CN114250175A - 一种嗜芳烃新鞘氨醇菌、菌体制剂、胞内酶制剂及其在降解微囊藻毒素中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种嗜芳烃新鞘氨醇菌、菌体制剂、胞内酶制剂及其在降解微囊藻毒素中的应用。嗜芳烃新鞘氨醇菌P6D9，分类命名为Novosphingobium aromaticivorans P6D9，菌种保藏编号是CCTCC NO:M 20211126。在受MC‑LR污染的水体、土壤等其它生态环境中直接加入适量该菌剂或酶制剂，可快速去除高达99％的MC‑LR，从而保障人类和动植物的安全。

Description

一种嗜芳烃新鞘氨醇菌、菌体制剂、胞内酶制剂及其在降解微 囊藻毒素中的应用
技术领域
本发明属于微生物及其应用技术领域，具体涉及一种嗜芳烃新鞘氨醇菌、微生物制剂(菌体制剂、胞内酶制剂)及其在降解微囊藻毒素细菌中的应用。
背景技术
随着我国工农业和旅游业的不断发展，再加上全球气候变暖，我国的水体正承受着前所未有的营养盐负荷，各种形式的外源和内源氮磷等营养盐不断地通过各种方式进入水体，致使全国各地的湖泊以及养殖水体富营养化程度越来越严重，蓝藻水华问题日益严峻，其中太湖、滇池、巢湖三大湖泊是我国典型的富营养化湖泊。水体富营养化的一个典型特征就是蓝藻水华频繁，而水华蓝藻会产生一系列的生物毒素，其中最常见、危害较大的是一种称为微囊藻毒素(Microcystins；MCs)的生物毒素。微囊藻毒素是一种单环七肽肝毒素，分子量在900-1100道尔顿，具有损伤肝脏、肾脏等多个器官特性并能致癌，对动物及人类健康造成极大的危害。人们长期饮用含MCs的水和摄食受MCs污染的动物产品均可导致肝癌的发生。目前已发现超过100种不同类型的MCs，其中毒性最强、在自然水体中最常见的MCs是MC-LR(L和R分别代表亮氨酸和精氨酸，位于环状七肽的2号和4号位)，因此，世界卫生组织WHO规定了饮用水中MC-LR的限量标准为1μg/L。
MCs具有极强的毒性以及稳定的理化性质引起了世界范围内科学家的广泛关注，因此，寻求有效的处理方法以保证饮用水安全是一个亟待解决的问题。目前水体中去除MCs的方法主要有物理、化学和生物方法。但是物理方法只能去除一部分细胞内的毒素，对胞外毒素消除基本没有效果，还会破坏藻细胞而促使毒素的释放；化学方法具有成本高且容易产生二次污染等问题，而生物方法安全性高、对性强、对生态环境还具有很强的修复作用等优势，具有良好的发展利用前景。
近年来，已从各种水体、淤泥、藻泥、土壤等微囊藻毒素污染严重的环境中分离出多种可降解MC-LR的微生物，包括鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas spp.)、假单胞菌(Pseudomonas spp.)、伯克霍尔氏菌(Burkholderia)、气单胞菌(Aeromonas spp.)、芽胞杆菌(Bacillus spp.)等，其中鞘氨醇单胞菌是目前分离数量最多降解能力相对较强的菌种。不同的微生物种类具有的MC-LR降解途径不尽相同，为了更多地了解MC-LR的降解途径，不断分离获得高效降解MC-LR的新菌种，丰富MC-LR降解菌资源库是很有必要的，这对更深入地研究MC-LR的生物降解途径，探索环境中微囊藻毒素污染治理手段和方法具有重要意义。
发明内容
本发明提供了一种嗜芳烃新鞘氨醇菌P6D9，分类命名为Novosphingobiumaromaticivorans P6D9，保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，菌种保藏编号是CCTCC NO:M 20211126，保藏日期是2021年09月01日。其16SrDNA基因序列由1481个碱基(bp)组成(由南昌生物科创科技有限公司完成)，基因序列具体如下：
CTTGAGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCTGGCGGCATGCCTAACACATGCAAGTCGAACGAACCCTTCGGGGTTAGTGGCGCACGGGTGCGTAACGCGTGGGAATCTGCCCTTTGCTTCGGAATAACAGTTAGAAATGACTGCTAATACCGGATGATGTCTTCGGACCAAAGATTTATCGGCAAGGGATGAGCCCGCGTAGGATTAGGTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGCCGACGATCCTTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCTTCGGGTCGTAAAGCTCTTTTACCAGGGATGATAATGACAGTACCTGGAGAATAAGCTCCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGAGCTAGCGTTGTTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGCTACTCAAGTCAGAGGTGAAAGCCCGGGGCTCAACCCCGGAACTGCCTTTGAAACTAGGTAGCTGGAATCTTGGAGAGGTCAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTGACTGGACAAGTATTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGATAACTAGCTGTCCGGTCACTTGGTGATTGGGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTATCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCTGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCAGCGTTTGACATCCCGCGCTACTTCCAGAGATGGAAGGTTCCCTTCGGGGACGCGGTGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGTCCTTAGTTGCCATCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGAAACCGCCGGTGATAAGCCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTACACGCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGGTGACAGTGGGCAGCAAGCACGCGAGTGTGAGCTAATCTCCAAAAGCCGTCTCAGTTCGGATTGTTCTCTGCAACTCGAGAGCATGAAGGCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCAGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTGGGTTCACCCGAAGGCGTTGCGCTAACTCGCAAGAGAGGCAGGCGACCACGGTGGGCTTAGCGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTAGGGGAACCTGCGGCTGGATCACCTCCTTT。
将获得的P6D9菌株的基于31个看家基因(dnaG,frr,infC,nusA,pgk,pyrG,rplA,rplB,rplC,rplD,rplE,rplF,rplK,rplL,rplM,rplN,rplP,rplS,rplT,rpmA,rpoB,rpsB,rpsC,rpsE,rpsI,rpsJ,rpsK,rpsM,rpsS,smpB,tsf)选择在种属水平上最接近的19株菌，通过MEGA 6.0软件选择NJ(Neighbor-Joining)法构建系统进化树(如图3)，发现：该菌株与Novosphingobium亲缘关系接近。
