CN109781970B - 一种评估微囊藻毒素在真实水环境下毒性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种评估微囊藻毒素在真实水环境下毒性的方法，通过制备降解菌株和微囊藻毒素‑LR(Microcystin‑LR，MC‑LR)的共存液，构建与MC‑LR在真实水环境中存在形式接近的染毒样品；然后对人肝癌细胞进行染毒，利用MTT检测细胞代谢活性的方法，验证降解菌株共存条件下MC‑LR的毒性。本发明模拟了MC‑LR在湖泊等真实水环境中与降解菌株共存时的状态，弥补了对单一MC‑LR毒性研究的局限性，能够更好的对MC‑LR的毒性进行评估，在水产养殖业、环境治理等行业的应用前景较好；本发明对各类微囊藻毒素异构体具有普遍的适用性，应用范围广；本发明通过N+离子束注入技术对降解菌株进行辐照，得到辐照后降解菌株；并与辐照前降解菌株比较对MC‑LR的降解效果的强弱，进而验证了该方法的可行性。
Description
技术领域
本发明涉及一种微囊藻毒素的毒性评价方法，尤其涉及的是一种评估微囊藻毒素在真实水环境下毒性的方法。
背景技术
微囊藻毒素是分布最广泛的一类肝毒素，主要由淡水藻类铜绿微囊藻产生，稳定性较高。它能够强烈抑制蛋白磷酸酶的活性，还是强烈的肝脏肿瘤促进剂。中国生活饮用水标准限制饮用水中该毒素含量为1μg/L。
自20世纪50年代起，随着社会科技文化的发展，由于含磷洗衣粉、农药等的滥用，造成水体富营养化，而水体富营养化可以促使蓝藻等藻类植物的生长，使水面形成一层厚厚的蓝绿色湖靛，味道难闻。蓝藻等爆发释放出的多种藻毒素中以微囊藻毒素出现频率最高、对水体毒害最大，并且随着水体中微囊藻毒素水平不断升高，水体中微囊藻毒素超标的问题开始频繁出现，对居民的生活造成巨大的影响。我国近年的调查显示：除了滇池、太湖、巢湖已出现严重污染，长江、黄河中下游许多水库、湖泊以及养殖水体也检测出微囊藻毒素，因此对其研究迫在眉睫。
随着环境的日益恶化以及可持续发展观念的普及，人们对于环境保护和治理愈来愈重视，对微囊藻毒素的研究也愈来愈多。目前国内的基于微囊藻毒素的研究多为配制纯的微囊藻毒素溶液，在此基础上研究其毒性机制，以及拮抗其毒性作用的一些物质等。但是，无法在真实水环境中对微囊藻毒素毒性进行评价，因为微囊藻毒素往往不是以纯物质的状态存在的，而是与很多生物、化学、物理等因素共存，因此对于纯微囊藻毒素溶液的研究就存在一定的片面性。
国内外的科学研究发现，微囊藻毒素毒性主要受环境介质的pH值、光照、水体营养成分等因素影响，而最新的研究表明对微囊毒素毒性影响占主导作用的是微生物，在水体中，存在能够降解微囊藻毒素的各种菌株。国内阎海率先从云南滇池底泥中分离出了能够高效降解微囊藻毒素的微生物纯菌种，经中国科学院微生物研究所鉴定为Ralstoniasolanacearum。国外Bourne等科学家也对降解菌株降解微囊藻毒素的降解机理有了最新的解释，为研究环境介质中微囊藻毒素毒性奠定了基础。
目前国内主要基于物理和化学原理研发了一些微囊藻毒素检测系统或装置，相关专利申请如：中国专利CN201310712994(一种微囊藻毒素的快速检测传感器)，中国专利CN201410617885(一种微囊藻毒素光学检测传感器)，中国专利CN201510514844(一种水体中微囊藻毒素MC-LR的选择性光电化学分析方法)等。同时，对微囊藻毒素常用的检测方法有高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法、酶联免疫吸附法、抗体抗原检测法、电化学方法、传感器法、蛋白磷酸酶抑制分析法、薄层层析法等。
