CN109896638B

CN109896638B - 微囊藻毒素降解酶在降解节球藻毒素中的应用

Info

Publication number: CN109896638B
Application number: CN201910220447.2A
Authority: CN
Inventors: 吴湘; 吴昊; 叶金云; 张荣飞
Original assignee: Huzhou University
Current assignee: Huzhou University
Priority date: 2019-03-22
Filing date: 2019-03-22
Publication date: 2021-11-02
Anticipated expiration: 2039-03-22
Also published as: CN109896638A

Abstract

本发明涉及水污染治理领域，确切地说是微囊藻毒素降解酶在降解节球藻毒素中的应用，所述微囊藻毒素降解酶固定化于经L‑半胱氨酸修饰的氧化石墨烯材料上，步骤为：（1）用1‑（3‑二甲基氨基丙基）‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐和N‑羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐对GO进行活化，然后用L‑Cysteine对活化后的GO进行修饰，得到CysGO溶液；（2）将mlrA酶液加入CysGO溶液中，混合均匀后在0℃下震荡反应60min后得到固定化酶纳米复合材料CysGO‑mlrA溶液，对该溶液用0.22μm的超滤膜过滤，将所得固体物进行水洗、抽滤、干燥后得到固定化酶纳米复合材料CysGO‑mlrA。通过发明人实验发现，微囊藻毒素降解酶对节球藻毒素有较好的降解效果，CysGO‑mlrA和NOD的降解产物对斑马鱼淋巴细胞无明显的细胞毒性。

Description

微囊藻毒素降解酶在降解节球藻毒素中的应用

技术领域

本发明涉及水污染治理领域，确切地说是微囊藻毒素降解酶在降解节球藻毒素中的应用。

背景技术

淡水蓝藻水华过程中产生的蓝藻毒素威胁着水域生态系统的健康。节球藻毒素(Nodularin，NOD) 是由泡沫节球藻(Nodularia spumigena) 产生的一种环五肽毒素，具有严重的肝毒性、基因毒性、胚胎毒性和遗传毒性，能够抑制真核生物磷酸酯酶PP1和PP2A活性，造成胞内蛋白过磷酸化，导致细胞凋亡。同时NOD可以在生物和环境中进行富集和转化。研究发现，NOD可通过食物链最终在比目鱼、鲟鱼、三刺鱼、青鱼和大马哈鱼等体内累积并产生毒性效应，致使鱼类大量死亡。

藻毒素化学性质稳定，藻毒素的生物降解技术，特别是利用微生物产生的专属藻毒素降解酶具有成本低、安全性高、利于生态修复等优点，成为目前藻毒素降解技术研究的热点。一些研究表明：游离态藻毒素降解酶对反应环境条件要求较高，限制了酶降解技术的运用。因此，寻找高效的节球藻毒素去除方法已经成为当前迫切需要解决的问题。

发明内容

本发明目的是克服现有技术的不足，提供一种微囊藻毒素降解酶在降解节球藻毒素中的应用。

本发明解决所述技术问题的技术方案为：

微囊藻毒素降解酶在降解节球藻毒素中的应用。

微囊藻毒素降解酶作为一种微囊藻毒素的特异性降解酶类，一般只具有降解微囊藻毒素的能力。本发明发现了其对节球藻毒素同样具有较高的降解效率。

作为改进，所述微囊藻毒素降解酶固定化于经L-半胱氨酸修饰的氧化石墨烯材料上。

作为进一步改进，所述微囊藻毒素降解酶固定化于经L-半胱氨酸修饰的氧化石墨烯材料上的步骤为：

（1）用1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐对GO进行活化，然后用L-Cysteine对活化后的GO进行修饰，得到CysGO溶液；

（2）将mlrA酶液加入CysGO溶液中，混合均匀后在0℃下震荡反应60min后得到固定化酶纳米复合材料CysGO-mlrA溶液，对该溶液用0.22 μm的超滤膜过滤，将所得固体物进行水洗、抽滤、干燥后得到固定化酶纳米复合材料CysGO-mlrA。

