CN107916239B - 一种降解微囊藻毒素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种降解微囊藻毒素的方法，包括将从枯草芽孢杆菌MCS1提取的可降解微囊藻毒素的组合物加入含有微囊藻毒素的水体中并孵育的步骤，所述枯草芽孢杆菌MCS1于2017年6月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M2017381。通过本发明的方法可提高使用枯草芽孢杆菌MCS1制备的可降解微囊藻毒素的组合物在降解水体中的微囊藻毒素时的效率，净化水质，防止水环境恶化，保护水体生态。

Description

一种降解微囊藻毒素的方法

技术领域

本发明涉及降解微囊藻毒素的微生物及方法领域，更特别地，涉及一种降解微囊藻毒素的方法。

背景技术

随着人类生产、生活方式的迅速发展，工业化、城市化的进程加快，大量含有丰富氮、磷污染物的工业废水和生活污水排入水体，水体污染和富营养化问题日趋严重。在我国淡水湖泊如滇池、太湖、巢湖和东湖等频繁有蓝藻水华爆发。

水华对人类和自然环境都会造成巨大的影响。首先，水华藻类浮在水面，使水体透明度明显降低，气味变得腥臭难闻，藻类的光合作用明显受抑制，使溶解氧来源减少，藻类死亡后腐烂分解，也消耗水体的大量溶解氧，导致水体中的鱼等水生动植物由于缺少氧而死亡，严重时将会导致生态系统紊乱。其次，据研究报道，一些藻类尤其是微囊藻死亡后会释放出藻毒素。水华中，藻毒素的释放量巨大，危害严重，不仅危及水体生态，还危及人类引用水安全。

毒理学研究发现，将藻类的提取物和纯微囊藻毒素，经口、腹腔注射，均可引起肝脏病变。无论动物的种系、性别、年龄有何差别，急性、亚急性和慢性毒理试验及离体、在体试验中，微囊藻毒素均呈现出相似的、高度特异的、以肝脏为靶器官的毒性。微囊藻毒素进入肝细胞后，能强烈抑制蛋白磷酸酶的活性，并专一性地抑制蛋白磷酸酶1型(PP1)和蛋白磷酸酶2A型(PP2A)的活性，相应地增加了蛋白激酶的活性，导致细胞内多种蛋白质的过磷酸化，打破细胞内蛋白磷酸化和脱磷酸化的平衡。通过细胞信号系统进一步放大这种生化效应，改变了多种酶的活性，造成细胞内一系列的生理生化反应紊乱，导致细胞质中微丝网络重排，细胞结构与整体稳定性破坏，引起肝细胞变形。微囊藻毒素毒理作用的主要靶器官为肝脏，随着有关微囊藻毒素毒性的研究进展，也有多器官毒性、遗传毒性和致癌性的相关报道。除了抑制磷酸酶致毒外，氧化应激以及线粒体通透性转换在微囊藻毒素致毒机理中也起着很重要的作用。微囊藻毒素可以诱导细胞内活性氧(ROS)产生，导致细胞损伤和脂质过氧化，并有可能通过某些通路诱导细胞凋亡，微囊藻毒素的肝脏毒性部分也是由于诱导活性氧(ROS)的产生所致。

微囊藻毒素性质稳定，熔点高，可在300℃仍可保持活性结构。藻毒素易稳定溶解于水或者甲醇中，无法通过混凝、沉淀、过滤等物理方法使溶解在水中的微囊藻毒素除去。藻毒素化学性质也比较稳定，对酸碱变化不敏感，需使用臭氧、氯气、高锰酸钾等强氧化剂才可显著提高藻毒素的降解率。藻毒素的稳定结构在紫外光下仍可保持，但紫外线长时间照射的情况下，可减少水中藻毒素含量。

研究表明，使用物理和化学的方法均可有效去除藻毒素。物理方法中较为常用有活性炭吸附、混凝沉淀、超滤、纳滤、反渗透膜等方法。这些物理方法可以快速大量地去除藻细胞和藻毒素，但其成本高，不易回收，藻毒素去除不完全等缺点，制约着物理法的发展。化学方法使用臭氧、氯气、高锰酸钾等强氧化剂去除藻毒素，其残留的化学物质，会对水体产生二次污染的影响。同时会造成依赖这片水域生活的动植物的损伤，最终破坏水体的生态平衡。

有研究发现，一些细菌能产生分解微囊藻毒素的物质。然而，目前分离培养的这类细菌很少，并且多数停留在实验室阶段。因此，需要一种可在自然水体中高效降解微囊藻毒素的细菌或其他微生物。

