CN101775403A - 微囊藻毒素降解酶MlrA的全长cDNA序列、编码氨基酸和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种微囊藻毒素降解酶MlrA的全长cDNA序列、编码蛋白和应用，该微囊藻毒素降解酶MlrA全长cDNA序列的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示，其编码氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。本发明的微囊藻毒素降解酶MlrA全长cDNA序列对藻毒素的降解具有独特性和专一性，可用于检测水体或鱼类产品体内微囊藻毒素的情况。本发明的微囊藻毒素降解酶MlrA可作为粗酶制剂，用于优化养殖水体，有效地防止藻毒素对养殖水产品食用安全的危害，还可为鱼类饵料添加剂，减少水体中微囊藻毒素对鱼类肝细胞DNA的损伤，维持肝脏细胞在蓝藻水华高发时期对藻毒素的去毒能力，极大地提高了养殖鱼类的食用安全。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术应用及环境保护领域，具体涉及微囊藻毒素降解酶MlrA的全长cDNA序列、编码氨基酸和应用。
背景技术
微囊藻毒素(Microcystin，MC)是一类在蓝藻水华中出现频率最高、造成危害最严重的藻毒素，可造成野生动物、家畜、家禽等中毒死亡，并引发人类肝损伤和肝癌高发等危害。该毒素已确定了60多种异构体，最常见的为MC-LR、MC-RR和MC-YR三种。
对于MC的生物降解，Bourne等认为MC-LR的降解至少是由细胞内的3种水解酶促成的。Bourne等(Bourne D G，Riddles P，Jones G J，et al.2001.Characterization of a gene cluster involved in bacterial degradation of thecyanobacterial toxin microcystin LR[J].Environ Toxicol，16：523-534.)通过研究发现了藻毒素降解基因组MlrA，MlrB，MlrC和MlrD，其中，类金属蛋白酶MlrA是MC-LR降解最重要的酶，它能使稳定的MC-LR开环，开环后生成的线性MC-LR分子活性比MC-LR降低了160倍，从而使母体毒性大大降低。Saito等(Saito T，Sugiura N，Itayama T，et al.2003.Biodegradationof microcystis and microcystins by indigenous nanoflagellates on biofilm in apractical treatment facility[J].Environmental Technology，24(2)：143-151.)通过试验证实了MlrA对藻毒素的降解作用，还进一步说明了该基因对降解藻毒素的独特性和专一性。
近十几年，国内外开展了大量利用微生物方法降解MC的研究。但由于藻毒素具有环状结构和间隔双键，具有强的化学稳定性和对细菌肽酶的抵制作用，使得微生物法降解藻毒素效果不够理想。因此众多研究者也都将目光集中于筛选高效降解藻毒素的菌种及降解机理方面。
近年来，国内对MC降解技术主要集中在环境行为、毒理效应以及分离检测等方面，而对于去除MC，则更多的停留在高藻水的处理方面，如强化预氧化、化学药剂以及絮凝沉淀等单元操作，通过去除藻细胞间接地降低水中MC的质量浓度。这些降解技术存在成本较高，工作量大，而且无法彻底去除MC等诸多问题。相比之下生物法因具有处理成本低、操作简便、不易引起二次污染等特点而更具研究意义和发展前途。
MC降解菌有鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和青枯菌(Pseudomonas solanacearum)。其中鞘氨醇单胞菌和铜绿假单胞菌分别以微囊藻毒素酶和碱性蛋白酶降解微囊藻毒素。
如何消除水体MC的污染是世界各国共同面临的一个问题。虽然目前对MC降解酶的机制的主要框架已有所了解，但是如何利用MC降解酶的机制去指导应用，则是当前迫切需要解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种可高效去除水体中的微囊藻毒素，且对微囊藻毒素具有独特性和专一性的MlrA基因的全长cDNA序列。
本发明的另一个目的在于提供上述MlrA基因的全长cDNA序列所编码的氨基酸序列。
本发明的另一个目的在于提供上述MlrA基因所表达的蛋白在优化养殖水体或作为养殖鱼类饲料添加剂中的应用。
本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的：
一、MlrA基因的全长cDNA序列的获得
采集不同季节水环境中的表层水体，将表层水体经过滤、离心处理后，所得作为水样模板。采集鱼类肠道内排泄物，经过滤、离心处理后，所得作为肠道样品模板。
设计一对MlrA基因的特异引物F1和F3：
上游引物F1，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；
下游引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示；
利用上述引物和模板，用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增。
PCR扩增反应体系：待测样品1μl、10×PCR buffer 5μl、dNTPs(10mMeach)4μl、MlrA引物F1 1μl、引物F3 1μl、Taq DNA聚合酶0.25μl，加ddH2O至50μl。
