 1시간 고정한 후 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100% 에탄올로 탈수시킨 후 동결건조 시켰다. 이 후 ion sputter를 이용하여 gold coating을 한 후 전자현미경을 이용하여 관찰하였다.

균주의 운동성은 0.4%의 agar를 포함시킨 semisolid 배지에서 확인하였고, 산소 대사와 관계된 oxidase는 Oxidase Reagent Kit(BioMㅹrieux)를 이용하여 콜로니 색의 변화로 분석하였다. Catelase는 3% 과산수소를 균체에 떨어뜨려 거품이 발생 유, 무로 판단하였다.

기타 분리 균주의 생리, 생화학적 특성은 여러 가지 API kit(BioMㅹrieux)를 하용하였으며, API 20E, APL 20NE, API 50CHB, 그리고 API ZYM kit를 동시에 이용하여 균주의 특성을 조사하였다. 이때 균주는 MA 고체배지를 이용하여 25℃에서 2일-3일간 배양하였으며, 성장된 균체는 멸균된 3% sea salt 용액에 현탁하여 제조회사의 지시에 따라 수행하였다. 주요 조사 항목으로는 nitrate 환원반응, esterase(C4), esterase lipase(C8), leucine arylamidase, acid phosphatase, naphtol-AS-Bi-phosphohydrolase, glucose acidification, gelatin 액화, arginine dihydrolase, urease, β-glucosidase, β-galactosidase, alkalin phosphatase, lipase(C14) 등이 효소활성 유무, indole 생성 여부 등을 들 수 있다. 또한 탄소원 mannitol, gluconate, malate, citrate, glucose, arabinose, mammose, N-acetyl-glucosamine, maltose, caprate, adipate, phenyl-acetate 등의 동화 여부 등에 대하여 조사하였다.

3.2.1. 갯지렁이 유래 선별 Bacillus 균주의 생리생화학적 특성 분석 결과

API 20NE kit를 이용하여 Bacillus 균주의 생리생화학적 특성을 분석하였다. 균주 CBW4와 EBW4 모두가 β-glucosidase와 protease 효소 활성을 가지고 있었고, maltose를 이용할 수 있는 것으로 나타났다(표 8).

API 20NE kit를 이용한 Bacillus 균주의 특성 분석

Test	Reactions / Enzymes	CBW4	EBW4
NO3	reduction of nitrates to nitrites // reduction of nitrates to nitrogen	+/-	+/-
TRP	indole production	-	-
GLU	acidification	-	-
ADH	arginine dihydrolase	-	-
URE	urease	-	-
ESC	hydrolysis(β-glucosidase)	+	+
GEL	hydrolysis(protease)	+	+
PNPG	β-galactosidase	-	w+
GLU	glucose assimilation	W+	w+
ARA	arabinose assimilation	W+	w+
MNE	mannose assimilation	-	w+
MAN	mannitol assimilation	W+	+
NAG	N-acetyl-glucosamine assimilation	W+	w+
MAL	maltose assimilation	+	+
GNT	gluconate assimilation	W+	W+
CAP	caprate assimilation	-	-
ADI	adipate assimilation	W+	w+
MLT	malate assimilation	w+	w+
CIT	citrate assimilation	W+	w+
PAC	phenyl-acetate assimilation	W+	w+

API 20E kit를 이용한 시험 결과, 균주 CBW4는 arginine dihydrolase, lysine decarboxylase, gelatinase 활성이 높은 것으로 나타난 반면, EBW4는 β-glucosidase와 gelatinase 활성을 가지고 있었다(표 9).