这些装置及方法均只是针对微囊藻毒素的含量进行检测和分析，未反映出微囊藻毒素的潜在毒性危害；而且目前评估微囊藻毒素毒性的方法都是基于单一微囊藻毒素溶液进行的，若是考虑到其研究结果在环境水体微囊藻毒素毒性评价等方面的应用，由于没有还原真实水环境，研究结果的说服力会差一些。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种评估微囊藻毒素在真实水环境下毒性的方法。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括以下步骤：
(1)将降解菌株制备成菌体细胞悬液，并稀释为109个/mL；再制备降解菌株和MC-LR共存的储备液；
(2)分别配置浓度为1μM和0.1μM的MC-LR和菌株共存工作液、1μM和0.1μM的纯MC-LR工作液、降解菌株过滤后工作液；
(3)取处于对数生长期的Hep G2细胞接种在经过宽离子束辐照改性后的96孔板中，每板接种18个孔，一组实验用一个板，总共接种2个板；在染毒一天的实验中，每孔接种8万细胞；在染毒三天的实验中，每孔接种4万细胞；分别培养24h；
(4)细胞染毒：24h后，用步骤(2)配制的各浓度的MC-LR和菌株共存工作液，以及步骤(2)配置的各浓度的纯MC-LR工作液对Hep G2细胞进行染毒，并设置降解菌株过滤后工作液处理组和对照组；
(5)进行MTT实验：
将每孔接种8×104个细胞的96孔板染毒一天后进行MTT实验，将每孔接种4×104个细胞的96孔板染毒三天后进行MTT实验，然后检测其吸光值。
所述降解菌株为蜡状芽孢杆菌M9，筛自于巢湖湖水的MC-LR降解菌株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2013265。
所述步骤(1)中，降解菌株和MC-LR共存的储备液的制备方法为：
取50μM的纯MC-LR储备液200μL加入菌体细胞浓度为109个/mL的800μL细胞悬液中，配制的溶液中细胞悬液与MC-LR溶液的体积比为4:1；
振荡均匀，在室温下避光培养三天；然后用0.22μm孔径的滤膜过滤，放入-20℃冰箱保存，制得降解菌株和MC-LR共存的储备液。
所述步骤(2)中，MC-LR和菌株共存工作液的配置方法如下：
取100μL步骤(1)制得的降解菌株和MC-LR共存的储备液加入到900μL DMEM完全培养基中，制得浓度为1μM的MC-LR和菌株共存工作液；
再取100μL制得的1μM的MC-LR和菌株共存工作液加入到900μL DMEM完全培养基中，制得浓度为0.1μM的MC-LR和菌株共存工作液。
所述步骤(2)中，纯MC-LR工作液配置方法如下：
取20μL浓度为50μM的纯MC-LR储备液加入到980μL DMEM完全培养基中，制得浓度为1μM的纯MC-LR工作液；
再取100μL制得的1μM的纯MC-LR工作液加入到900μL DMEM完全培养基中，制得浓度为0.1μM的纯MC-LR工作液。
所述步骤(2)中，降解菌株过滤后工作液配置方法如下：取浓度为109个/mL的降解菌株细胞悬液80μL，加入到920μL DMEM完全培养基中制备并用0.22μm孔径的滤膜过滤而成。
所述步骤(3)中，宽离子束辐照的能量为10～20keV，剂量为10～20kGy，辐照时间为5～20min。
所述步骤(4)中，细胞染毒的处理方法为：
每块96孔板中，三个孔加DMEM完全培养基作为对照，三个孔加1μM的MC-LR和菌株共存工作液，三个孔加0.1μM的MC-LR和菌株共存工作液，三个孔加1μM的纯MC-LR工作液，三个孔加0.1μM的纯MC-LR工作液，三个孔加降解菌株过滤后工作液；进行细胞染毒实验。
所述步骤(5)中，MTT实验步骤如下：
取出染毒后的细胞，吸去孔里的液体，每孔加入200μL的PBS溶液清洗两遍；清洗完，每孔加入200μL浓度为1mg/mL的MTT工作液，放入培养箱孵育4h；终止孵育，吸弃MTT工作液，每孔加入200μL的盐酸异丙醇溶液，放入二氧化碳培养箱振荡且孵育20分钟，使结晶物充分溶解；盐酸异丙醇溶液相比于DMSO溶液成本更低，对细胞的毒性更小，具有很好的经济和环境效益；然后取出96孔板，用酶标仪在570nm处测定OD值。