上述PCR扩增条件为：94℃预变性3min；94℃1min，55℃1min，72℃1min，共30个循环；最后72℃延伸5min。
将扩增产物经常规的切胶回收、纯化、T载体连接、转化感受态以及阳性克隆筛选等操作，将所得阳性克隆送交测序。
测序结果证实，PCR扩增片段长度为897bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其中，从1～339个核苷酸的区域为保守区域。
上述SEQ ID NO：1所示核苷酸序列共编码299个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
将测序所得序列在NCBI网站上Blast比较结果表明，该序列与日本学者Saito所公布的Sphingomonas sp.MD-1、Y2菌株的MlrA基因同源性高达92％和88％，与挪威Sphingomonas sp.ACM-3962、澳大利亚Sphingopyxis sp.LH21菌株的MlrA基因同源性分别为92％和91％，，由此说明本发明获得的cDNA序列属于鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas sp)。氨基酸序列比较结果可见高保守性。
二、水体中微囊藻毒素检测方法
本发明分别采集3、4、5、7、8、10、11和12月份，一共8个月份的不同地点水库中的表层水样和鱼类肠道样品，采用优化的MlrA基因的特异性检测引物F1(其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示)和F2(其核苷酸序列如SEQID NO：6所示)，对不同月份的水样和鱼类肠道样品进行PCR扩增。
观察PCR扩增结果，4月和5月的水样及鱼类肠道中均能扩增出MlrA基因全长cDNA序列的保守区域(核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示)，而3、7、8、10、11和12月份，这六个月份的水样和鱼类肠道中均未能扩增出MlrA基因的保守区域(核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示)。
将该PCR扩增结果和环境试剂情况进行对比：
(1)在水华发生的4、5月份，自然环境中能检测到藻毒素降解酶的存在。此时水体中高含量的N和P营养物，充足的光照及适宜的温度有利于水体中藻类的生长繁殖。当水环境中产微囊藻毒素的藻类数量较多时，藻毒素降解酶的检测呈阳性，而且本发明的水样和鱼类肠道样品是在不同地点采样的，但是其PCR扩增结果是一致的，均能扩增出MlrA基因保守区域的目的片段(其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示)；
(2)而3、7、8、10、11和12月份，这六个月份的水体中藻类较少，因此水环境中微囊藻毒素含量很少，这也与PCR扩增结果保持一致，这六个月份不同地点的水样和鱼类肠道样品中均未能扩增出MlrA基因保守区域的目的片段。
通过上述PCR扩增结果和自然环境实际情况的对比，可以看出本发明成功克隆出的MlrA基因的表达与微囊藻毒素具有密切的关系，可结合PCR技术实现对水体中微囊藻毒素的检测。
因此，本发明提供一种水体中微囊藻毒素的检测方法，该方法是采用优化的MlrA基因检测引物F1(其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示)和F2(其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示)，对待测样品进行PCR扩增，如果能够扩增出MlrA基因保守区域的目的片段(其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示)，则说明待测样品中含有微囊藻毒素，否则说明待测样品中不含有微囊藻毒素。
上述检测方法中，PCR的扩增采用Taq DNA聚合酶进行，其扩增体系以及扩增条件可参考相关试剂盒的说明，均能实现本发明。
上述检测方法中，PCR扩增体系可选择：样品1μl、10×PCR buffer 5μl、dNTPs(10mM each)4μl、MlrA引物F1 1μl、引物F2 1μl、Taq DNA聚合酶0.25μl，加ddH2O至50μl。
上述检测方法中，PCR扩增条件可选择：94℃预变性3min；94℃1min，55℃1min，72℃1min，共30个循环；最后72℃延伸5min。具体操作时，还可根据需要进行二次PCR，PCR反应条件同前述。
本发明MlrA基因全长cDNA序列表达的MlrA蛋白，可制备成MlrA粗酶制剂，用于优化养殖水体，维持鱼体肝脏细胞的高活力，降低水体中微囊藻毒素对鱼类机体的损伤，有利于其肝脏细胞在代谢等生理活动中发挥良好的去毒作用。
上述MlrA粗酶制剂的制备，可采用将含有MlrA基因全长cDNA序列的质粒转化大肠杆菌，经常规培养，收集培养产物制备为所需MlrA粗酶制剂，该MlrA粗酶制剂具MlrA蛋白活性，可实现对微囊藻毒素的降解。
上述MlrA粗酶制剂的制备，具体可采用如下方法：
根据克隆所得鞘氨醇单胞菌MlrA基因全长cDNA序列，构建重组表达载体pET3c-MlrA。重组表达载体pET3c-MlrA经鉴定后转化表达菌株Escherichiacoli BL21(DE3)pLysS。所得重组菌在LB液体培养基中37℃扩大培养24h，在0.5mM浓度IPTG诱导下利用T7启动子高效表达，培养产物45℃烘干后超声波细胞粉碎机破碎重组大肠杆菌，收集所得产物即为所需MlrA粗酶制剂。
