KR101636849B1 - 윤활유분해 미생물을 이용한 토양정화방법 및 토양정화제 - Google Patents

윤활유분해 미생물을 이용한 토양정화방법 및 토양정화제 Download PDF

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Abstract

윤활유로 오염된 토양을 스핑고박테리움 속 OLu-1(Sphingobacterium sp. OLu-1)(수탁번호 KCTC 12351BP), 노보스핑고비움 캅슐라툼 OLu-2(Novosphingobium capsulatum OLu-2)(수탁번호 KCTC 12352BP), 아시네토박터 속 OLu-3(Acinetobacter sp. OLu-3)(수탁번호 KCTC 12353BP), 및 크산토모나스 속 OLu-4(Xanthomonas sp. OLu-4)(수탁번호 KCTC 12354BP)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 윤활유분해 미생물 균주로 처리하여 토양을 정화하는 것을 특징으로 하는 윤활유분해 미생물을 이용한 토양정화방법이 개시된다. 본 발명에 따른 미생물 균주를 사용하여 토양을 정화하면, 윤활유가 500~7500 ppm 정도의 농도로 오염된 토양, 특히 물리적 또는 화학적 방법에 의하여 1차적으로 정화된 정화토로서, 윤활유가 500~2000 ppm 정도의 낮은 농도로 오염된 토양을 효과적으로 정화할 수 있어 토양의 생태건전성을 회복하여 재활용가능성을 높일 수 있다