所述步骤(5)中，每次MTT实验前对MTT工作液超声处理30分钟能够增加MTT粉末的溶解性，使得检测的精准度更高，并避免检测孔中粉末颗粒物造成的吸光值误差。
通过N+离子束注入技术对降解菌株进行辐照处理，得到辐照后降解菌株。并与辐照前降解菌株比较对MC-LR的降解效果的强弱，进而验证了该方法的可行性。
该降解菌株是从巢湖湖水淤泥中筛选出来的一种菌株，该菌株在自然环境中生命力强，大量存在于自然水环境中，因此通过将降解菌株和MC-LR在外界环境下共存培养，能够模拟水环境下MC-LR的真实存在的条件。
本发明相比现有技术具有以下优点：
本发明模拟了MC-LR在湖泊等真实水环境中与降解菌株共存时的状态，弥补了对单一MC-LR毒性研究的局限性，能够更好的对MC-LR的毒性进行评估，在水产养殖业、环境治理等行业的应用前景较好；
本发明对各类微囊藻毒素异构体具有普遍的适用性，应用范围广；
本发明通过N+离子束注入技术对降解菌株进行辐照，得到辐照后降解菌株；并与辐照前降解菌株比较对MC-LR的降解效果的强弱，进而验证了该方法的可行性；
96孔板经过宽离子束辐照改性后更加有利于细胞对96孔板的附着，有利于细胞的生长和存活，以及提高该评价方法的精准度；
盐酸异丙醇溶液相比于DMSO溶液，其成本更低，对细胞的毒性更小，具有很好的经济和环境效益，因此选用该溶液溶解MTT实验中形成的结晶物；
每次实验前对MTT工作液超声处理30分钟能够增加MTT粉末的溶解性，使得检测的精准度更高，并避免检测孔中粉末颗粒物造成的吸光值误差。
附图说明
图1是染毒一天后的细胞存活率柱状图；
图2是染毒三天后的细胞存活率柱状图；
图3是离子束辐照后的染毒一天细胞存活率柱状图；
图4是离子束辐照后的染毒三天细胞存活率柱状图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
本实施例包括以下步骤：
(1)将辐照前的降解菌株M9制备成菌体细胞悬液，并稀释为109个/mL；再制备降解菌株和MC-LR共存的储备液；
降解菌株和MC-LR共存的储备液的制备方法为：取50μM的纯MC-LR储备液200μL加入菌体细胞浓度为109个/mL的800μL细胞悬液中，配制的溶液中细胞悬液与MC-LR溶液的体积比为4:1；振荡均匀，在室温下避光培养三天；然后用0.22μm孔径的滤膜过滤，放入-20℃冰箱保存，制得降解菌株和MC-LR共存的储备液。
(2)分别配置浓度为1μM和0.1μM的MC-LR和菌株共存工作液、1μM和0.1μM的纯MC-LR工作液、降解菌株过滤后工作液；
MC-LR和菌株共存工作液的配置方法如下：取100μL步骤(1)制得的降解菌株和MC-LR共存的储备液加入到900μL DMEM完全培养基中，制得浓度为1μM的MC-LR和菌株共存工作液；再取100μL制得的1μM的MC-LR和菌株共存工作液加入到900μL DMEM完全培养基中，制得浓度为0.1μM的MC-LR和菌株共存工作液；
纯MC-LR工作液配置方法如下：取20μL浓度为50μM的纯MC-LR储备液加入到980μLDMEM完全培养基中，制得浓度为1μM的纯MC-LR工作液；再取100μL制得的1μM的纯MC-LR工作液加入到900μL DMEM完全培养基中，制得浓度为0.1μM的纯MC-LR工作液；
降解菌株过滤后工作液配置方法如下：取浓度为109个/mL的降解菌株细胞悬液80μL，加入到920μL DMEM完全培养基中制备并用0.22μm孔径的滤膜过滤而成；
(3)取处于对数生长期的Hep G2细胞接种在经过宽离子束辐照改性10min后的96孔板中，宽离子束辐照的能量为15keV，剂量为15kGy；每板接种18个孔，一组实验用一个板，总共接种2个板；在染毒一天的实验中，每孔接种8万细胞；在染毒三天的实验中，每孔接种4万细胞；分别培养24h；