本发明的嗜芳烃新鞘氨醇菌P6D9在营养琼脂培养基平板上单细胞繁殖生长形成的菌落呈圆形，边缘整齐，表面光滑凸起，为淡黄色菌落(如图1所示)；革兰氏染色呈阴性、杆状(如图2所示)。所述嗜芳烃新鞘氨醇菌P6D9在其他含有碳氮源且能够满足微生物基本生长需求的培养基上均能生长，例如，LB和BHI培养基。营养琼脂培养基的配方为：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂15g，1L水，pH 7.4。LB培养基的配方为：酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，氯化钠10g，琼脂15g，1L水，pH 7.0。BHI培养基的配方为：蛋白胨10.0g，脱水小牛脑浸粉12.5g，脱水牛心浸粉5g，氯化钠5g，葡萄糖2g，磷酸氢二钠2.5g，pH值7.4。
本发明还提供上述嗜芳烃新鞘氨醇菌P6D9在降解微囊藻毒素(MCs)中的应用。优选地，所述MCs为MC-LR。
本发明还提供上述嗜芳烃新鞘氨醇菌P6D9在制备降解MCs的微生物制剂中的应用。优选地，所述微生物制剂为嗜芳烃新鞘氨醇菌P6D9的菌体菌剂或为嗜芳烃新鞘氨醇菌P6D9的酶制剂。
例如，所述菌体制剂为液体菌剂或冻干粉菌剂。
例如，所述酶制剂为嗜芳烃新鞘氨醇菌P6D9的胞内酶制剂。
本发明还提供上述嗜芳烃新鞘氨醇菌P6D9的菌体制剂的制备方法，包括如下步骤：
将嗜芳烃新鞘氨醇菌P6D9菌种子液按0.5-1.5％(例如1％)接种量接种于液体培养基中，培养后离心得到菌体；将清洗后的菌体重悬于MSM液体培养基中或者加入保护剂后冻干，得到所述菌体制剂。
根据本发明的实施方案，所述嗜芳烃新鞘氨醇菌P6D9菌种子液的制备过程包括：从斜面挑取一环已活化(例如，活化过程包括：将嗜芳烃新鞘氨醇菌P6D9菌种通过接种环划线接种于营养琼脂斜面或平板上，37℃下培养18-24h后进行活化)的嗜芳烃新鞘氨醇菌P6D9菌体，接种于含35-35mL(例如30mL)脑心浸出液肉汤(BHI)的三角瓶中，37℃下培养18-24h后，所得到的液体培养物即为所述嗜芳烃新鞘氨醇菌P6D9菌种子液。
根据本发明的实施方案，所述液体培养基为上述脑心浸出液肉汤培养基或其他含有碳氮源能够满足微生物基本生长需求的培养基。进一步地，所述液体培养基经121±2℃高压灭菌15±2分钟，例如经121℃高压灭菌15分钟。
根据本发明的实施方案，在所述液体培养基中的培养条件为：30±1℃，150±5转/分钟条件下培养18±2小时，例如30℃，150转/分钟条件下培养18±2小时。
根据本发明的实施方案，所述离心的条件为：12000转/分高速离心10分钟。
根据本发明的实施方案，清洗菌体的溶液为0.85％的NaCl溶液，清洗至少两遍。
根据本发明的实施方案，以重量份计，所述MSM液体培养基的配方包括：MgSO4·7H2O 40-60份，KH2PO4 40-60份，K2HPO4 40-60份，NaCl 40-60份，FeSO4·7H2O 1份，CaCl2 1-3份；添加MC-LR，MC-LR在MSM液体培养基中的终浓度为80-130μg/L(例如约为100μg/L)，pH值调至6.5左右。
优选地，以重量份计，所述MSM液体培养基的配方包括：MgSO4·7H2O 50份，KH2PO450份，K2HPO4 50份，NaCl 50份，FeSO4·7H2O 1份，CaCl2 2份；添加MC-LR，MC-LR在MSM液体培养基中的终浓度约为100μg/L，pH值调至6.5左右。
示例性地，所述MSM液体培养基的配方包括：MgSO4·7H2O 0.5g，KH2PO4 0.5g，K2HPO4 0.5g，NaCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，CaCl2 0.02g；添加MC-LR，MC-LR在MSM液体培养基中的终浓度约为100μg/L，pH值调至6.5左右。进一步地，所述MSM液体培养基需在121±2℃，灭菌15±2分钟。
MC-LR作为MSM液体培养基的唯一性碳氮源，可限制其他不可利用MC-LR的微生物的生长。
本发明菌剂常温下可放置半年以上。
本发明还提供上述一种嗜芳烃新鞘氨醇菌P6D9的菌体制剂，所述菌体制剂包括MSM液体培养基和嗜芳烃新鞘氨醇菌P6D9菌株。
优选地，所述菌体制剂由上述方法制备得到。
本发明还提供一种嗜芳烃新鞘氨醇菌P6D9的酶制剂的制备方法，包括如下步骤：