作为改进，所述mlrA酶液的浓度为0.50 μg/μL，体积为10 μL；所述CysGO溶液的浓度为1 μg/μL，体积为50 μL。

作为改进，制备CysGO溶液时，混合液中GO与L-Cysteine的质量比为1:0.17。

作为改进，所述固定化酶纳米复合材料在4℃进行干燥。

本发明的有益效果为：通过发明人实验发现，微囊藻毒素降解酶对节球藻毒素有较好的降解效果，反应1h后能达到80%以上的降解率。将微囊藻毒素固定化于经L-半胱氨酸修饰的氧化石墨烯材料后，降解效率没有明显变化，而且重复使用7次以后，酶的降解效率仍可达到初始降解效率的81%以上。在0℃保存条件下，CysGO-mlrA在第8天仍保持50%以上的活性，但游离态mlrA在第4天就失去了50%的活性。实验还发现：CysGO-mlrA和NOD的降解产物对斑马鱼淋巴细胞无明显的细胞毒性，说明CysGO-mlrA可成为一种高效、生态安全的NOD降解材料。

附图说明

图1为GO的SEM图像

图2为CysGO的SEM图像

图3为CysGO-MlrA的SEM图像

图4为CysGO-MlrA组和free-MlrA 组的 NOD 降解率 (DR)的变化情况以及CysGO组的NOD 吸附率 (AR)的变化情况。

图5为固定化酶和游离酶在不同贮藏时间的相对活性。a和b表示固定化酶与游离态酶之间的差异显著 (p＜0.05)。

图6为固定化酶在不同重复利用次数下的相对活性。

图7为CysGO-mlrA材料的细胞毒性测试中不同处理组对斑马鱼淋巴细胞的细胞凋亡率的变化情况。

图8为CysGO-mlrA材料的细胞毒性测试中不同处理组对斑马鱼淋巴细胞的TNF-α、PGAM5的相对基因表达水平的变化情况。

注意: *表示处理组与空白组结果差异有统计学意义(p<0.05)。**提示处理组与空白组结果差异显著(p<0.01)。

图9为NOD降解产物的毒性测试中不同处理组对斑马鱼淋巴细胞的细胞凋亡率的变化情况。

图10为NOD降解产物的毒性测试中不同处理组对斑马鱼淋巴细胞的TNF-α、PGAM5的相对基因表达水平的变化情况。

图11为不同氧化石墨烯与L-半胱氨酸质量比的条件下固定化酶在不同重复利用次数下的相对活性。

具体实施方式

实施例1

1、材料制备

本申请中，“将微囊藻毒素降解酶固定化于经L-半胱氨酸修饰的氧化石墨烯材料上”的方法部分可以参考专利申请号为“201410170050.4”、发明名称为“一种L-半胱氨酸—氧化石墨烯纳米材料的制备方法”中提供的方法。

具体地，在本申请中，微囊藻毒素降解酶固定化于经L-半胱氨酸修饰的氧化石墨烯材料上的步骤为：

（1）将氧化石墨烯加入纯净水中超声搅拌1h，得到相对均一的氧化石墨烯悬浮液。

（2）在上述氧化石墨烯悬浮液中加入1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐得到混合液，搅拌条件下对氧化石墨烯表面羧基进行活化反应, 活化反应时间为1h；所述混合液中氧化石墨烯、1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐的用量比为10mL：0.2M：0.5M。

（3）将上述活化反应后的混合液中加入L-半胱氨酸，反应12h，然后用0.22um的超滤膜过滤，将所得固体物在-50℃下冷冻干燥，即可制得L-半胱氨酸—氧化石墨烯纳米材料。所述氧化石墨烯悬浮液的浓度为8 mg/mL。所述活化反应后的混合液中氧化石墨烯与L-半胱氨酸质量比为1:0.17。

（4）将mlrA酶液加入CysGO溶液中，mlrA酶液的浓度为0.50 μg/μL，体积为10 μL；CysGO溶液的浓度为1 μg/μL，体积为50 μL。混合均匀后在0℃下震荡反应60min后，得到固定化酶纳米复合材料CysGO-mlrA溶液，测定上清液中蛋白质含量，然后对该溶液用0.22 μm的超滤膜过滤，将所得固体物进行水洗、抽滤、干燥后对得到固定化酶纳米复合材料CysGO-mlrA，干燥温度为4℃。