(4)细胞染毒：24h后，用步骤(2)配制的各浓度的MC-LR和菌株共存工作液，以及步骤(2)配置的各浓度的纯MC-LR工作液对Hep G2细胞进行染毒，并设置降解菌株过滤后工作液处理组和对照组；
细胞染毒的处理方法为：每块96孔板中，三个孔加DMEM完全培养基作为对照，三个孔加1μM的MC-LR和菌株共存工作液，三个孔加0.1μM的MC-LR和菌株共存工作液，三个孔加1μM的纯MC-LR工作液，三个孔加0.1μM的纯MC-LR工作液，三个孔加降解菌株过滤后工作液；进行细胞染毒实验；
(5)进行MTT实验
将每孔接种8×104个细胞的96孔板染毒一天后进行MTT实验，将每孔接种4×104个细胞的96孔板染毒三天后进行MTT实验，然后检测其吸光值；
MTT实验步骤如下：取出染毒后的细胞，吸去孔里的液体，每孔加入200μL的PBS溶液清洗两遍；清洗完，每孔加入200μL浓度为1mg/mL的MTT工作液，放入培养箱孵育4h；每次MTT实验前对MTT工作液超声处理30分钟；终止孵育，吸弃MTT工作液，每孔加入200μL的盐酸异丙醇溶液，放入二氧化碳培养箱振荡且孵育20分钟，使结晶物充分溶解；然后取出96孔板，用酶标仪在570nm处测定OD值。
实施例2
经离子束辐照后的降解菌株，与MC-LR制备共存工作液对Hep G2细胞染毒并进行MTT实验，然后检测其吸光值，与实施例1辐照前的降解菌株比较对MC-LR的降解效果的强弱。
本实施例包括以下步骤：
(1)通过N+离子束注入技术对降解菌株M9进行辐照，得到辐照后降解菌株A1、A2、A3；
A1：辐照剂量为40个单位，每个单位为2.6×1013N+/cm2，
A2：辐照剂量为60个单位，每个单位为2.6×1013N+/cm2，
A3：辐照剂量为80个单位，每个单位为2.6×1013N+/cm2，
(2)将辐照前的降解菌株M9及辐照后的降解菌株A1、A2、A3制备成菌体细胞悬液，并稀释为109个/mL；再分别制备降解菌株M9、A1、A2、A3和MC-LR共存的储备液；
降解菌株和MC-LR共存的储备液的制备方法为：取50μM的纯MC-LR储备液200μL加入菌体细胞浓度为109个/mL的800μL细胞悬液中，配制的溶液中细胞悬液与MC-LR溶液的体积比为4:1；振荡均匀，在室温下避光培养三天；然后用0.22μm孔径的滤膜过滤，放入-20℃冰箱保存，制得降解菌株和MC-LR共存的储备液。
(3)分别配置浓度为1μM的MC-LR和菌株M9、A1、A2、A3的共存工作液、降解菌株A1、A2、A3的过滤后工作液；
MC-LR和菌株共存工作液的配置方法如下：取100μL步骤(2)制得的降解菌株和MC-LR共存的储备液加入到900μL DMEM完全培养基中，制得浓度为1μM的MC-LR和菌株M9、A1、A2、A3的共存工作液；
降解菌株过滤后工作液配置方法如下：取浓度为109个/mL的降解菌株M9、A1、A2、A3细胞悬液80μL，加入到920μL DMEM完全培养基中制备并用0.22μm孔径的滤膜过滤而成；
(4)取处于对数生长期的Hep G2细胞接种在经过宽离子束辐照改性10min后的96孔板中，宽离子束辐照的能量为15keV，剂量为15kGy；每板接种24个孔，一组实验用一个板，总共接种2个板；在染毒一天的实验中，每孔接种8万细胞；在染毒三天的实验中，每孔接种4万细胞；分别培养24h；
(5)细胞染毒：24h后，用步骤(3)配制的1μM的MC-LR和菌株共存工作液对Hep G2细胞进行染毒，并设置降解菌株过滤后工作液处理组和对照组；
细胞染毒的处理方法为：每块96孔板中，三个孔加DMEM完全培养基作为对照，三个孔加1μM的MC-LR和菌株M9共存工作液，三个孔加1μM的MC-LR和菌株A1共存工作液，三个孔加1μM的MC-LR和菌株A2共存工作液，三个孔加1μM的MC-LR和菌株A3共存工作液，三个孔加降解菌株A1过滤后工作液，三个孔加降解菌株A2过滤后工作液，三个孔加降解菌株A3过滤后工作液；进行细胞染毒实验；