对嗜芳烃新鞘氨醇菌P6D9菌种子液进行离心，得到菌体和细菌培养上清液，将清洗后的菌体重悬于原菌液8-15vt％(例如10vt％)体积的生理盐水中，立即冰浴，在冰浴环境中进行超声波破碎，细胞破碎结束后，离心，得到的上清液为所述嗜芳烃新鞘氨醇菌P6D9的胞内酶液，即为酶制剂，低温保存备用。
根据本发明的实施方案，所述嗜芳烃新鞘氨醇菌P6D9菌种子液具有如上文所示的含义。
根据本发明的实施方案，对所述嗜芳烃新鞘氨醇菌P6D9菌种子液离心的操作包括：12000转/分离心10分钟。
根据本发明的实施方案，清洗用的溶液为生理盐水。
根据本发明的实施方案，所述超声波破碎的条件为：功率300W，间隔10秒，超声振荡6秒；优选地，所述超声波破碎的时间为20分钟。
根据本发明的实施方案，所述离心的条件为：15000转/分钟，4℃温度下离心10分钟。
根据本发明的实施方案，所述低温为超低温，例如-80℃。
本发明还提供由上述方法制备得到的嗜芳烃新鞘氨醇菌P6D9的胞内酶液。
本发明还提供一种降解MCs的方法或处理MCs污染的方法，包括如下步骤：将上述微生物制剂投入到MC-LR污染的水体或其它生态环境中。
优选地，所述水体为轻度到重度污染水体。例如，所述其它生态环境可以为土壤等生态环境。
有益效果
利用本发明提供的嗜芳烃新鞘氨醇菌P6D9的酶制剂或菌体制剂对环境中微囊藻毒素进行去除降解，在污染轻度至重度的水体、土壤等其它生态环境中直接加入该微生物制剂，可快速去除高达99％的MC-LR，从而保障人类和动植物的安全。
本发明提供的嗜芳烃新鞘氨醇菌P6D9菌株来源于水质优良的淡水水域，对微囊藻毒素降解速度快，效率高，是水域生态环境中的原位菌株，不会对环境微生物群落结构造成破坏，且该菌株营养需求简单，生存能力强，在营养贫乏的环境中保存半年以上仍可存活。且投入的菌剂本身来源于健康水体生态环境，容易在环境中定植，有利于改良污染水体的微生态平衡，且营养需求简单，能长期在该生态环境中保持活性、长期稳定存在，对所在环境中微囊藻毒素污染可起到持续实时调控作用，使该生态环境持续保持良好状态。故，将本发明的菌株或其微生物制剂应用到微囊藻毒素污染较严重的水体或其它生态环境中可能更能有效和持久地发挥作用。
本发明中，P6D9菌株为嗜芳烃新鞘氨醇菌P6D9菌株的简写。
附图说明
图1为嗜芳烃新鞘氨醇菌P6D9菌株在普通营养琼脂培养基上的生长菌落图。
图2为嗜芳烃新鞘氨醇菌P6D9菌革兰氏染色图；显示菌株呈革兰氏阴性，杆状。
图3为嗜芳烃新鞘氨醇菌P6D9菌株基于16S rRNA的系统发育树。
图4为南昌县澄碧湖湖水(未检测出MC-LR)中加入MC-LR标准物质后(MC-LR终浓度分别约为260μg/L和25μg/L)，P6D9菌体制剂及其酶制剂对自然水体中MC-LR的降解反应图；其中，
B100：表示直接加入MC-LR后终浓度约260μg/L的自然水体；
B10：表示直接加入MC-LR后终浓度约25μg/L的自然水体；
J：表示模拟污染水体中单独加入菌体制剂；
M：表示模拟污染水体中单独加入酶制剂；
H：表示模拟污染水体中同时加入菌体制剂和酶制剂；
CK：表示模拟污染水体中不加入任何制剂。
图5为南昌县澄碧湖湖水(未检测出MC-LR)中加入蓝藻细胞破碎滤液后(MC-LR终浓度分别为20μg/L和3μg/L)，P6D9菌体制剂及其酶制剂对自然水体中MC-LR的降解反应图；其中，
Z100：表示加入蓝藻粗提物后MC-LR终浓度约20μg/L的自然水体；
Z10：表示加入蓝藻粗提物后MC-LR后终浓度约3μg/L的自然水体；
J：表示模拟污染水体中单独加入菌体制剂；
M：表示模拟污染水体中单独加入酶制剂；
H：表示模拟污染水体中同时加入菌体制剂和酶制剂；
CK：表示模拟污染水体中不加入任何制剂。
图6为嗜芳烃新鞘氨醇菌P6D9菌株在10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃温度下完全降解100μg/L MC-LR所需时间。
图7为嗜芳烃新鞘氨醇菌P6D9菌株不同初始浓度对MC-LR降解速率关系图。
具体实施方式
本发明从水质较好的鄱阳湖底泥中分离到一种嗜芳烃新鞘氨醇菌P6D9菌株，筛选方法步骤如下：
(1)在鄱阳湖18个点采集18份底泥，每份底泥按1:1(底泥:无菌生理盐水)进行摇匀，静止30min，得到上清液；