API 20E kit를 이용한 Bacillus 균주의 특성 분석

Test	Reactions / Enzymes	CBW4	EBW4
OPNG	Beta-galactosidase	-	+
ADH	Arginine dihydrolase	+	-
LDC	Lysine decarboxylase	+	-
ODC	Ornithine decarboxylase	-	-
CIT	Citrate utilization	-	-
H2S	H2S production	-	-
URE	Urease	-	-
TDA	Tryptophane deaminase	-	-
IND	Indole production	-	-
VP	Acetoin production	-	-
GEL	gelatinase	+	+
GLU	Glucose F/O	-	-
MAN	Mannitol F/O	-	-
INO	Inositol F/O	-	-
SOR	Sorbitol F/O	-	-
RHA	Rhamnose F/O	-	-
SAC	Sucrose F/O	-	-
MEL	Melibiose F/O	-	-
AMY	Amygdalin F/O	-	-
ARA	Arabinose F/O	-	-

API 50CHB/E kit를 이용한 시험 결과, 균주 CBW4와 EBW4 모두 glycerol, ribose, glucose, fructose, esculin, cellobiose, maltose, trehalose, starch를 이용할 수 있는 능력이 있는 것으로 나타났다. 이외에 CBW4는 arbutin, salicin, lactose 등을 이용할 수 있는 능력이 있는 반면, EBW4는 이들을 이용할 수 없었으나, CBW4 균주가 이용하지 못하는 mannose, mannitol, α-methyl-D-glucoside, N-acethyl-glucosamine, melibiose, sucrose, raffinose, D-turanose 등 다양한 당을 이용하는 것으로 나타나 두 균주가 상당히 다른 특성을 갖고 있었다(표 10).

API 50CHB/E kit를 이용한 Bacillus 균주의 특성 분석

No .	Substrate	CBW4	EBW4
0	CONTROL	-	-
1	GLYcerol	+	+
2	ERYthritol	-	-
3	DARAbinose	-	-
4	LArbinose	-	-
5	RIBose	+	+
6	DXYLose	-	-
7	LXYLose	-	-
8	ADOnitol	-	-
9	β-Methyl-D-Xyloside	-	-
10	GALzctose	-	+
11	GLUcose	+	+
12	FRUctose	+	+
13	MaNnosE	-	+
14	SorBosE	-	-
15	RHAmnose	-	-
16	DULcitol	-	-
17	INOsitol	-	-
18	MANnitol	-	+
19	SORbitol	-	-
20	α-Methyl-D-Mannoside	w+	-
21	α-Methyl-D-Glucoside	w+	+
22	N-Acethyl-Glucosamine	w+	+
23	AMYgdalin	w+	w+
24	ARButin	+	w+
25	Esculin	+	+
26	SALicin	+	w+
27	CELlobiose	+	+
28	MALtose	+	+
29	LACtose	+	-
30	MELibiose	-	+
31	Sucrose	-	+
32	TREhalose	+	+
33	INUlin	-	-
34	MeLeZitose	-	w+
35	RAFfinose	-	+
36	Starch	+	+
37	GLYcoGen	w+	+
38	XyLiTol	-	-
39	GENtiobiose	-	-
40	DTURanose	-	+
41	DLYXose	-	-
42	DTAGatose	-	-
43	DFUCose	-	-
44	LFUCose	-	-
45	DArabitoL	-	-
46	LArabitol	-	-
47	GlucoNaTe	-	w+
48	2-keto-Gluconate	-	W+
49	5-keto-Gluconate	-	-

API ZYM kit를 이용한 효소활성 시험 결과, 균주 CBW4와 EBW4 모두 alkaline phosphatase, leucine arylamidase, α-chymotrypsin 활성을 가지고 있는 것으로 나타났다. 이외에 CBW4는 매우 높은 acid phosphatase 활성과 함께 β-glucosidase 활성을 가지고 있는 것으로 조사되었다. EBW4는 CBW4 균주에서는 탐지하지 못한 esterase 활성을 갖고 있었다(표 11).

API ZYM kit를 이용한 Bacillus 균주의 특성 분석

NO .	Enzyme Assayed For	CBW4	EBW4 -1
1	Control
2	Alkaline phosphatase	4+	4+
3	Esterase (C4)	1-	3+
4	Esterase Lipase (C8)	1-	2-
5	Lipase (C14)	0-	0-
6	Leucine arylamidase	4+	3+
7	Valine arylamidase	2-	2-
8	Crystine arylamidase	1-	1-
9	Trypsin	2-	0-
10	α-chymotrypsin	3+	3+
11	Acid phospatase	5+	0-
12	Naphtol-AS-Bl-phosphohydrolase	1-	0-
13	α-galactosidase	0-	0-
14	β-galactosidase	0-	2-
15	β-glucuronidase	0-	0-
16	α-glucosidase	2-	2-
17	β-glucosidase	4+	0-
18	N-acetyl-β-glucosaminidase	0-	0-
19	α-mannosedase	0-	0-
20	α-fucosidase	0-	0-