(6)进行MTT实验
将每孔接种8×104个细胞的96孔板染毒一天后进行MTT实验，将每孔接种4×104个细胞的96孔板染毒三天后进行MTT实验，然后检测其吸光值；
MTT实验步骤如下：取出染毒后的细胞，吸去孔里的液体，每孔加入200μL的PBS溶液清洗两遍；清洗完，每孔加入200μL浓度为1mg/mL的MTT工作液，放入培养箱孵育4h；每次MTT实验前对MTT工作液超声处理30分钟；终止孵育，吸弃MTT工作液，每孔加入200μL的盐酸异丙醇溶液，放入二氧化碳培养箱振荡且孵育20分钟，使结晶物充分溶解；然后取出96孔板，用酶标仪在570nm处测定OD值。
测定染毒一天和三天后Hep G2细胞的吸光值，如表1-4所示。
表1染毒一天后进行MTT实验的结果
| OD值 | Control | 0.1μM | 0.1μM+M9 | 1μM | 1μM+M9 | M9 |
| 1 | 0.966 | 0.803 | 0.983 | 0.944 | 0.869 | 0.937 |
| 2 | 0.81 | 0.833 | 0.835 | 0.885 | 0.739 | 0.796 |
| 3 | 0.891 | 0.865 | 0.936 | 0.833 | 0.97 | 0.958 |
表2染毒三天后进行MTT实验的结果
| OD值 | Control | 0.1μM | 0.1μM+M9 | 1μM | 1μM+M9 | M9 |
| 1 | 1.125 | 1.023 | 1.137 | 0.959 | 1.006 | 1.156 |
| 2 | 1.253 | 1.048 | 1.076 | 1.041 | 1.165 | 1.225 |
| 3 | 1.128 | 1.137 | 1.21 | 0.897 | 1.015 | 0.904 |
表3经离子束辐照染毒一天后进行MTT实验的结果
| OD值 | Control | 1μM+M9 | 1μM+A1 | 1μM+A2 | 1μM+A3 | A1 | A2 | A3 |
| 1 | 0.893 | 0.843 | 0.899 | 0.982 | 0.972 | 0.956 | 0.914 | 0.879 |
| 2 | 0.947 | 0.911 | 0.908 | 0.877 | 0.937 | 0.912 | 0.926 | 0.931 |
| 3 | 0.966 | 0.969 | 0.991 | 1.01 | 0.893 | 0.924 | 0.911 | 0.921 |
表4经离子束辐照染毒三天后进行MTT实验的结果
| OD值 | Control | 1μM+M9 | 1μM+A1 | 1μM+A2 | 1μM+A3 | A1 | A2 | A3 |
| 1 | 1.006 | 0.948 | 0.85 | 1.021 | 0.958 | 0.929 | 0.984 | 0.937 |
| 2 | 1.067 | 0.856 | 0.862 | 1.134 | 0.873 | 1.009 | 1.017 | 1.005 |
| 3 | 0.993 | 0.888 | 0.885 | 1.077 | 0.882 | 1.017 | 1.036 | 1.047 |
对表1-4的数据进行处理，计算细胞存活率，其中，细胞存活率＝实验组OD值/对照组OD值，结果如表5-8以及图1-4所示。
表5染毒一天后的细胞存活率
| 存活率(％) | Control | 0.1μM | 0.1μM+M9 | 1μM | 1μM+M9 | M9 |
| 1 | 100 | 83.1 | 101.8 | 97.7 | 90 | 97 |
| 2 | 100 | 102.8 | 103.1 | 109.3 | 91.2 | 98.3 |
| 3 | 100 | 97.1 | 105.1 | 93.5 | 108.9 | 107.5 |
表6染毒三天后的细胞存活率