上述MlrA粗酶制剂可以直接投放到水中，实现降解微囊藻毒素，纯化水体的作用，还可以作为添加剂加入到鱼类饲料中，帮助鱼体内对微囊藻毒素的降解。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1.本发明通过研究发现，微囊藻毒素富集的时候表层水体微生物和鱼类肠道内也可能会相应地产生大量的分解酶的，根据这一现象，本发明人设计得到对微囊藻毒素具有特异性的引物，并对PCR扩增反应条件和反应体系进行了优化摸索，从而得到一条新的MlrA基因的全长cDNA序列及其编码蛋白的氨基酸序列；
2.本发明的MlrA基因的全长cDNA序列对藻毒素的降解具有独特性和专一性，构建表达产生其蛋白的重组大肠杆菌，将培养产物制备为一种高效降解藻毒素的MlrA粗酶制剂，在淡水养殖经济鱼类在微囊藻等蓝藻水华高发期，直接投放于水中，有利于鱼类自身代谢排除微囊藻毒素，通过鱼自身的代谢体系就能够将摄入及积累的毒素分解排泄出去，不需对养成的水产品进行任何专门处理，操作便捷，降低了水体中微囊藻毒素对鱼类机体的损伤，极大地提高了养殖鱼类的食用安全；
3.本发明基于MlrA蛋白是由重组大肠杆菌菌株中表达产生的，故将其制成一种高效降解藻毒素的MlrA粗酶制剂，添加到鱼饲料中，喂投经济养殖鱼类，减少水体中微囊藻毒素对鱼类肝细胞DNA的损伤，有利于维持肝脏细胞在蓝藻水华高发时期对藻毒素的去毒能力。
附图说明
图1为实施例1中PCR扩增电泳图；
其中，M为Marker，1为待测样品；
图2为实施例1中MlrA基因cDNA序列编码氨基酸序列的系统树；
图3为实施例2中PCR扩增电泳图部分结果；
其中，1～3为4月份水样，4为4月鲮鱼肠道、5为4月黄尾密鲴肠道，6为4月鲤鱼肠道，7为4月鲢鱼肠道，8为4月鲫鱼肠道，9为10月份水样，10为10月鲮鱼肠道，11为10月鳙鱼肠道，12为10月草鱼肠道，13为10月罗非鱼肠道，14为Marker，箭头所指为目的片段；
图4为IPTG诱导下的MlrA表达量电泳图；
其中，M为Marker，1为待测样品；
图5普通水体与投放MlrA粗酶制剂的优化水体养殖尼罗罗非鱼72h后肝细胞活力差异；
其中，1为投放有MlrA粗酶制剂的水体，2为普通水体；
图6投喂添加MlrA粗酶制剂饵料与普通饵料组组彗星电泳图。
其中，A为投喂添加MlrA粗酶制剂饵料组，B为投喂普通饵料组。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步地描述，但具体实施例并不对本发明做任何限定。
实施例所用试剂：
TaKaRa PCRTM及pMD 19-T Vector为大连宝生物工程有限公司产品；H.Q.&.Q.Gel Extraction Kit II为U-gene公司产品；HP Plasmid Mini Kit为OMEGA公司产品；0.25％胰蛋白酶购自AMRESCO公司；DMEM(dulbeccomodified eagle medium)购自Gibco/Brl公司；胎牛血清购自Difco公司；DNA分子标准Marker、琼脂糖等相关试剂购自TOYOBO公司、V-gene公司；其它试剂均为进口分装或者国产分析纯试剂。保存pET3c质粒的E.coli DM5α及表达宿主菌株为E.coli BL21(DE3)pLysS均由本实验室保存。引物合成和测序送上海生工生物工程有限公司完成。
实施例1 MlrA基因cDNA序列及其编码氨基酸序列的获得
1.样品采集和处理
实验所用水样采集于广东省惠州市显岗水库、广州市暨南大学明湖及广东省罗非鱼良种场，鱼类肠道样品采集于广东省惠州市显岗水库。
水样用采样瓶采集各地点表层水体。
鱼类肠道为现场处死实验鱼后，取其后肠(约10cm)，挑出后肠内排泄物混于15ml蒸馏水中，得到鱼类肠道样品。
将上述水样和鱼类肠道样品混合后，通过中速定性滤纸过滤除去杂质后，12000rpm离心1min，收集微生物混合物，样品放入冰箱4℃保存备用。
2.引物设计
设计合成1对特异引物F1和F3：
上游引物F1，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；
下游引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。
3.PCR扩增
以上述微生物混合物作为模板，将特异引物F1和F3在Taq DNA聚合酶的作用下进行PCR扩增。
上述PCR扩增的反应体系：样品1μl、10×PCR buffer 5μl、dNTPs(10mMeach)4μl、MlrA引物F1 1μl、引物F3 1μl、Taq DNA聚合酶0.25μl，加ddH2O至50μl。
上述PCR扩增条件为：94℃预变性3min；94℃1min，55℃1min，72℃1min，共30个循环；最后72℃延伸5min。
二次PCR反应条件同上。
3.测序结果分析
观察水样和鱼类肠道微生物混合物的PCR扩增电泳，结果如图1所示，在897bp左右有扩增条带。
4.PCR产物的克隆及序列分析
将PCR产物经2％琼脂糖电泳纯化，H.Q.&.Q.Gel Extraction Kit II回收后克隆至pMD 19-T Vector，转化感受态E.coli DH5α，利用M13正反向引物，通过PCR反应检测得到阳性克隆，PCR检测阳性克隆后送交测序公司测序。
根据测序结果进行分析整理得到MlrA基因全长cDNA序列，长度为897bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其中，从1～339个核苷酸的区域为保守区域，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