4. 연안갯벌에서 동정한 균주의 유기물 정화용 제제로의 응용

도 12은 고체 및 액체 배지에서 앤도설판을 이용할 수 있는 균주 EDB-2의 순수배양결과를 나타내고 도 13 HPLC에 의한 균주 EDB2의 엔도설판 분해능 시험결과를 나타낸다.

4.1. 고분자 물질 분해 효소 활성 시험

고분자 유기물질 분해능을 시험하기 위해 셀룰로오스, 녹말, 카세인, 그리고 Tween80이 포함된 LB 고체 배지에 본 발명에서 분리하여 선별한 EDB2, Bacillus 균주, CBW4(기탁번호: KACC91722P)와 EBW4(기탁번호:KACC91749P)를 배양액에 접종한 후, 이들 고분자 물질 분해에 관련된 효소, cellulase, amylase, protease, 그리고 lipase 활성이 있는지에 대해 조사하였다. 균주의 셀룰로오스 분해능은 접종 후 30℃에서 3일 배양 후 congo red로 30분간 염색 후 1M NaCl을 이용하여 5분간 탈색하여 형성된 투명환으로, 녹말 분해는 iodine으로 30분 염색 후 1M NaCl로 5분간 탈색하여 형성된 투명환으로 판단하였다.

카세인과 Tween80은 각각 2일, 3일 배양하여 별다른 염색과정을 거치지 않고 육안으로 관찰된 투명환으로 분해능을 확인하였다. Alkaline protease 활성은 0.5% 농도의 Hammerstan casein (Merck)을 이용하여 100mM Tris- -HCl buffer (pH 10.0)에서 결정하였다 (Joo et al., 2002). 효소활성의 1 Unit는 표준 분석 조건하에서 50℃에서 분당 1g의 티로신을 방출하는 효소의 양으로 정의된다.

4.1.1 EDB2 의 고분자 유기물 분해능 시험

가. EDB2의 고분자 유기물 분해능 시험

균주 EDB2에 의한 유기물 분해능 시험을 실시한 결과, 균주 EDB2는 지질과 탄수화물 분해능이 우수한 것으로 조사되었으며, 핵산분해 효소에 대한 활성도 높은 것으로 나타났다 (표 12).

균주 EDB-2에 의한 고분자 유기물 분해능 시험

Salinity (%)	Starch (1%)	DNase	CM/ Cellulose	Casein (1%)	Tween
					20	40	60	80
EDB2	+++	+++	-	-	+	+++	+++	++

나. 순수 배양된 단일 미생물에 대한 유기물 분해능 평가 및 우수 미생물 선별

농화배양을 통해 분리된 단일균주를 사용하여 10ppm의 엔도설판을 단일 탄소원 및 에너지원으로 첨가한 BM배지에서 분해능을 조사하고, 그 중 분해능이 매우 우수한 균주를 선별하였다. 엔도설판 농화배양액으로부터 순수분리한 각 균주를 단일탄소원 및 에너지원으로 엔도설판이 포함된 고체배지와 액체배지에서 엔도설판 분해능을 측정한 결과, EDB2는 매우 잘 성장하였으며, HPLC 분석을 통해 엔도설판 분해능이 매우 뛰어난 균주로 확인되었다 (도 12, 도 13).

HPLC 분석을 위해 5ppm 농도로 엔도설판을 처리하여 EDB2에 의한 엔도설판 분해능을 측정한 결과, 배양 후 7일 만에 약 85%의 엔도설판 분해능을 나타내었다. 엔도설판 분해능이 가장 우수한 것으로 평가되는 균주 EDB2를 선정하여 균 동정을 실시하고 생리, 생화학, 유전학적 특성을 조사하는데 사용하였다.