Description

윤활유분해 미생물을 이용한 토양정화방법 및 토양정화제{Method And Agent For Soil Purification By Lubricating Oil-Decomposing Microbe}
본 발명은 윤활유분해 미생물을 이용한 토양정화방법 및 토양정화제에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 윤활유가 500~7500 ppm 정도의 농도로 오염된 토양을 정화하는데 적합한 윤활유분해 미생물을 이용한 토양정화방법 및 토양정화제에 관한 것이다.
윤활유는 탄소수 18~50개로 이루어진 중질유계 난분해성 화합물을 일컫는다. 이러한 윤활유로 오염된 토양을 정화하기 위해서 사용되는 기존 공법들은 대부분 강한 물리적화학적 반응 기작들을 이용하므로 정화과정 중에 토양이 가지고 있던 생태적 기능의 열화가 수반된다. 이로 인해 정화토는 지속가능한 생산과 기후변화와 같은 외적 스트레스 변화에 적응능력이 매우 낮으며, 그 외 토양의 생태적 기능을 회복하는 데에도 더 많은 시간이 필요할 수 있다.
이러한 이유로 정화토의 경우 유효한 재활용이 온전히 이루어지지 못하고 매립 또는 폐기처분되는 경우가 대부분이다. 토양자원을 필요로 하는 건설자재, 성토 현장, 제방축조, 매립지건설과 같은 현장이 지속적으로 존재하기 때문에 위와 같은 사토를 자원이 아닌 폐기물로 처분한다면 사토 발생 현장이나 토양자원 수요처에서나 크게 자원을 낭비하는 것이 된다. 이러한 정화토를 재활용하기 위해서는 생태적 기능을 회복하기 위한 토양질 개선이 필요하다.
이러한 정화토양을 생태학적으로 재활용하기 위해서는 열화된 생태적 기능을 복구하기 위한 개량제 혼입이나 입도보강 등의 방안이 있다. 하지만 향후 토지의 사용방법에 따른 정화기준치 이내로 오염물질을 저감시키는 토양정화의 특성상 정화된 토양에 잔류하는 오염성분, 그 중에서도 특히 잔류윤활유오염성분이 생태적 재활용에 가장 큰 영향을 미친다. 이러한 잔류윤활유오염성분을 제거하지 않으면 식물의 발아에는 큰 영향을 미치지 않지만 향후 식물의 성장을 저해하기 때문에 정화토양을 생태학적으로 재활용하기 위해서는 잔류윤활유오염성분의 제거가 필요하다.
특허등록 제10-0435231호(2004. 05. 31. 등록)는 신규한 중저온 유류분해균주 로도코커스 sp. YHLT-2KCTC 10203BP 균주 및 이를 이용한 생물학적 유류 제거 방법을 개시한다. 특허공개 제10-2004-0014714호(2004. 02. 18. 공개)는 윤활유 분해 활성을 지니는 아시네토박터 주니 균주를 개시한다. 특허등록 제10-0676929호(2007. 01. 25. 등록)는 윤활유 분해능을 가지는 슈도모나스 JN4 균주 및 이를 이용한 오염 토양 및 지하수로부터 오염된 윤활유를 제거하는 방법을 개시한다. 특허등록 제10-1432425호(2014. 08. 13. 등록)는 연안 갯벌과 갯지렁이로부터 동정된 복수의 균주 속 미생물을 포함하는 유기물 정화제를 개시한다.
본 발명은 기존의 정화토양이 단순히 채움재로 사용되거나 폐기물로 처리되는 문제점과 정화과정에 있어 생태적 기능이 손실되는 단점 때문에 재활용이 불가능한 점을 보완하기 위하여 정화토양을 개선하는 과정에 있어서 정화토양 내에 존재하는 잔류윤활유성분을 저감시킬 수 있는 윤활유분해미생물을 개발함으로써 정화토양의 생태건전성을 회복하고 재활용할 수 있는 방법을 발명하고자 하는데 목적이 있다.
즉 본 발명의 목적은 윤활유가 500~7500 ppm 정도의 농도로 오염된 토양, 특히 물리적 또는 화학적 방법에 의하여 1차적으로 정화된 정화토로서, 윤활유가 500~2000 ppm 정도의 낮은 농도로 오염된 토양을 정화하는데 적합한 윤활유분해 미생물을 이용한 토양정화방법 및 토양정화제를 제공하는 것이다.
상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명에 따른 윤활유분해 미생물을 이용한 토양정화방법은 윤활유로 오염된 토양을 스핑고박테리움 속 OLu-1(Sphingobacterium sp. OLu-1)(수탁번호 KCTC 12351BP), 노보스핑고비움 캅슐라툼 OLu-2(Novosphingobium capsulatum OLu-2)(수탁번호 KCTC 12352BP), 아시네토박터 속 OLu-3(Acinetobacter sp. OLu-3)(수탁번호 KCTC 12353BP), 및 크산토모나스 속 OLu-4(Xanthomonas sp. OLu-4)(수탁번호 KCTC 12354BP)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 윤활유분해 미생물 균주로 처리하여 토양을 정화하는 것이다.
상기한 방법에서, 상기 윤활유로 오염된 토양의 C/N/P 비율이 100/10/1~100/1/0.5의 범위가 되도록 상기 토양에 질소원 및 인산원을 추가로 공급하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 윤활유로 오염된 토양에서 윤활유 성분은 500 ~ 7500 ppm의 범위인 것이 바람직하다. 특히, 상기 윤활유로 오염된 토양은 물리적 또는 화학적 방법에 의하여 1차적으로 정화된 정화토로서, 윤활유 성분을 500 ~ 2000 ppm의 범위로 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명은 또한 스핑고박테리움 속 OLu-1(Sphingobacterium sp. OLu-1)(수탁번호 KCTC 12351BP), 노보스핑고비움 캅슐라툼 OLu-2(Novosphingobium capsulatum OLu-2)(수탁번호 KCTC 12352BP), 아시네토박터 속 OLu-3(Acinetobacter sp. OLu-3)(수탁번호 KCTC 12353BP), 및 크산토모나스 속 OLu-4(Xanthomonas sp. OLu-4)(수탁번호 KCTC 12354BP)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 윤활유분해 미생물 균주를 유효성분으로 하는 토양정화제를 제공한다.