| 存活率(％) | Control | 0.1μM | 0.1μM+M9 | 1μM | 1μM+M9 | M9 |
| 1 | 100 | 90.9 | 101.1 | 85.2 | 89.4 | 102.8 |
| 2 | 100 | 83.6 | 85.9 | 83.1 | 93 | 97.8 |
| 3 | 100 | 100.8 | 107.3 | 79.5 | 90 | 80.1 |
表7经离子束辐照染毒一天后的细胞存活率
| 存活率(％) | Control | 1μM+M9 | 1μM+A1 | 1μM+A2 | 1μM+A3 | A1 | A2 | A3 |
| 1 | 100 | 94.4 | 100.7 | 110 | 108.8 | 107.1 | 102.4 | 98.4 |
| 2 | 100 | 96.2 | 95.9 | 92.6 | 98.9 | 96.3 | 97.8 | 98.3 |
| 3 | 100 | 100.3 | 102.6 | 104.6 | 92.4 | 95.7 | 94.3 | 95.3 |
表8经离子束辐照染毒三天后的细胞存活率
| 存活率(％) | Control | 1μM+M9 | 1μM+A1 | 1μM+A2 | 1μM+A3 | A1 | A2 | A3 |
| 1 | 100 | 94.2 | 84.5 | 101.5 | 95.2 | 92.3 | 97.8 | 93.1 |
| 2 | 100 | 80.2 | 80.8 | 106.3 | 81.8 | 94.6 | 95.3 | 94.2 |
| 3 | 100 | 89.4 | 89.1 | 108.5 | 88.8 | 102.4 | 104.3 | 105.4 |
经过多次实验取得的实验数据，然后取平均值以尽量消除实验误差。通过对实验数据的显著性分析，可以得出以下结论：
(1)1μM处理组对Hep G2细胞具有明显的细胞毒性，在三天的染毒实验中，与control组相比较，细胞存活率显著下降了约17.4％(P<0.01)。然而，在一天和三天的染毒实验中，0.1μM处理组对Hep G2细胞都未表现出明显细胞毒性(P>0.05)。
(2)降解菌株M9对MC-LR表现出明显的降解效果。在三天的染毒实验中，1μM+M9共存工作液处理组与其对应的1μM纯MC-LR工作液处理组相比，细胞存活率有显著的上升(P<0.05)。
(3)在三天的染毒实验中，与降解菌株M9相比，经辐照剂量为40和80个单位，每个单位为2.6×1013N+/cm2的辐照后，得到的A1和A3菌株对MC-LR的降解能力没有明显地增强；然而，经辐照剂量为60个单位，每个单位为2.6×1013N+/cm2的辐照后，得到的A2菌株与降解菌株M9相比，A2菌株对MC-LR的降解能力显著增强，1μM+A2共存工作液处理组与1μM+M9共存工作液处理组相比，细胞存活率显著上升了17.5％左右。证明这次诱变效果是正向诱变。
(4)通过离子束辐照，得到了对MC-LR降解效果更好的A2菌株。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种评估微囊藻毒素在真实水环境下毒性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将降解菌株制备成菌体细胞悬液，并稀释为109个/mL；再制备降解菌株和MC-LR共存的储备液；
通过N+离子束注入技术对降解菌株进行辐照，得到辐照后降解菌株A1、A2、A3，
A1：辐照剂量为40个单位，每个单位为2.6×1013N+/cm2，
A2：辐照剂量为60个单位，每个单位为2.6×1013N+/cm2，
A3：辐照剂量为80个单位，每个单位为2.6×1013N+/cm2；
降解菌株和MC-LR共存的储备液的制备方法为：