4.1.2 갯지렁이 유래 선별 Bacillus 균주의 고분자 분해 효소 활성 시험 결과

고분자 분해효소 활성 시험을 통하여 균주 CBW4와 EBW4 모두가 DNAse 활성과 함께, 카제인을 분해하여 단백질 분해 효소 활성을 가지고 있었다. CBW4는 strach를 분해하는 효소 활성을 가지고 있었으나 EBW4는 starch 분해능이 없는 것으로 나타났다. 또한, CBW4와 EBW4 모두 대부분의 Tween을 분해하는 것으로 나타나 지질 분해 효소 활성을 가지고 있는 것으로 나타났다.

따라서 본 발명에서 갯지렁이로부터 분리하여 선별한 두 Bacillus 균주들은 단백질, 탄수화물, 지질 분해능이 뛰어나 유기물로 오염된 갯벌 환경을 정화하는데 유용하게 쓰일 수 있을 것이다 (표 13).

고분자 분해 효소 활성 시험

Strain	Starch 1%	DNAse	CM / cellulose	Casein 1%	Tween
					20	40	60	80
CBW4	+	+	-	+	+	+	+	+
EBW4	-	+	-	+	-	+	+	+

4.2. 신규 균주의 갯벌 정화용 제제로의 응용

16S rRNA 염기서열 분석결과, EDB2는 Rhodococcus속에 포함되는 종으로 밝혀졌다. 앞에서 설명한 바와 같이, Rhodococcus 속은 다른 생물에 의하여 쉽게 분해될 수 없는 난분해성 물질을 제거하는데 탁월한 능력이 있으며, 오염물질로 오염된 환경을 생물학적으로 처리하는데 가장 유망한 그룹 중의 하나로 여겨지고 있다. Rhodococcus 속에 의하여 분해되는 난분해성 물질에는 지방족과 방향족 탄화수소, 산화물, 할로겐 화합물 등 다양한 범위의 화합물이 있다.

이들 화합물의 대부분은 난분해성으로 독성을 가진 복잡한 합성 분자들로 미국 환경보호청(EPA) 제1 오염물질 목록(USEPA, 1996)과 독성물질 및 질병 등록청의 위험물질의 제 1목록(ATSDR, 1997)에 포함되어 있다. 환경 생명공학에서 Rhodococcus의 중요성은 매우 강조되어 왔으며 오염물질을 분해하는데 있어 주로 생물 촉매로서 이들 속의 역할에 대해 많은 논의가 이루어져왔다. 따라서 Rhodococcus는 환경복원에 적합한 기구로서 균주 혹은 그들이 생산하는 효소가 활용될 수 있을 것으로 여겨지고 있다.

본 발명의 갯벌로부터 동정된 새로운 균주 로도코커스 피리디니보란스(Rhodococcus pyridinivorans) EDB2, 기탁번호: KACC91762P)와 갯지렁이로부터 동정된 새로운 균주 바실러스 속(Bacillus sp .) CBW4(기탁번호: KACC91722P)와 EBW4(기탁번호:KACC91749P)를 동일 비율로 액체 배양액에 접종하여 온도 25℃ 내지 42℃, pH5 내지 pH10에서 1-2일간 배양하였으며, 배양단계에서 얻은 결과물 일부를 액상 미생물제제로, 남은 일부를 무균적으로 건조시키고, 건조단계 후 얻어진 결과물을 무균적으로 분쇄하는 단계를 거쳐 분말형태의 미생물제제로 제조하였다. 도 14는 갯벌 유래 복합 균주를 이용하여 미생물제제를 제조 과정을 나타낸다. 도 15는 갯벌 유래 복합 균주를 이용하여 제조된 미생물제제의 예를 나타낸다.

액상제조물의 경우는 색상조절을 위한 부형제로서 식용색소 등이 첨가될 수 있고, 저장성 개선을 위한 부형제로서 비타민 C등이 첨가될 수 있으며, 효소능력 활성화를 위한 부형제로서 Tween80등이 첨가될 수 있다. 고체분말용의 경우는 발효용 부형제로서 미강, 탈지강, 당밀 등이 부가적으로 첨가되고, 저장성 개선용 부형제로서 규산염 등이 첨가 가능하다.