发明内容

发明人从郑州某污水水样，经微囊藻毒素筛选培养分离，得到一株能够以微囊藻毒素为唯一碳源和氮源进行生长的菌株。该菌株呈革兰氏阳性染色，抗酸染色呈阴性，能产生芽孢。提取其基因组进行16S rDNA测序，序列如SEQ ID NO:1所示，将该序列在ncbi数据库中进行比对，发现与芽孢杆菌属(Bacillus sp.)的序列近似度比较高，将其命名为枯草芽孢杆菌MCS1(Bacillus subtilis MCS1)，并于2017年6月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M2017381。

基于以上发现，本发明提供了一种降解微囊藻毒素的方法，包括将从枯草芽孢杆菌MCS1提取的可降解微囊藻毒素的组合物加入含有微囊藻毒素的水体中并孵育的步骤。

在一个具体实施方案中，所述可降解微囊藻毒素的组合物通过将所述枯草芽孢杆菌MCS1菌体破碎离心后提取上清液得到。

在一个优选实施方案中，孵育温度为25-35℃。

在一个优选实施方案中，所述水体的pH调节为7-8。

在一个优选实施方案中，向所述水体中加入的所述可降解微囊藻毒素的组合物的量为添加所述可降解微囊藻毒素的组合物导致的蛋白浓度为140-350mg/l。

通过本发明的方法可提高使用枯草芽孢杆菌MCS1制备的可降解微囊藻毒素的组合物在降解水体中的微囊藻毒素时的效率，净化水质，防止水环境恶化，保护水体生态。

微生物保藏

本发明所述涉及的菌株从郑州某污水水样分离得到，经16S rDNA测序、形态学和其他性状鉴定，该菌株属于芽孢杆菌属，并且16S rDNA序列与Bacillus niabensis近似度比较高。该菌株已于2017年2月22日保藏于中国湖北省武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC NO:M2017381，命名为枯草芽孢杆菌MCS1(Bacillussubtilis MCS1)。

需要说明的是，发明人虽然在保藏时将该菌株命名为枯草芽孢杆菌MCS1(Bacillus subtilis MCS1)，然而该命名仅仅用于描述性的作用，而非将该菌株定种为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，并且该菌株的16S rDNA序列与枯草芽孢杆菌的一致性并不高，在聚类分析中两者并未聚类在一起(图1)。结合形态特征与16S rDNA序列，该菌株与目前已知的芽孢杆菌菌种均存在差别。

附图说明

图1为加入不同水样的培养基在培养3天后的情况，A为对照组，B为东湖水样组，C为郑州水样组；

图2为本发明的芽孢杆菌的16S rDNA序列与15中现有芽孢杆菌的16S rDNA序列进行聚类得到的系统进化树；

图3为不同温度对微囊藻毒素降解效率的影响；

图4为不同pH对微囊藻毒素降解效率的影响；

图5为不同的蛋白浓度对微囊藻毒素降解效率的影响。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

1.可降解微囊藻毒素的芽孢杆菌的筛选分离

微囊藻毒素的提取：以下实施例中使用的微囊藻毒素提取自铜绿微囊藻(FACHB-905，中科院水生生物研究所)。

采样：发明人从郑州某污水厂和武汉东湖采集水样，以无菌双蒸水为对照，分别接种于牛肉膏蛋白胨培养基中，在自然光照、37℃、220r/min条件下进行连续3次、每次3d的摇瓶富集培养。然后将此富集培养液稀释一定倍数在接种于以藻毒素为唯一碳源和氮源的M9培养基中，摇瓶培养3-4天，观察生长情况。结果显示，接种了来自郑州某池塘的水样的以藻毒素为唯一碳源和氮源的M9培养基在摇瓶培养后变得明显浑浊(图1)，推测其中存在有能够以藻毒素为唯一碳源和氮源进行的生长的藻毒素降解菌。

经过三天的平板培养之后，涂布有武汉水样和对照组的平板没有菌落长出，而涂布有郑州某污水水样的平板上有菌落长出。平板培养结果进一步说明，武汉水样中不存在藻毒素降解菌，郑州水样中存在藻毒素降解菌，且根据菌落的形态初步判断，郑州水样中存在至少2种藻毒素降解菌。

其中一种菌从形态学和其他性状上与芽孢杆菌属相似，其革兰氏染色结果呈阳性，并能够产生芽孢。该菌株已于2017年2月22日保藏于中国湖北省武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC NO:M2017381，命名为枯草芽孢杆菌MCS1(Bacillus subtilis MCS1)。该菌株的性状如表1所示，16S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。该16S rDNA序列与芽孢杆菌属的同源性较高，将该序列进一步与芽孢杆菌属的15个菌株进行序列比对，并构建系统发育树(图2)，结果显示，该菌株可归入芽孢杆菌属(Bacillus.sp)。

表1枯草芽孢杆菌MCS1(Bacillus subtilis MCS1)的性状

2.可降解微囊藻毒素的组合物的提取

1)接种培养：取-20℃冻存的上文所分离的菌株，接种于装有3ml LB培养基的试管中，于37℃下振荡培养，至对数期后将培养物转接于装有300ml LB培养基的500ml锥形瓶中，于37℃下振荡培养。