(2)取上清液按1％比例接入100mL含有100μg/L MC-LR的MSM培养液中，25℃，200r/min培养7天；
(3)每天取样进行MC-LR含量测定，记录MC-LR的降解情况，如表1所示；
(4)取最先完全降解MC-LR的底泥进行富集培养，依次按1％的比例接种至含500μg/L、1mg/L、5mg/L、10mg/L和20mg/L MC-LR的MSM培养液中，每个浓度培养2天；
(5)将步骤(4)富集培养后的培养液梯度稀释后涂布于营养琼脂平板上，36℃培养24h后，获得均匀分布的单菌落；
(6)将平板上的所有单菌落采用二分法进行蓝藻毒素混合降解试验：将平板上的菌落分成两部分，每部分的菌落混合接种至一份含有100μg/L MC-LR的MSM培养液中，30℃，培养2天，每12h取样测定其中MC-LR含量；
(7)将MC-LR降解速率最快的混合菌液中的菌株继续按照(6)进行混合降解试验，直至筛选出微囊藻毒素降解效率最高的单个菌株；
(8)将该菌株在营养琼脂平板上纯化3次并进行MC-LR降解试验，获得一株微囊藻毒素高效降解菌株P6D9。
表1 鄱阳湖18个采样点底泥对MC-LR的降解(μg/L)
Figure BDA0003411099410000091
本发明从水质较好的鄱阳湖底泥中分离到该菌株，说明水质好的环境中蕴藏着丰富的具有能降解各种污染物的资源菌种，正是有了这些超强功能微生物的存在，才保障了该生态环境的超强自净能力，使环境持续保持良好状态，因此将此类资源菌应用到微囊藻毒素污染较严重的水体或其它生态环境中更能有效和持久地发挥作用。
嗜芳烃新鞘氨醇菌P6D9的生理生化特征如表2所示。
表2 嗜芳烃新鞘氨醇菌P6D9的生理生化特征
试验项目 结果 试验项目 结果 试验项目 结果
鸟氨酸脱羧酶 阴性 精氨酸双水解酶 阴性 赖氨酸脱羧酶 阴性
脲酶 阴性 L-阿拉伯糖醇 阴性 半乳糖酸盐 阴性
5-酮基-葡萄糖酸钠 阴性 脂肪酶 阳性 酚红 阴性
β葡萄甙糖 阳性 甘露醇 阴性 麦芽糖 阳性
侧金盏花醇 阴性 β葡萄糖酸酶 阳性 丙二酸 阴性
吲哚产生 阴性 N-乙酰-β葡萄甙糖 阴性 β-半乳糖甙酶 阳性
葡萄糖 阳性 蔗糖 阳性 L-阿拉伯糖 阴性
D-阿拉伯糖醇 阴性 α-葡萄糖 阳性 α-半乳糖甙酶 阳性
海藻糖 阴性 鼠李糖 阳性 肌醇 阴性
纤维二糖 阴性 山梨醇 阴性 α-麦芽糖甙酶 阳性
L-天门冬素芳胺酶 阳性 N-乙酰葡萄糖胺 阳性 D-核糖 阴性
衣康酸 阴性 辛二酸盐 阳性 丙二酸盐 阴性
乙酸盐 阴性 DL-乳酸盐 阴性 L-丙氨酸 阴性
糖原 阳性 3-羟基-苯甲酸盐 阴性 L-丝氨酸 阴性
水杨素 阴性 D-蜜二糖 阴性 L-岩藻糖 阳性
丙酸盐 阴性 癸酸盐 阴性 戊酸盐 阳性
柠檬酸盐 阴性 组酸盐 阴性 2-酮葡萄糖酸盐 阴性
3-羟基-丁酸盐 阳性 4-羟基-苯甲酸盐 阳性 L-脯氨酸 阳性
下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。
实施例1嗜芳烃新鞘氨醇菌P6D9菌株的菌剂及其制备方法
(1)配制液体培养基，其组分为普通营养肉汤培养基(每升)：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，pH7.4，或其他含有碳氮源能够满足微生物基本生长需求的培养基，121℃高压灭菌15分钟；
(2)制备保存P6D9菌体的MSM培养基：MgSO4·7H2O 0.5g，KH2PO4 0.5g，K2HPO40.5g，NaCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，CaCl2 0.02g，添加MC-LR(使培养液中MC-LR终浓度约为100μg/L)，pH值调至6.5左右，121℃，灭菌15分钟。
(3)将嗜芳烃新鞘氨醇菌P6D9菌种子液(从已活化的菌种营养琼脂斜面或平板上挑取一环菌体接种于含30mL BHI肉汤的三角瓶中培养20h±2h后，所得的液体培养物)按1％接种量接种于制备菌剂的液体培养基中，30℃，150转/分钟条件下培养(18±2)小时后，高速离心(12000转/分)10分钟收获菌体，用0.85％的NaCl溶液清洗两遍后重悬于步骤(2)制备的MSM培养液中，分装于菌种保藏管中，用封口胶封口后备用，常温下可保存半年以上。