이와 같이 갯벌에서 분리한 새로운 균주 로도코커스 피리디니보란스(Rhodococcus pyridinivorans) EDB2, 기탁번호: KACC91762P)와 갯지렁이로부터 동정된 새로운 균주 바실러스 속(Bacillus sp .) CBW4(기탁번호: KACC91722P)와 EBW4(기탁번호:KACC91749P)의 복합 배양에 의한 미생물제제는 유기물 분해능이 확인됨에 따라 엔도설판 등 독성이 강한 물질로 오염된 연안 갯벌을 복원하는데 매우 유용하게 활용할 수 있을 것으로 사료된다.

본 발명의 미생물은 DNA, agar, starch 그리고 tween의 분해 능력이 있는 것으로 나타나 지질 분해능이 우수하여 엔도설판 등의 화합물들을 광범위하게 생분해할 수 있어, 2차 환경오염을 일으키지 않고 효율적으로 연안 갯벌의 오염된 환경을 정화하는데 유용하게 활용할 수 있을 것이다.

농업생명공학연구원 KACC91762 20121122 농업생명공학연구원 KACC91749 20121026 농업생명공학연구원 KACC91722 20120608

<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> Bacillus spp., identified from lugworm and microbial cleaning agent <130> P201212064 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1378 <212> RNA <213> Bacillus sp. EBW4 <400> 1 tcgagcgaat ggattgagag cttgctctta tgaagttagc ggcggacggg tgagtaacac 60 gtgggtaacc tgcccataag actgggataa ctccgggaaa ccggggctaa taccggataa 120 tattttgaac tgcatggttc gaaattgaaa ggcggcttcg gctgtcactt atggatggac 180 ccgcgtcgca ttagctagtt ggtgaggtaa cggctcacca aggcaacgat gcgtagccga 240 cctgagaggg tgatcggcca cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca 300 gcagtaggga atcttccgca atggacgaaa gtctgacgga gcaacgccgc gtgagtgatg 360 aaggctttcg ggtcgtaaaa ctctgttgtt agggaagaac aagtgctagt tgaataagct 420 ggcaccttga cggtacctaa ccagaaagcc acggctaact acgtgccagc agccgcggta 480 atacgtaggt ggcaagcgtt atccggaatt attgggcgta aagcgcgcgc aggtggtttc 540 ttaagtctga tgtgaaagcc cacggctcaa ccgtggaggg tcattggaaa ctgggagact 600 tgagtgcaga agaggaaagt ggaattccat gtgtagcggt gaaatgcgta gagatatgga 660 ggaacaccag tggcgaaggc gactttctgg tctgtaactg acactgaggc gcgaaagcgt 720 ggggagcaaa caggattaga taccctggta gtccacgccg taaacgatga gtgctaagtg 780 ttagagggtt tccgcccttt agtgctgaag ttaacgcatt aagcactccg cctggggagt 840 acggccgcaa ggctgaaact caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg 900 tggtttaatt cgatgcaacg cgaagaacct tacctactct tgacatccag agaattcgct 960 agagatagct tagtgccttc gggagctctg agacaggtgc tgcatggctg tcgtcagctc 1020 gtgttgtgaa atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccttatcct tacttgccag 1080 cgggtcatgc cgggaacttt agggagactg ccggtgataa accggaggaa ggtggggacg 1140 acgtcaagtc atcatggccc ttacgagtag ggctacacac gtgctacaat ggcgagtaca 1200 gagggttgcg aagccgcgag gtggagctaa tctcagaaag ctcgtcgtag tccggattgg 1260 agtctgcaac tcgactccat gaagtcggaa tcgctagtaa tcgtggatca gaatgccacg 1320 gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccatgggagt gggctgca 1378 <210> 2 <211> 1374 <212> RNA <213> Bacillus sp. CBW4 <400> 2 tcgagcgaat gatgaggagc ttgctcctct gatttagcgg cggacgggtg agtaacacgt 60 gggtaatctg cctgtaagac ggggataact ccgggaaacc ggggctaata ccggataaca 120 agagaagaag catttcttct ttttgaaagt cggtttcggc tgacacttac agatgagccc 180 gcggcgcatt agctagttgg tgaggtaacg gctcaccaag gcgacgatgc gtagccgacc 240 tgagagggtg atcggccaca ctgggactga gacacggccc agactcctac gggaggcagc 300 agtagggaat cttcggcaat gggcgaaagc ctgaccgagc aacgccgcgt gagcgatgaa 360 ggccttcggg tcgtaaagct ctgttgttag agaagaacaa gtacgagagt aactgctcgt 420 accttgacgg tacctaacca