본 발명은 또한 스핑고박테리움 속 OLu-1(Sphingobacterium sp. OLu-1)(수탁번호 KCTC 12351BP), 노보스핑고비움 캅슐라툼 OLu-2(Novosphingobium capsulatum OLu-2)(수탁번호 KCTC 12352BP), 아시네토박터 속 OLu-3(Acinetobacter sp. OLu-3)(수탁번호 KCTC 12353BP), 및 크산토모나스 속 OLu-4(Xanthomonas sp. OLu-4)(수탁번호 KCTC 12354BP)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 윤활유분해 미생물 균주를 제공한다.
본 발명에 따른 미생물 균주를 사용하여 토양을 정화하면, 윤활유가 500~7500 ppm 정도의 농도로 오염된 토양, 특히 물리적 또는 화학적 방법에 의하여 1차적으로 정화된 정화토로서, 윤활유가 500~2000 ppm 정도의 낮은 농도로 오염된 토양을 효과적으로 정화할 수 있어 토양의 생태건전성을 회복하여 재활용가능성을 높일 수 있다.
도 1은 Sphingobacterium sp. 의 결정염기서열을 나타낸다.
도 2은 Novosphingobium capsulatum 의 결정염기서열을 나타낸다.
도 3은 Acinetobacter sp. 의 결정염기서열을 나타낸다.
도 4은 Xanthomonas sp. 의 결정염기서열을 나타낸다.
도 5는 본 발명의 한 실시예에 따른 미생물 균주 처리에 따른 고농도 TPH 농도와 오염 토양 복원 일수의 상관 관계 그래프를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 한 실시예에 따른 미생물 균주 처리에 따른 저농도 TPH 농도와 오염 토양 복원 일수의 상관 관계 그래프를 나타낸다.
윤활유로 강하게 오염된 토양은 물리적 또는 화학적 방법에 의하여 정화된다. 이렇게 정화된 정화토는 500~2000 ppm 정도로 낮은 농도지만 여전히 윤활유를 포함하는데, 이러한 잔류 윤활유로 인하여 정화토는 생태적으로 재활용되지 못한다.
본 발명은 이러한 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 것이다. 즉, 본 발명은 500 ~ 7500 ppm의 범위의 윤활유 성분에 의하여 오염된 토양, 특히 물리적 또는 화학적 방법에 의하여 1차적으로 정화된 정화토로서, 500 ~ 2000 ppm의 범위의 윤활유 성분에 의하여 오염된 토양을 정화하기 위한 방법, 정화제 및 미생물 균주를 제공하는 것이다.
본 발명은 상기한 목적을 달성하기 위한 미생물 균주를 분리 및 동정하였다. 구체적으로, 본 발명의 미생물 균주들은, 윤활유로 오염된 토양에서 분리된 미생물 균주들 중에서 윤활유가 유일 탄소원으로 존재하는 배지에서의 성장 속도가 빠른 미생물 균주들만을 선별한 것으로서, 다음과 같은 과정을 거쳐 분리, 동정하였다.
먼저, 탄소원을 제외한 영양분이 풍부한 배지에 윤활유로 오염된 토양으로부터 채취된 시료를 접종한 후 탄소원으로서 윤활유가 500ppm이 되도록 상기 배지에 추가로 첨가하여 윤활유분해 미생물 균주들이 성장할 수 있도록 배양하였다.
10일 후 배양액 내에서 우점을 차지한 미생물 균주들 중 탄소원으로서 윤활유를 함유한 고체상 평판배지에서 생장하는 미생물 균주 10종(M1~M10)을 분리하고, 분리된 미생물 균주 10종 중 탄소원으로서 500ppm의 윤활유를 함유한 액체 영양배지에서 성장력이 우수한 미생물 균주 6종을 재분리하여 각각 M1, M2, M3, M4, M5, M6으로 명명하였다.
최종 선별된 미생물 균주들을 16S rDNA의 부분 염기서열 결정 및 유사도 분석을 이용하여 동정한 바, 오염이 된 M5를 제외하고 각각 Sphingobacterium sp., Novosphingobium capsulatum, Ralstonia mannitolilytica, Acinetobacter sp., Xanthomonas sp. 에 해당하는 신규한 균주임을 확인하였으며, 그 중 배양이 어려운 M3 Ralstonia mannitolilytica를 제외하고 각각 Sphingobacterium sp. OLu-1, Novosphingobium capsulatum OLu-2, Acinetobacter sp. OLu-3, Xanthomonas sp. OLu-4 으로 명명하여 2013년 1월 17일 균주의 국제기탁기관인 생명공학연구소 유전자은행(KCTC)에 수탁번호 KCTC 12351BP, KCTC 12352BP, KCTC 12353BP, 및 KCTC 12354BP로 기탁하였다.
상기 분리된 균주들은 필수 미네랄 성분과 탄소원으로서 윤활유오염물질이 함유된 최소배지에서 모두 OD = 10 이상으로 생장이 가능한 것으로 밝혀졌다.
본 발명에 의한 균주들은 윤활유에 대하여 내성이 있을 뿐 아니라, 이를 유일한 탄소원으로 하여 생장이 가능한 바, 이들 균주를 이용하여 윤활유에 오염된 토양의 생물학적 처리가 가능하였다.
이때, 상기 종의 균주들은 각각 독자적으로 이용될 수 있으며, 4 종류의 균주들 중 필요에 따라 2종 이상이 혼합 배양된 상태로 이용될 수도 있다.
또한, 상기 균주들의 윤활류 분해능을 최대화하기 위하여, 균주들이 윤활유성분을 분해하는데 필요한 질소원과 인산원을 오염된 탄소원의 몰비 농도와 비교하여 질소원으로는 황산암모늄, 요소, 질산암모늄 등을 질소 몰수로 첨가하고, 인산원으로는 인산칼륨, 이인산칼륨 등을 인산 몰수로 공급하여 토양의 C/N/P 비율이 기준 범위 이내로 즉, C/N/P 비율이 100/10/1~100/1/0.5의 범위로 조절되도록 오염 토양에 영양분을 공급하였다.
그리고, 상기와 같이 개발된 본 발명의 균주들과 영양분을 이용한 인위적인 윤활유분해 효과와, 자연적으로 윤활유성분이 휘발되는 동시에 오염 토양 중에 있는 자연 미생물에 의해 윤활유성분이 분해되는 자연적인 윤활유분해 효과를 비교 확인함으로써 본 발명이 완성되었다.
상기 본 발명의 목적과 기술적 구성을 비롯한 그에 따른 작용 효과에 관한 자세한 사항은 다음과 같은 본 발명의 바람직한 실시예를 통하여 명확하게 이해될 것이다.
실시예
실시예 1 : 윤활유분해 균주의 분리
윤활유분해 균주의 분리 및 동정을 위하여, 다음의 표 1과 같은 배지성분을 투입하고 윤활유로 오염된 토양을 배지 1리터당 10g이 되도록 첨가한 후 30 진탕배양기에서 160rpm으로 배양하였다.
표 1
Figure 112014095678981-pat00001