利用软件分析和推测其氨基酸序列，上述MlrA基因全长cDNA序列编码299个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
将测序所得序列在NCBI网站上Blast比较结果表明，该序列与日本学者Saito所公布的Sphingomonas sp.MD-1、Y2菌株的MlrA基因同源性高达92％和88％，与挪威Sphingomonas sp.ACM-3962、澳大利亚Sphingopyxis sp.LH21菌株的MlrA基因同源性分别为92％和91％，说明本实施例的MlrA基因cDNA序列为新序列，属于鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas sp.)，并与已知MlrA基因序列均有很高的一致性。
利用Mega 4软件，将上述MlrA基因cDNA序列编码的氨基酸序列与GenBank已知微囊藻毒素降解基因一起构建系统树，如图2所示，由图中氨基酸序列比较结果可见其高保守性。
实施例2 不同季节水体、鱼体中MlrA检测结果
1.样品采集和处理
实验所用水样采集于广东省惠州市显岗水库、广州市暨南大学明湖及广东省罗非鱼良种场，鱼类肠道样品采集于广东省惠州市显岗水库。
在3、4、5、7、8、10、11和12月份，分别采集水样和鱼类肠道样品。
水样用采样瓶采集各地点表层水体。
鱼类肠道样品是现场处死实验鱼后，取其后肠(约10cm)，挑出后肠内排泄物混于15ml蒸馏水中，得到鱼类肠道样品。
将上述各个季节水环境中的水样和鱼类肠道样品，分别通过中速定性滤纸过滤除去杂质后，12000rpm离心1min，收集沉淀，分别标注好，放入冰箱4℃保存备用。
2.PCR扩增
采用已优化的MlrA基因的特异性检测引物F1(其核苷酸序列如SEQ IDNO：5所示)和F2(其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示)，以上述各个季节水环境中的水样和鱼类肠道样品作为模板，用Taq DNA聚合酶分别进行PCR扩增。
PCR扩增体系为：样品1μl、10×PCR buffer 5μl、dNTPs(10mM each)4μl、MlrA引物F1 1μl、引物F2 1μl、Taq DNA聚合酶0.25μl，加ddH2O至50μl。
PCR扩增条件为：94℃预变性3min；94℃1min，55℃1min，72℃1min，共30个循环；最后72℃延伸5min。
二次PCR反应条件同上。
3.测序结果分析
观察不同季节水环境中水样和鱼类肠道的PCR扩增电泳，MlrA基因cDNA全序列的保守区域的检测结果，如果在339bp左右有扩增条带，则该检测结果为阳性，如果在339bp左右未出现扩增条带，则该检测结果为阴性，结果如表1所示。
表1 不同季节PCR扩增检测结果
| 采样时间 | 3月 | 4月 | 5月 | 7月 | 8月 | 10月 | 11月 | 12月 |
| 采样地点 | 明湖 | 显岗水库 | 明湖 | 显岗水库 | 显岗水库 | 显岗水库 | 明湖 | 良种场 |
| 采样时间 | 3月 | 4月 | 5月 | 7月 | 8月 | 10月 | 11月 | 12月 |
| 水样 | - | + | + | - | - | - | - | - |
| 鲮鱼 | + | - | - | |||||
| 草鱼 | - | - | ||||||
| 鲢鱼 | + | - | ||||||
| 鲤鱼 | + | - | ||||||
| 鳙鱼 | - | |||||||
| 鲫鱼 | + | |||||||
| 罗非鱼 | - | |||||||
| 黄尾密鲴 | + |
表1中，符号“-”表示阴性检测结果，符号“+”表示阳性检测结果，空白处为未检测样品。
从表中可以看出4月和5月的水样及鱼类肠道中均能扩增出MlrA基因全长cDNA序列的保守区域(其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示)，而3、7、8、10、11和12月份，这六个月份的水样和鱼类肠道中均未能扩增出MlrA基因全长cDNA序列的保守区域(其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示)。
图3给出部分电泳结果，从图3中可以看出，不论是4月份的水体还是鱼类肠道，均在339bp处出现目的片段，而10月份的鱼类则未出现目的片段。
将该PCR扩增结果和环境试剂情况进行对比：
(1)在水华发生的4、5月份，自然环境中能检测到藻毒素降解酶的存在。此时水体中高含量的N和P营养物，充足的光照及适宜的温度有利于水体中藻类的生长繁殖。当水环境中产微囊藻毒素的藻类数量较多时，藻毒素降解酶的检测呈阳性，而且本发明的水样和鱼类肠道样品是在不同地点采样的，但是其PCR扩增结果是一致的，均能扩增出MlrA基因全长cDNA序列的保守区域(其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示)；
(2)而3、7、8、10、11和12月份，这六个月份的水体中藻类较少，因此水环境中微囊藻毒素含量很少，这也与PCR扩增结果保持一致，这六个月份不同地点的水样和鱼类肠道样品中均未能扩增出MlrA基因全长cDNA序列的保守区域(其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示)。