根据以下公式计算酶的固定效率Immobilized efficiency（IE）。

IE=(m₀-C*V)/m₀×100%

式中：m₀为初始总酶量，取值为5.0 μg。

C为上清液蛋白质含量，单位为10^-3 μg/μL

V为上清液体积，取值60 μL。

实验结果表明：反应60分钟后，CysGO对MlrA的固定效率达到84.36%。说明书附图中，图1为GO的SEM照片；图2为CysGO的SEM照片；图3为CysGO-mlrA的SEM照片。比较图1和图2可见，L-Cysteine已经覆盖在氧化石墨烯表面。比较图2和图3可见，固定化酶后的CysGO上粒子数目明显增多。由上述表征可知，酶分子已经固定在CysGO上。

2、节球藻毒素降解实验

（1）实验方法

在3个液相反应瓶中加入140 μL PBS（pH=7.0），再加入5μL NOD（5μg/ml），分别加入2μL Cys-GO溶液（1 μg/μL）、游离态mlrA溶液（0.1μg/μL）和固定化酶（1 μg/μL）溶液，设置为Cys-GO组、free-mlrA组和CysGO-mlrA组。并设置不在NOD溶液中添加任何藻毒素降解、吸附材料的对照组。在25℃反应0h、0.5h、1h、2h、4h、8h、12h、16h、24h 后测定上清液中NOD浓度。

根据式(2)计算free-MlrA组和CysGO- mlra组的NOD降解率(DR)，以及 CysGO组的NOD吸附率(AR)。

DR (AR)%=(m₀-C×V×10^-3 )/m₀×100% (2)

m₀为NOD的初始总量,其值设置为25×10^-3 μg；C为上清液的NOD浓度；V为上清液的体积,其值设置为147μL。

（2）实验结果

图4为CysGO-mlrA组、free-mlrA组的NOD降解率及CysGO组的NOD吸附率的变化情况。

在实验1h时，CysGO-mlrA组的NOD降解率为83.4%，free-mlrA组的降解率达到88.2%，CysGO组对NOD的吸附率在16h时达到49.0%。实验结果表明CysGO-mlrA组与free-mlrA组对NOD的降解效果相差不大，反应1h均能达到较好的降解效果。

3、固定化技术对酶活性的影响

（1）实验方法

在0°C环境下储存游离态酶和固定化酶。每天取一定量的游离态酶和固定化酶进行节球藻毒素降解试验。节球藻毒素降解率越高，表明酶活性越高。整个实验过程中NOD降解率最高的那组定义酶活性为100%。将其他时间点的酶活性与之进行比较，根据公式(3)计算酶的相对活性。同时开展固定化酶的重复使用实验。固定化酶在第一次NOD降解试验后洗涤干燥，然后加入等量的NOD进行后续降解试验。并重复这些步骤。将实验中NOD降解速率最高时的酶活性定义为100%，并将后续实验的酶活性与之进行比较，根据公式(3)计算出酶的相对活性。

RA%= (DR_Test/DR_Max)×100% (3)

其中DR_Test为一次实验中NOD降解速率；DR_Max是实验过程中最高的NOD降解速率。

（2）实验结果

图5所示，游离酶在第4天，活性已经下降到至初始活性的50%以下。而固定化酶在第8天的时候，活性仍在50%以上。这表明载体对酶的保存起到了重要作用，其储存性能得到了一定程度的提高。

图6所示，在固定化酶重复使用7次以后，酶的降解效率仍可达到初始降解效率的81%以上，体现了该固定化酶具有较好的重复使用性。

需要着重指出的是：专利申请号为“201410170050.4”发明创造中，其在3个实施例中，均将活化反应后的混合液中氧化石墨烯与L-半胱氨酸质量比限定为1:0.10。本申请的发明人经实验发现：如果将活化反应后的混合液中氧化石墨烯与L-半胱氨酸质量比调整为1:0.17，可以增加固定化酶纳米复合材料CysGO-mlrA的重复利用次数。实验结果表明：当活化反应后的混合液中氧化石墨烯与L-半胱氨酸质量比调整为1:0.17，在固定化酶重复使用7次以后，酶的降解效率仍可达到初始降解效率的81%以上；但是质量比为1:0.1时，在固定化酶重复使用5次以后，酶的降解效率已经低于初始降解效率的80%。具体如图11所示。