gaaagccacg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata 480 cgtaggtggc aagcgttatc cggaattatt gggcgtaaag cgcgcgcagg cggtctctta 540 agtctgatgt gaaagcccac ggctcaaccg tggagggtca ttggaaactg ggagacttga 600 gtgcaggaga gaaaagtgga attccacgtg tagcggtgaa atgcgtagag atgtggagga 660 acaccagtgg cgaaggcggc tttttggcct gtaactgacg ctgaggcgcg aaagcgtggg 720 gagcaaacag gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa acgatgagtg ctaggtgttg 780 gggggttcca ccctcagtgc tgaagttaac acattaagca ctccgcctgg ggagtacgac 840 cgcaaggttg aaactcaaag gaattgacgg gggcccgcac aagcagtgga gcatgtggtt 900 taattcgaag caacgcgaag aacccttacc aggtcttgac atcctctgac cactctagag 960 atagagcttt ccccttcggg ggacagagtg acaggtggtg catggttgtc gtcagctcgt 1020 gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cttgacctta gttgccagca 1080 ttcagttggg cactctaagg tgactgccgg tgacaaaccg gaggaaggtg gggatgacgt 1140 caaatcatca tgccccttat gacctgggct acacacgtgc tacaatggat ggtacaaagg 1200 gttgcgaagc cgcgaggcca agccaatccc aaaaagccat tctcagttcg gattgtaggc 1260 tgcaactcgc ctacatgaag ccggaattgc tagtaatcgc ggatcagcat gccgcggtga 1320 atacgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcacaccac gagagtttgt aaca 1374 <210> 3 <211> 1429 <212> RNA <213> Rhodococcus pyridinivorans EDB2 <400> 3 cggggggtgg cgcgtgctac catgcagtcg aacgatgaag cccagcttgc tgggtggatt 60 agtggcgaac gggtgagtaa cacgtgggtg atctgccctg cactctggga taagcctggg 120 aaactgggtc taataccgga tatgacctcg ggatgcatgt tctggggtgg aaagtttttc 180 ggtgcaggat gagcccgcgg cctatcagct tgttggtggg gtaatggcct accaaggcga 240 cgacgggtag ccggcctgag agggcgaccg gccacactgg gactgagaca cggcccagac 300 tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg cacaatgggc gcaagcctga tgcagcgacg 360 ccgcgtgagg gatgacggcc ttcgggttgt aaacctcttt cacccatgac gaagcgcaag 420 tgacggtagt gggagaagaa gcaccggcca actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta 480 gggtgcgagc gttgtccgga attactgggc gtaaagagct cgtaggcggt ttgtcgcgtc 540 gtctgtgaaa tcccgcagct caactgcggg cttgcaggcg atacgggcag actcgagtac 600 tgcaggggag actggaattc ctggtgtagc ggtgaaatgc gcagatatca ggaggaacac 660 cggtggcgaa ggcgggtctc tgggcagtaa ctgacgctga ggagcgaaag cgtgggtagc 720 gaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacgg tgggcgctag gtgtgggttt 780 ccttccacgg gatccgtgcc gtagccaacg cattaagcgc cacgcctggg gagtacggcc 840 gcaaggctaa aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggcggag catgtggatt 900 aattcgatgc aacgcgaaga accttacctg ggtttgacat gtaccggacg actgcagaga 960 tgtggtttcc cttgtgggcc ggtagacagg tggtgcatgg ctgtcgtcag ctcgtgtcgt 1020 gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttgt cctgtgttgc cagcacgtga 1080 tggtggggac tcgcaggaga ctgccggggt caactcggag gaaggtgggg acgacgtcaa 1140 gtcatcatgc cccttatgtc cagggcttca cacatgctac aatggtcggt acagagggct 1200 gcgataccgt gaggtggagc gaatccctta aagccggtct cagttcggat cggggtctgc 1260 aactcgaccc cgtgaagtcg gagtcgctag taatcgcaga tcagcaacgc tgcggtgaat 1320 acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacgtcatga aagtcggtaa cacccgaagc 1380 cggtggccta accccttgtg ggagggagcc gtcgaatgtg atcgtaccc 1429