通过上述PCR扩增结果和自然环境实际情况的对比，可以看出本发明成功克隆出的MlrA基因全长cDNA序列的保守区域(其核苷酸序列如SEQ IDNO：4所示)与微囊藻毒素具有密切的关系，可结合PCR技术实现对水体中微囊藻毒素的检测。
实施例3 表达MlrA蛋白的MlrA粗酶制剂的制备
1.重组表达载体pET3c-MlrA的构建
将实施例1克隆所得鞘氨醇单胞菌MlrA基因全长cDNA序列，采用H.Q.&.Q.Gel Extraction Kit II纯化PCR产物。
取含pET3c质粒的E.coli DM5α保存液50μL，接种于4mL LB液体培养基(含Amp)中，37℃，280rpm振荡培养过夜。采用HP Plasmid Mini Kit提取pET3c质粒。
2.鞘氨醇单胞菌MlrA的表达及MlrA粗酶制剂的制备
PCR纯化产物与pET3c质粒构建重组表达载体pET3c-MlrA。重组表达载体pET3c-MlrA经鉴定后转化表达菌株Escherichia coli BL21(DE3)pLysS。所得重组菌在LB液体培养基中37℃扩大培养24h，在0.5mM浓度IPTG诱导下利用T7启动子高效表达(IPTG诱导下的MlrA表达量电泳图，如图4所示)，32KD左右出现目的蛋白，培养产物45℃烘干后超声波细胞粉碎机破碎重组大肠杆菌，收集所得产物即为所需MlrA粗酶制剂。
实施例4 MlrA粗酶制剂在优化水体中的应用
1.尼罗罗非鱼(平均体重50g)随机分成两组，对照组养殖于普通水体，处理组养殖于优化水体(按每立方米水体投放约1.0～3.0g实施例3制备所得MlrA粗酶制剂)。
实验期间每天喂食饵料二次(上午10:00和下午15:00)，喂养量每天增加体重的4％。喂养72h后，每组分别挑选6条鱼，取其肝脏样品并保存。
2.实验鱼肝细胞培养
取尼罗罗非鱼肝脏，D-Hanks液清洗2遍后，加入少量0.25％胰蛋白酶后，剪成1～2mm3小块，补加至2倍(v/v)的0.25％胰蛋白酶消化45min，温度26±2℃。Hanks液终止消化，依次过100目、200目、400目滤网，800r/min离心5min收集肝细胞。Hanks液清洗2次，培养基再悬浮。用0.4％台盼蓝在细胞计数板上计数细胞密度及测定细胞活力，使其≥96％。肝细胞在多孔培养板或培养瓶中培养，以含10％胎牛血清及100U/mL链霉素和100U/mL青霉素的DMEM高糖培养液为培养基，在5％CO2、28℃ CO2培养箱内培养以备检测。
3.肝细胞活力的测定
细胞悬液与0.5％台盼蓝染液按1∶1体积比混合，3min后于血球计数板上计数，活细胞圆形透明，死细胞染成蓝色，用活细胞占计数细胞中的百分比表示细胞活力。
4.结果
肝细胞活力的测定表明，水体中投放实施例3制备所得MlrA粗酶制剂72h组，尼罗罗非鱼肝脏细胞培养60h内肝细胞活力均高于未投放组(如图5所示)。结果证明，投放粗酶制剂于水体中，可维持鱼体肝脏细胞的高活力，从而降低水体中微囊藻毒素对鱼类机体的损伤，有利于其肝脏细胞在代谢等生理活动中发挥良好的去毒作用，提高了养殖鱼类的食用安全。
实施例5 MlrA粗酶制剂添加到鱼类饲料中的应用
1.按每公斤干饲料添加约0.1％～0.2％实施例3制备所得MlrA粗酶制剂的量，将粗酶制剂直接混合加入普通鱼饲料中即得。
2.取尼罗罗非鱼(平均体重50g)实验期间每天喂食饵料二次(上午10:00和下午15:00)，喂养量每天增加体重的4％。实验鱼分成两组，对照组投喂普通鱼饵料，处理组投喂添加粗酶制剂的鱼饵料。48h后，每组分别挑选6条鱼，取其肝脏样品并保存。
3.实验鱼肝脏形态观察及肝细胞培养
取尼罗罗非鱼肝脏，D-Hanks液清洗2遍后，加入少量0.25％胰蛋白酶后，剪成1～2mm3小块，补加至2倍(v/v)的0.25％胰蛋白酶消化45min，温度26±2℃。Hanks液终止消化，依次过100目、200目、400目滤网，800r/min离心5min收集肝细胞。Hanks液清洗2次，培养基再悬浮。用0.4％台盼蓝在细胞计数板上计数细胞密度及测定细胞活力，使其≥96％。肝细胞在多孔培养板或培养瓶中培养，以含10％胎牛血清及100U/mL链霉素和100U/mL青霉素的DMEM高糖培养液为培养基，在5％CO2、28℃ CO2培养箱内培养以备实验。
4.单细胞凝胶电泳检测与结果观察、拍照
将琼脂凝胶融化后放入37℃水浴待用，第一层胶制备：85μL 1.0％正常熔点琼脂糖均匀铺在预热的磨砂载玻片(1.2×75×25mm)上，迅速盖上盖玻片(18×18mm)，4℃固化10min；第二层胶制备：取出载玻片揭去盖玻片，吸取70μL含约104个淋巴细胞的0.75％低熔点琼脂糖均匀铺在第一层凝胶上，迅速加盖盖玻片，4℃固化10min；第三层胶制备：轻轻揭去盖玻片，再于其上铺70μL 0.75％熔点琼脂糖，盖上盖片，4℃固化10min。
4℃裂解30min(细胞裂解液：2.5mol/L NaCl，100mmol/L Na2EDTA，10mmol/L Tris，pH 10.0，用前加终浓度为1％Triton X-100和10％DMSO)。裂解后，置入装有预冷电泳液(0.2mol/L Na2EDTA，10mol/L NaOH，pH 13)的电解槽中，避光静置40min，解旋后电泳。Tris-HCl缓冲液中和3次，每次5min。中和后用SYBR-Gold染色剂染色10min。染色后的样本尽快置于荧光倒置显微镜下，观察DNA图象，拍片(使用ZEISS AX200型荧光倒置显微镜系统进行观察拍照)。
5.结果
荧光显微镜下观察DNA被SYBR-Gold染成绿色。SCGE检测显示，与普通饵料组相比，添加粗酶制剂饵料组未见明显彗星尾，显示为1个圆形的荧光信号，表明无DNA链的断裂；而普通饵料组出现较明显的彗星拖尾现象(图6)。结果表明，投喂经济养殖鱼类高效降解藻毒素的MlrA粗酶制剂，可减少微囊藻毒素对鱼类肝细胞DNA的损伤，提高了对养殖鱼类肝脏的保护作用，有利于其肝脏细胞进行正常的毒素代谢。