取50μM的纯MC-LR储备液200μL加入菌体细胞浓度为109个/mL的800μL细胞悬液中，配制的溶液中细胞悬液与MC-LR溶液的体积比为4:1；
振荡均匀，在室温下避光培养三天；然后用0.22μm孔径的滤膜过滤，放入-20℃冰箱保存，制得降解菌株和MC-LR共存的储备液；
(2)分别配置浓度为1μM和0.1μM的MC-LR和菌株共存工作液、1μM和0.1μM的纯MC-LR工作液、降解菌株过滤后工作液；
MC-LR和菌株共存工作液的配置方法如下：
取100μL步骤(1)制得的降解菌株和MC-LR共存的储备液加入到900μL DMEM完全培养基中，制得浓度为1μM的MC-LR和菌株共存工作液；
再取100μL制得的1μM的MC-LR和菌株共存工作液加入到900μL DMEM完全培养基中，制得浓度为0.1μM的MC-LR和菌株共存工作液；
(3)取处于对数生长期的Hep G2细胞接种在经过宽离子束辐照改性后的96孔板中，每板接种18个孔，一组实验用一个板，总共接种2个板；在染毒一天的实验中，每孔接种8万细胞；在染毒三天的实验中，每孔接种4万细胞；分别培养24h；
宽离子束辐照的能量为10～20keV，剂量为10～20kGy，辐照时间为5～20min；
(4)细胞染毒：24h后，用步骤(2)配制的各浓度的MC-LR和菌株共存工作液，以及步骤(2)配置的各浓度的纯MC-LR工作液对Hep G2细胞进行染毒，并设置降解菌株过滤后工作液处理组和对照组；
(5)进行MTT实验：
将每孔接种8×104个细胞的96孔板染毒一天后进行MTT实验，将每孔接种4×104个细胞的96孔板染毒三天后进行MTT实验，然后检测其吸光值。
2.根据权利要求1所述的一种评估微囊藻毒素在真实水环境下毒性的方法，其特征在于，所述降解菌株为蜡状芽孢杆菌M9。
3.根据权利要求1所述的一种评估微囊藻毒素在真实水环境下毒性的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，纯MC-LR工作液配置方法如下：
取20μL浓度为50μM的纯MC-LR储备液加入到980μL DMEM完全培养基中，制得浓度为1μM的纯MC-LR工作液；
再取100μL制得的1μM的纯MC-LR工作液加入到900μL DMEM完全培养基中，制得浓度为0.1μM的纯MC-LR工作液。
4.根据权利要求1所述的一种评估微囊藻毒素在真实水环境下毒性的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，降解菌株过滤后工作液配置方法如下：取浓度为109个/mL的降解菌株细胞悬液80μL，加入到920μL DMEM完全培养基中制备并用0.22μm孔径的滤膜过滤而成。
5.根据权利要求1所述的一种评估微囊藻毒素在真实水环境下毒性的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，细胞染毒的处理方法为：
每块96孔板中，三个孔加DMEM完全培养基作为对照，三个孔加1μM的MC-LR和菌株共存工作液，三个孔加0.1μM的MC-LR和菌株共存工作液，三个孔加1μM的纯MC-LR工作液，三个孔加0.1μM的纯MC-LR工作液，三个孔加降解菌株过滤后工作液；进行细胞染毒实验。
6.根据权利要求1所述的一种评估微囊藻毒素在真实水环境下毒性的方法，其特征在于，所述步骤(5)中，MTT实验步骤如下：
取出染毒后的细胞，吸去孔里的液体，每孔加入200μL的PBS溶液清洗两遍；清洗完，每孔加入200μL浓度为1mg/mL的MTT工作液，放入培养箱孵育4h；每次MTT实验前对MTT工作液超声处理30分钟；
终止孵育，吸弃MTT工作液，每孔加入200μL的盐酸异丙醇溶液，放入二氧化碳培养箱振荡且孵育20分钟，使结晶物充分溶解；然后取出96孔板，用酶标仪在570nm处测定OD值。
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