实施例2嗜芳烃新鞘氨醇菌P6D9菌株的酶制剂及其制备方法
将嗜芳烃新鞘氨醇菌P6D9菌种子液(从已活化的菌种营养琼脂斜面或平板上挑取一环菌体接种于含30mLBHI肉汤的三角瓶中培养20h±2h后，所得的液体培养物)按1％接种量接种于扩大营养肉汤中，30℃，150转/分钟条件下培养(18±2)小时后，高速离心(12000转/分)10分钟收获菌体和细菌培养上清液，用生理盐水溶液清洗菌体两遍后重悬于原菌液体积10％体积的生理盐水中，立即冰浴，在冰浴环境中进行超声波破碎，超声波破碎条件：功率300W，间隔10秒，超声振荡6秒，破碎时间20分钟。细胞破碎结束后，15000转/分钟，4℃温度下离心10分钟后，获取上清液，得到P6D9菌株胞内酶液(即酶制剂)，-80℃超低温保存。
实施例3添加MC-LR模拟MC-LR污染水体中微囊藻毒素的去除效果
在水质较好未发生蓝藻水华的澄碧湖(位于江西省南昌县)采集水样，未检测到其中含有MC-LR。往两份水样中直接添加MC-LR标准物质，使水体中MC-LR含量分别约为260μg/L和25μg/L，模拟水华污染水体。
组(1)将实施例1中的菌剂均匀撒布在两份模拟水体中，使添加菌体在水中浓度约为105个细菌/mL。
组(2)将实施例2中的酶制剂按每升水中10mL的用量加入两份模拟水体中。
组(3)将实施例1的菌体制剂和实施例2的酶制剂同时分别加入两份模拟水体中，使水中菌体浓度约105个细菌/mL，酶制剂按每升水5mL的用量加入。
间隔一定时间取样，测定水体中MC-LR浓度的变化。结果发现对于浓度为260μg/L的MC-LR，如图4中B所示，实施例1的菌体制剂在6h内将MC-LR清除到安全限量值(2μg/L)以下，10h内能完全降解，酶制剂单独作用时效果比较缓慢，但22h内也就能降解水中超过90％的MC-LR，46h内能全部清除。当酶制剂与菌制剂联合使用时，对MC-LR的降解速度明显提升，3h内就可将MC-LR全部降解。而对于浓度约25μg/L的MC-LR，如图4中A所示，实施例1的菌体制剂单独使用时，6h内能清除99％以上的MC-LR，使其浓度远远低于2μg/L的安全限量值，酶制剂单独使用时，在6h内能清除55％以上的MC-LR，22h内能降解MC-LR至安全限量值(2μg/L)以下，当酶制剂和菌体制剂联合使用时，效果提升显著，3h内就能完全清除MC-LR。
实施例4添加蓝藻粗提MC-LR模拟的水华污染水体中微囊藻毒素的去除效果
在水质较好未发生蓝藻水华的澄碧湖(位于江西省南昌县)采集水样，未检测到其中含有MC-LR。往该水样中添加蓝藻粗提物，使水体中MC-LR含量分别约为20μg/L和3μg/L，模拟水华污染水体。
组(1)将实施例1中的菌剂均匀撒布在两份模拟水体中，使添加菌体在水中浓度约为105个细菌/mL。
组(2)将实施例2中的酶制剂按每升水中10mL的用量加入两份模拟水体中。
组(3)将实施例1的菌体制剂和实施例2的酶制剂同时分别加入两份模拟水体中，使水中菌体浓度约105个细菌/mL，酶制剂按每升水5mL的用量加入。
间隔一定时间取样，测定水体中MC-LR浓度的变化。结果发现对于浓度为20μg/L的MC-LR，如图5中A所示，实施例1菌体制剂在10h内能降解约45％，22h内能完全降解，实施例2胞内酶制剂单独作用时能在6h内就能降解约45％MC-LR，10h内能降解63％以上的MC-LR，当酶制剂与菌制剂联合使用时，对MC-LR的降解速度明显提升，6h内降解约53％的MC-LR，10h内能降解超过85％的MC-LR。而对于低浓度的MC-LR(约3μg/L)，如图5中的B所示，实施例1菌体制剂单独使用时，在3h内能清除95％以上的MC-LR，实施例2酶制剂单独使用时，在6h内也能将MC-LR清除到安全限量值(2μg/L)以下，而酶制剂和菌体制剂联合使用时，在3h内就能完全清除MC-LR。
以上实施例3和实施例4结果均显示P6D9菌株对于复杂或简单的MC-LR污染水体均有很强的MC-LR清理能力。虽然酶制剂单独使用时，效果并不比菌体制剂单独使用时好，但却能与菌体制剂联合使用，能大大提升菌体制剂的使用效果。