상기와 같은 조건 하에서의 증식 단계에서 생장한 배양액을 다음의 표 2와 같은 윤활유분해 균주 분리 배지에 도말 후 30 배양기에서 48시간 배양하여 육안으로 균체의 생장이 확인되는 미생물 군락 10종을 선별하여 M1~M10로 명명하였다.
표 2
Figure 112014095678981-pat00002

그리고, 탄소원으로서 윤활유가 함유된 액체 영양배지에서 선별된 10종의 균주를 48시간 배양한 후 600nm에서 흡광도(OD)를 측정하여 다음의 표 3과 같이 OD가 10 이상인 균주 6종(M1, M2, M3, M4, M5, M6)을 선별하였다.
표 3
Figure 112014095678981-pat00003

상기와 같이 선별된 6종의 균주를 16S rDNA의 부분 염기서열 결정 결과, 오염이 된 M5를 제외하고 각각 Sphingobacterium sp., Novosphingobium capsulatum, Ralstonia mannitolilytica, Acinetobacter sp., Xanthomonas sp. 에 해당하는 신규한 균주임을 확인하였으며, 그 중 배양이 어려운 M3 Ralstonia mannitolilytica를 제외하고 각각 Sphingobacterium sp. OLu-1, Novosphingobium capsulatum OLu-2, Acinetobacter sp. OLu-3, Xanthomonas sp. OLu-4 으로 명명하였다.
실시예 2 : 영양제 공급
미생물 균주의 오염물 분해능을 최대화하기 위해서는 오염원 내에 함유된 탄소원에 대하여 영양제로서 적절한 양의 질소와 인이 필요로 되는 바, 오염 토양 중 미생물이 이용 가능한 질산성 질소와 암모니아성 질소의 인산 농도를 분석하여 오염된 TPH 중 분해해야 할 탄소 농도와의 몰수비를 100/10/1~ 100/1/0.5 범위가 되도록 질소 공급원으로서 황산암모늄, 요소, 질산암모늄 등을, 인의 공급원으로서 인산칼륨, 이인산칼륨 등을 첨가하였으며, 본 발명의 실시예에서는 C/N/P = 100/10/1이 되도록 다음의 표 4와 같이 제조하여 상기 실시예1의 신규 미생물과 함께 토양에 첨가하였다.
표 4
Figure 112014095678981-pat00004