2)离心浓缩：当培养至稳定期后，进行冷冻离心，于4℃下9000r/min离心15min。取50mmol/L的磷酸盐缓冲液清5ml，清洗菌体3次，制成细胞悬浊液。

3)对上述细胞悬液进行超声破碎，破碎条件：输出功率300W，超声30min(超声开8s关4s)，冰浴。间隔30min后再进行一次该超声步骤。

4)细菌破碎液进行冷冻离心分离。温度4℃，转速8000r/min，离心20min，所上清液为胞内物质——无细胞的胞内粗酶液(即，可降解微囊藻毒素的组合物)，置于－20℃冰箱中保存备用。

采用BCA蛋白浓度测定试剂盒来测定可降解微囊藻毒素的组合物中蛋白质含量。

3.微囊藻毒素降解条件的优化

3.1温度对降解效率的影响

用pH 7.4的0.05mol/L磷酸盐缓冲液配制反应体系，添加微囊藻毒素和可降解微囊藻毒素的组合物，使微囊藻毒素的初始浓度为10mg/l，可降解微囊藻毒素的组合物导致的蛋白浓度为280mg/l。分别在25、30、35℃下振荡孵育，转速150r/min。在孵育一定时间后，检测反应体系中的微囊藻毒素浓度，并换算成降解效率来体现温度对本发明的可降解微囊藻毒素的组合物降解藻毒素的效率的影响。

结果如图3所示，随着温度的升高，微囊藻毒素的降解效率逐渐提高。35℃条件下，酶促反应速度最快。5小时降解效率达60％左右，15小时降解效率达到70％左右，不过随后35℃条件下的反应速率开始下降，到25小时降解效率为80％左右，25和30℃条件下的反应趋势差不多，一开始降解效率比较慢，5小时的降解效率在30-40％左右，但是后来反应速率逐渐加快到25小时时降解效率也达到80％左右。可见，如果是短时处理，温度最好调节为35℃，如果是长时处理，温度可调节为25-35℃。

3.2pH对降解效率的影响

用0.05mol/L磷酸盐缓冲液配制反应体系，调节pH分别为6.0、7.0和8.0。添加微囊藻毒素和可降解微囊藻毒素的组合物，使微囊藻毒素的初始浓度为10mg/l，可降解微囊藻毒素的组合物导致的蛋白浓度为280mg/l。。在30℃下振荡孵育，转速150r/min。在孵育一段时间后，检测反应体系中的微囊藻毒素浓度，并换算成降解效率来体现pH对本发明的可降解微囊藻毒素的组合物降解藻毒素的效率的影响。

结果如图4所示，pH为8时，5小时降解效率超过60％，最终降解效率为80％左右。pH为7时，5小时降解效率为50％左右，最终降解效率为80％左右。因此，可将pH为7-8。

3.3组合物浓度对降解效率的影响

用0.05mol/L磷酸盐缓冲液配制反应体系，添加微囊藻毒素和可降解微囊藻毒素的组合物，使微囊藻毒素的初始浓度为10mg/l，可降解微囊藻毒素的组合物导致的蛋白浓度为140mg/l、280mg/l和350mg/l。在30℃下振荡孵育，转速150r/min。在孵育一段时间后，检测反应体系中的微囊藻毒素浓度，并换算成降解效率来体现pH对本发明的可降解微囊藻毒素的组合物降解藻毒素的效率的影响。

结果如图5所示，蛋白浓度在140-350mg/l的条件下均可对微囊藻毒素进行有效降解。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 河南城建学院

<120> 一种降解微囊藻毒素的方法

<141> 2017-11-10

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1220

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌MCS1(Bacillus sp. MCS1)

<400> 1

gtgagtaacg gctcacccaa ggccacgatg cgtagcgact gagaggggtg atcgtcacac 60

tgggactgag acacgtccag actcctacgg gaggcagcag tagggaatct tccgcaatgg 120

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cacaccgccc gtcacaccac gagagtttgt aacacccgaa gtcggtgggg taaccgtaag 1200

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Claims (1)

1.一种降解微囊藻毒素的方法，其特征在于，包括将从枯草芽孢杆菌MCS1提取的可降解微囊藻毒素的组合物加入含有微囊藻毒素的水体中并孵育的步骤，所述枯草芽孢杆菌MCS1于2017年6月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M2017381,

所述可降解微囊藻毒素的组合物通过将所述枯草芽孢杆菌MCS1菌体破碎离心后提取上清液得到，所述上清液为无细胞的胞内粗酶液，

孵育温度为25-35℃，所述水体的pH调节为7-8，所述组合物中的蛋白浓度为140-350mg/L。

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