微囊藻毒素降解酶MlrA的全长cDNA序列、编码氨基酸和应用 序列表SEQUENCE LISTING
<110>暨南大学
<120>微囊藻毒素降解酶MlrA的全长cDNA序列、编码氨基酸和应用
<130>
<160>7
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>897
<212>DNA
<213>鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas sp)
<400>1
atgttcaaga tgctgcaaga gacgcacgct cacctcaaca ttcttaccgc tgtcaggtcc 60
acgttcgagt atccgggagc ctatacgctt ttgctgtttc cggccgcccc aatgttcgcg 120
gctctgatcg taaccggtat cggctatggg cgctcaggat ttcgtgaact gctgagccgc 180
tgcgccccgt ggcgatcgcc tgtttcctgg cgtcaaggcg ttactgtcat agccgtgtgt 240
ttccttgcgt tcttcgcgct cacaggaatt atgtgggttc agacatacct ctacgctccg 300
ccgggtacgc ttgatcgcac cttcctgcgc tatgggtcag atccggtctc tatttatgtg 360
atgctggcag catcgctgct aatcagccct ggcccgctgc tggaagaact tggctggcgc 420
gggttcgcac tgccccagct cctcaagaag tttgaccccc tgaccgcggc ggtcatcctc 480
ggcatcatgt ggtgggcctg gcatttgcca cgcgacttgc cggcactgtt ctccggcgag 540
cctggcgcgg cctggagcgt tattgtcaag cagttcgtta tcactcccgg aatgatcgcc 600
agtacgatca tcgctgtctt tgtttgcaac aagctcggtg gatcactgtg gggcggagtg 660
ctcattcacg ccatccataa cgagctgggc gtaaacgtca ctgccgaatg ggctccagcg 720
gtcgcaggac tcgggtggcg cccatgggat ctcatcgaat tcgccgtggc cattggactc 780
gtcctgattt gtgggaggag ccttggtgca gcatctcctg acaatgcgcg tttgacctgg 840
ggaaacgtgc cgccaaagtt cccgggcgga gtgggtgaca agtccggtgc aaacgcg 897
<210>2
<211>897
<212>DNA
<213>鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas sp)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(897)
<400>2
atg ttc aag atg ctg caa gag acg cac gct cac ctc aac att ctt acc 48
Met Phe Lys Met Leu Gln Glu Thr His Ala His Leu Asn Ile Leu Thr
1 5 10 15
gct gtc agg tcc acg ttc gag tat ccg gga gcc tat acg ctt ttg ctg 96
Ala Val Arg Ser Thr Phe Glu Tyr Pro Gly Ala Tyr Thr Leu Leu Leu
20 25 30
ttt ccg gcc gcc cca atg ttc gcg gct ctg atc gta acc ggt atc ggc 144
Phe Pro Ala Ala Pro Met Phe Ala Ala Leu Ile Val Thr Gly Ile Gly
35 40 45
tat ggg cgc tca gga ttt cgt gaa ctg ctg agc cgc tgc gcc ccg tgg 192
Tyr Gly Arg Ser Gly Phe Arg Glu Leu Leu Ser Arg Cys Ala Pro Trp
50 55 60
cga tcg cct gtt tcc tgg cgt caa ggc gtt act gtc ata gcc gtg tgt 240
Arg Ser Pro Val Ser Trp Arg Gln Gly Val Thr Val Ile Ala Val Cys
65 70 75 80
ttc ctt gcg ttc ttc gcg ctc aca gga att atg tgg gtt cag aca tac 288
Phe Leu Ala Phe Phe Ala Leu Thr Gly Ile Met Trp Val Gln Thr Tyr
85 90 95
ctc tac gct ccg ccg ggt acg ctt gat cgc acc ttc ctg cgc tat ggg 336