실시예 3: 윤활유오염 토양의 복원
실시예 1과 2의 본 발명 균주와 영양제를 이용하여 15m90.4m 크기의 비닐 하우스 처리장을 만든 후 하부에 침출수 수집을 위한 모래, 부직포, 집수정 등을 설치하고 그 위에 오염된 토양을 60cm 두께로 적층하였다.
상기 적층된 오염 토양 1톤당 1109CFU/ml로 배양된 본 발명의 균주를 3ml 첨가한 후 실시예 2와 같이 오염된 윤활류성분의 탄소 몰수와 질소 및 인산 농도를 확인하여 C/N/P 농도를 100/10/1100/1/0.5 범위가 되도록 영양제를 제조하여 균주 투입 3일전 공급하였으며, 오염된 토양의 뒤집기는 굴삭기를 이용하여 주당 23회 실시하였고, 수분의 공급은 하우스 상부에 설치된 분무장치를 이용하여 매일 분무하였다.
윤활유로 오염된 초기 및 복원 후의 오염농도를 중량법으로 확인한 결과 50일 후 대략 7,500ppm에서 대략 1,000ppm으로 복원되는 것을 확인할 수 있었고, 또한 50일 후 대략 700ppm에서 대략 300ppm으로 복원되는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 사항들은 도 5 및 도 6에 도시되어 있다. 즉, 도 5에는 본 발명의 미생물 균주 처리에 따른 고농도 TPH 농도(7500ppm)와 오염 토양 복원 일수의 상관관계를 나타내었고, 도 6에는 저농도 TPH 농도(700ppm 이상)와 오염 토양 복원 일수의 상관관계를 나타내었다.
생명공학연구소 유전자은행 KCTC12351BP 20130117 생명공학연구소 유전자은행 KCTC12352BP 20130117 생명공학연구소 유전자은행 KCTC12353BP 20130117 생명공학연구소 유전자은행 KCTC12354BP 20130117
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Claims (6)

  1. 윤활유로 오염된 토양을 스핑고박테리움 속 OLu-1(Sphingobacterium sp. OLu-1)(수탁번호 KCTC 12351BP), 노보스핑고비움 캅슐라툼 OLu-2(Novosphingobium capsulatum OLu-2)(수탁번호 KCTC 12352BP), 아시네토박터 속 OLu-3(Acinetobacter sp. OLu-3)(수탁번호 KCTC 12353BP), 및 크산토모나스 속 OLu-4(Xanthomonas sp. OLu-4)(수탁번호 KCTC 12354BP)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 윤활유분해 미생물 균주로 처리하여 토양을 정화하는 것을 특징으로 하는 윤활유분해 미생물을 이용한 토양정화방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 윤활유로 오염된 토양의 C/N/P 비율이 100/10/1~100/1/0.5의 범위가 되도록 상기 토양에 질소원 및 인산원을 추가로 공급하는 것을 특징으로 하는 윤활유분해 미생물을 이용한 토양정화방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 윤활유로 오염된 토양에서 윤활유 성분은 500 ~ 7500 ppm의 범위인 것을 특징으로 하는 윤활유분해 미생물을 이용한 토양정화방법.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 윤활유로 오염된 토양은 물리적 또는 화학적 방법에 의하여 1차적으로 정화된 정화토로서, 윤활유 성분을 500 ~ 2000 ppm의 범위로 포함하는 것임을 특징으로 하는 윤활유분해 미생물을 이용한 토양정화방법.
  5. 스핑고박테리움 속 OLu-1(Sphingobacterium sp. OLu-1)(수탁번호 KCTC 12351BP), 노보스핑고비움 캅슐라툼 OLu-2(Novosphingobium capsulatum OLu-2)(수탁번호 KCTC 12352BP), 아시네토박터 속 OLu-3(Acinetobacter sp. OLu-3)(수탁번호 KCTC 12353BP), 및 크산토모나스 속 OLu-4(Xanthomonas sp. OLu-4)(수탁번호 KCTC 12354BP)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 윤활유분해 미생물 균주를 유효성분으로 하는 토양정화제
  6. 스핑고박테리움 속 OLu-1(Sphingobacterium sp. OLu-1)(수탁번호 KCTC 12351BP), 노보스핑고비움 캅슐라툼 OLu-2(Novosphingobium capsulatum OLu-2)(수탁번호 KCTC 12352BP), 아시네토박터 속 OLu-3(Acinetobacter sp. OLu-3)(수탁번호 KCTC 12353BP), 및 크산토모나스 속 OLu-4(Xanthomonas sp. OLu-4)(수탁번호 KCTC 12354BP)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 윤활유분해 미생물 균주
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