Claims (11)

1. 염분 내성이 있고 유기물 분해능이 있는 연안 갯벌에서 동정된 로도코커스 피리디니보란스(Rhodococcus pyridinivorans) EDB2와 염분 내성이 있고 유기물 분해능이 있는 갯지렁이로부터 동정된 바실러스(Bacillus sp.) 속의 균주 CBW4와 EBW4를 배양하여 얻은 것을 특징으로 하는 갯벌 정화용 미생물 정화제의 제조방법.
   
2. 제1항에 있어서, 균주 EDB2, CBW4, EBW4는 기탁번호가 KACC91762P, KACC91722P, KACC91749P인 것을 특징으로 하는 갯벌 정화용 미생물 정화제의 제조방법.
   
3. 제2항에 있어서 배양은 균주를 배양액에 접종하여 25-30℃에서 1-2일간 배양하는 것을 특징으로 하는 갯벌 정화용 미생물 정화제의 제조방법.
   
4. 제3항에 있어서 액상제조물에 색상조절을 위한 부형제 또는 저장성 개선을 위한 부형제 또는 효소능력 활성화를 위한 부형제중에서 선택되는 어느 하나의 물질이 부가적으로 첨가하는 것을 특징으로 하는 갯벌 정화용 미생물 정화제의 제조방법.
   
5. 제4항에 있어서, 배양단계에서 얻은 결과물을 무균적으로 건조시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 갯벌 정화용 미생물 정화제의 제조방법.
   
6. 제5항에 있어서 상기 건조단계 후 얻어진 결과물을 무균적으로 분쇄하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 갯벌 정화용 미생물 정화제의 제조방법.
   
7. 제6항에 있어서 분쇄된 미생물제제에 발효용 부형제 또는 저장성 개선용 부형제중에서 선택되는 어느 하나의 물질이 부가적으로 첨가된 것을 특징으로 하는 갯벌 정화용 미생물 정화제의 제조방법.
   
8. 염분 내성이 있고 유기물 분해능이 있는 연안 갯벌에서 동정된 로도코커스 피리디니보란스(Rhodococcus pyridinivorans) EDB2와 염분 내성이 있고 유기물 분해능이 있는 갯지렁이로부터 동정된 바실러스(Bacillus sp.) 속의 균주 CBW4와 EBW4의 복합 배양물을 유효성분으로 포함하는 갯벌 정화용 미생물 정화제.
   
9. 제8항에 있어서, 균주 EDB2, CBW4, EBW4는 기탁번호가 KACC91762P, KACC91722P, KACC91749P인 것을 특징으로 하는 복합 배양물을 유효성분으로 포함하는 갯벌 정화용 미생물 정화제.
   
10. 염분 내성이 있고 유기물 분해능이 있는 연안 갯벌에서 동정된 로도코커스 피리디니보란스(Rhodococcus pyridinivorans) EDB2와 염분 내성이 있고 유기물 분해능이 있는 갯지렁이로부터 동정된 바실러스(Bacillus sp.) 속의 균주 CBW4와 EBW4의 복합 배양물을 유효성분으로 포함하는 갯벌 정화용 미생물 정화제를 갯벌에 살포하여 갯벌에 고정된 유기물을 정화하는 연안 갯벌 정화 방법.
    
11. 제10항의 유기물은 엔도설판, 단백질, 탄수화물, 지질 및 계면활성제 중에 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 연안 갯벌정화 방법

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