Leu Tyr Ala Pro Pro Gly Thr Leu Asp Arg Thr Phe Leu Arg Tyr Gly
100 105 110
tca gat ccg gtc tct att tat gtg atg ctg gca gca tcg ctg cta atc 384
Ser Asp Pro Val Ser Ile Tyr Val Met Leu Ala Ala Ser Leu Leu Ile
115 120 125
agc cct ggc ccg ctg ctg gaa gaa ctt ggc tgg cgc ggg ttc gca ctg 432
Ser Pro Gly Pro Leu Leu Glu Glu Leu Gly Trp Arg Gly Phe Ala Leu
130 135 140
ccc cag ctc ctc aag aag ttt gac ccc ctg acc gcg gcg gtc atc ctc 480
Pro Gln Leu Leu Lys Lys Phe Asp Pro Leu Thr Ala Ala Val Ile Leu
145 150 155 160
ggc atc atg tgg tgg gcc tgg cat ttg cca cgc gac ttg ccg gca ctg 528
Gly Ile Met Trp Trp Ala Trp His Leu Pro Arg Asp Leu Pro Ala Leu
165 170 175
ttc tcc ggc gag cct ggc gcg gcc tgg agc gtt att gtc aag cag ttc 576
Phe Ser Gly Glu Pro Gly Ala Ala Trp Ser Val Ile Val Lys Gln Phe
180 185 190
gtt atc act ccc gga atg atc gcc agt acg atc atc gct gtc ttt gtt 624
Val Ile Thr Pro Gly Met Ile Ala Ser Thr Ile Ile Ala Val Phe Val
195 200 205
tgc aac aag ctc ggt gga tca ctg tgg ggc gga gtg ctc att cac gcc 672
Cys Asn Lys Leu Gly Gly Ser Leu Trp Gly Gly Val Leu Ile His Ala
210 215 220
atc cat aac gag ctg ggc gta aac gtc act gcc gaa tgg gct cca gcg 720
Ile His Asn Glu Leu Gly Val Asn Val Thr Ala Glu Trp Ala Pro Ala
225 230 235 240
gtc gca gga ctc ggg tgg cgc cca tgg gat ctc atc gaa ttc gcc gtg 768
Val Ala Gly Leu Gly Trp Arg Pro Trp Asp Leu Ile Glu Phe Ala Val
245 250 255
gcc att gga ctc gtc ctg att tgt ggg agg agc ctt ggt gca gca tct 816
Ala Ile Gly Leu Val Leu Ile Cys Gly Arg Ser Leu Gly Ala Ala Ser
260 265 270
cct gac aat gcg cgt ttg acc tgg gga aac gtg ccg cea aag ttc ccg 864
Pro Asp Asn Ala Arg Leu Thr Trp Gly Asn Val Pro Pro Lys Phe Pro
275 280 285
ggc gga gtg ggt gac aag tcc ggt gca aac gcg 897
Gly Gly Val Gly Asp Lys Ser Gly Ala Asn Ala
290 295
<210>3
<211>299
<212>PRT
<213>鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas sp)
<400>3
Met Phe Lys Met Leu Gln Glu Thr His Ala His Leu Asn Ile Leu Thr
1 5 10 15
Ala Val Arg Ser Thr Phe Glu Tyr Pro Gly Ala Tyr Thr Leu Leu Leu
20 25 30
Phe Pro Ala Ala Pro Met Phe Ala Ala Leu Ile Val Thr Gly Ile Gly
35 40 45
Tyr Gly Arg Ser Gly Phe Arg Glu Leu Leu Ser Arg Cys Ala Pro Trp
50 55 60
Arg Ser Pro Val Ser Trp Arg Gln Gly Val Thr Val Ile Ala Val Cys
65 70 75 80
Phe Leu Ala Phe Phe Ala Leu Thr Gly Ile Met Trp Val Gln Thr Tyr
85 90 95
Leu Tyr Ala Pro Pro Gly Thr Leu Asp Arg Thr Phe Leu Arg Tyr Gly
100 105 110
Ser Asp Pro Val Ser Ile Tyr Val Met Leu Ala Ala Ser Leu Leu Ile