4、 CysGO-mlrA材料的细胞毒性测试

（1）实验方法

将GO、CysGO和CysGO-mlrA配置成浓度为0.5μg/μL的溶液各2μl加入到斑马鱼淋巴细胞溶液(1×10⁶ cells/mL)中，分别设置为GO组、CysGO组和CysGO-mlrA组。同时设置不向斑马鱼淋巴细胞溶液添加任何物质的空白组。分别在培养0.5h, 1h, 3h, 6h and 12h后测定淋巴细胞凋亡率，并在培养12h后测定淋巴细胞内TNF-α和PGAM5基因表达量的变化情况。空白组的基因表达水平TNF-α和PGAM5作为参照值“1”, 其余组计算相对值。

（2）实验结果

图7所示，GO组淋巴细胞凋亡率最高，在6h时间达到了38.5%。CysGO和CysGO-mlrA组的淋巴细胞凋亡率相差不大，实验3h分别为10.1%和10.4%，远低于GO组。图8所示，实验12h时，CysGO和CysGO-mlrA的淋巴细胞TNF-α的mRNA表达量差异不显著，略低于空白组5%左右。GO组的TNF-α的mRNA表达量明显下降（p＜0.01），和空白组相比下降了39%。GO组的斑马鱼淋巴细胞内PGAM5的基因表达量约为CysGO-mlrA组的6倍，差异性极显著（p＜0.01）。CysGO-mlrA组与空白组之间的差异不显著。

5、 NOD降解产物的毒性测试

（1）实验方法

提取节球藻毒素降解实验中的5μg/ml NOD以及CysGO-MlrA组的上清液各2μl，并通过测定CysGO-MlrA组上清液中的NOD浓度配置与之相同浓度的纯NOD溶液2 μl。将上述3种溶液各自加入到斑马鱼淋巴细胞溶液(1×10⁶ cells/mL)中，分别设置为NOD组、降解组和对照组。同时设置不向斑马鱼淋巴细胞溶液添加任何物质的空白组。分别在培养0.5h,1h, 3h, 6h and 12h后测定淋巴细胞凋亡率，并在培养12h后测定淋巴细胞内TNF-α和PGAM5基因表达量的变化情况。空白组的基因表达水平TNF-α和PGAM5作为参照值“1”, 其余组计算相对值。

（2）实验结果

根据图9，初始浓度组淋巴细胞凋亡率最高，在实验3h时达到了68.9%。降解组和对照组的淋巴细胞凋亡率相差不大，在实验3h时分别为22.7%和20.2%，远低于初始浓度组。并节球藻毒素降解实验结果可知，随着NOD浓度的增加，淋巴细胞凋亡率随之上升。根据图10，实验12h时，降解组和对照组的淋巴细胞TNF-α的mRNA表达量差异不明显，但低于空白组8%左右。初始浓度组的TNF-α的mRNA表达量明显下降（p＜0.01），和空白组相比下降了44%。初始浓度组斑马鱼淋巴细胞内PGAM5的基因表达量约为降解组的8倍，差异性极显著（p＜0.01）。降解组和对照组的淋巴细胞TNF-α的mRNA表达量差异不明显。

Claims

1.微囊藻毒素降解酶在降解节球藻毒素中的应用，其特征在于：所述微囊藻毒素降解酶固定化于经L-半胱氨酸修饰的氧化石墨烯材料上，微囊藻毒素降解酶固定化于经L-半胱氨酸修饰的氧化石墨烯材料上的步骤为：

（1）用1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐对GO进行活化，然后用L-Cysteine对活化后的GO进行修饰，混合液中GO与L-Cysteine的质量比为1:0.17，得到CysGO溶液；

2.根据权利要求1所述的微囊藻毒素降解酶在降解节球藻毒素中的应用，其特征在于：所述mlrA酶液的浓度为0.50 mg/mL，体积为10 μL；所述CysGO溶液的浓度为1 mg/mL，体积为50 μL。

3.根据权利要求1所述的微囊藻毒素降解酶在降解节球藻毒素中的应用，其特征在于：所述固定化材料在4℃进行干燥。