115 120 125
Ser Pro Gly Pro Leu Leu Glu Glu Leu Gly Trp Arg Gly Phe Ala Leu
130 135 140
Pro Gln Leu Leu Lys Lys Phe Asp Pro Leu Thr Ala Ala Val Ile Leu
145 150 155 160
Gly Ile Met Trp Trp Ala Trp His Leu Pro Arg Asp Leu Pro Ala Leu
165 170 175
Phe Ser Gly Glu Pro Gly Ala Ala Trp Ser Val Ile Val Lys Gln Phe
180 185 190
Val Ile Thr Pro Gly Met Ile Ala Ser Thr Ile Ile Ala Val Phe Val
195 200 205
Cys Asn Lys Leu Gly Gly Ser Leu Trp Gly Gly Val Leu Ile His Ala
210 215 220
Ile His Asn Glu Leu Gly Val Asn Val Thr Ala Glu Trp Ala Pro Ala
225 230 235 240
Val Ala Gly Leu Gly Trp Arg Pro Trp Asp Leu Ile Glu Phe Ala Val
245 250 255
Ala Ile Gly Leu Val Leu Ile Cys Gly Arg Ser Leu Gly Ala Ala Ser
260 265 270
Pro Asp Asn Ala Arg Leu Thr Trp Gly Asn Val Pro Pro Lys Phe Pro
275 280 285
Gly Gly Val Gly Asp Lys Ser Gly Ala Asn Ala
290 295
<210>4
<211>340
<212>DNA
<213>鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas sp)
<400>4
atgttcaaga tgctgcaaga gacgcacgct cacctcaaca ttcttaccgc tgtcaggtcc 60
acgttcgagt atccgggagc ctatacgctt ttgctgtttc cggccgcccc aatgttcgcg 120
gctctgatcg taaccggtat cggctatggg cgctcaggat ttcgtgaact gctgagccgc 180
tgcgccccgt ggcgatcgcc tgtttcctgg cgtcaaggcg ttactgtcat agccgtgtgt 240
ttccttgcgt tcttcgcgct cacaggaatt atgtgggttc agacatacct ctacgctccg 300
ccgggtacgc ttgatcgcac cttcctgcgc tatgggtcag 340
<210>5
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
cacgctcacc tcaacattc 19
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
gcgtagaggt atgtctgaac 20
<210>7
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
ttgcaccgga cttgtcac 18
Claims (6)
1.一种微囊藻毒素降解酶MlrA的全长cDNA序列，其核苷酸序列如SEQID NO：1所示。
2.一种微囊藻毒素降解酶MlrA，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
3.一种重组表达载体，其特征在于该重组表达载体中含有权利要求1所述全长cDNA序列。
4.一种重组微生物，其特征在于该重组微生物是由权利要求3所述重组表达载体转化原核感受态细胞制备而得。
5.权利要求2所述微囊藻毒素降解酶MlrA在优化养殖水体中的应用。
6.权利要求2所述微囊藻毒素降解酶MlrA在作为养殖鱼类饲料添加剂中的应用。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| CN201019050020A CN101775403A (zh) | 2010-02-02 | 2010-02-02 | 微囊藻毒素降解酶MlrA的全长cDNA序列、编码氨基酸和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
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Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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Family Applications (1)
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-
2010
- 2010-02-02 CN CN201019050020A patent/CN101775403A/zh active Pending
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