图6显示在200mL含有约100μg/LMC-LR的MSM液体中，加入P6D9菌剂，使水中菌体浓度约105个细菌/mL，在不同温度下的菌株对MC-LR的降解速率，结果显示菌株在15℃-30℃温度下降解活力最高。在低温10℃和高温40℃条件下虽降解速度稍慢，但到第44h和36h均能全部降解MC-LR，这说明该菌株适温范围广，环境适应性强。CK代表不加入降解菌时，30℃条件下MC-LR的浓度变化。
图7显示在200mL含有约100μg/LMC-LR的MSM液体中，加入不同剂量的P6D9菌剂，在30℃下测量菌株对MC-LR的降解速率，结果显示菌株在水体中不同的初始浓度对藻毒素的降解速度有显著影响。菌株浓度越高，对MC-LR的降解越快，菌株浓度越低，全部降解MC-LR所需时间越长。
微囊藻毒素降解相关基因序列如下：
mlrA:
ATGCGGGAGTTTGTCCGACAGCGGCCTTTGCTGTGCTTCTATGTGTTGGCGATACTGATCGCTCTCGCGGCCCATGCGCTACGCGCGATGAGCCCGACGCCGCTCGACCCGATGTTCAAGATGCTGCAGGAGACGCACGCTCACCTCAACATTATTACCGCTGTCAGGTCTACGTTCGAGTATCCGGGAGCCTATACGCTCTTACTGTTTCCGGCCGCCCCAATGTTCGCGGCCCTGATCGCAACCGGGATCGGCTATGGGCAAGCAGGATTTCGTGAACTGCTCAGCCGCTGCGCCCCGTGGCGGTCGCCTGTTTCCTGGCGTCAGGGCGTTACTGTCATAGCCGTGTGTTTCCTTGCATTCTTCGCGCTCACAGGAATCATGTGGGTTCAGACATACCTCTACGCTCCGCCTGGTACGCTTGATCGTACCTTCCTGCGCTATGGGTCAGATCCGGTCGCCATTTATGTGATGCTGGCAGCATCGCTGCTACTCAGCCCTGGCCCGCTGCTGGAAGAACTGGGCTGGCGCGGCTTTGCGCTGCCGCAGCTCCTCAAGAAGTTTGACCCCCTTACCGCAGCGGTGATCCTCGGCATCATGTGGTGGGCCTGGCATTTGCCACGCGACCTGCCAACACTGTTCTCCGGCGCCCCTGGCGCGGCCTGGAGCGTTATTGTCAAACAACTCGTCATCGCTCCTGGGTTCATTGCGAGCACCATCATCGCTGTCTTCGTATGCAACAAGCTCGGTGGATCAATGTGGGGGGGCGTGCTCACTCACGCCATCCATAACGAGCTGGGAGTAAACGTCACTGCCGAATGGGCCCCAACGGTCGCAGGCATCGGGTGGCGCCCATGGGATCTCATCGAATTTGCCGTGGCCATTGGACTCGTCCTGATTTGTGGGAGGAGCCTTGGTGCCGCATCTCCTGACAATGCGCGTTTGGCCTGGGGCAACGTGCCGCCAAAGCTTCCGGGCGGAGTGGGTGACAAGTCCGGCTCGAACGCGTGA
上述序列由1011个碱基(bp)组成。
mlrB:
ATGACTGCAACAAAGCTTTTCCTGGCGCTGACAGCCGCAATCCCAATGGCGACTTCCCATGTCGATCCGAAGGAGCTCGATGCGGTATTTGCTGATATCCGGCCGGATCAACCGGGCTGCGCCTATGCTGTGGATCTGCGCGGCAAGGTTCTCTATCAGGGCGGCTTTGGACTTGCTGATCTAGCCACCCGCGAGCCGATCACACCCGCAACACGCTTCGAACTGGCGTCAACATCGAAGCAGTTCACGGCCGCTCTTATCCTGATCTTGGCACAGGAACGCCAACTTAAATTGGCGGCATCTATCCGCACCTATCTGCCTGACCTCCCTAAGGTCTACGATCCGGTTACGGTCGCGGACTTGTTGCACCACACCAGTGGCATTCGCGAGTATTTCGATGCATTCAGGGCACGCGGAGACGATGAGAGCAAACCCCATTCCCGCGAGGAAGTGCTGGCCTTCGTCAAGGCGCAACGCGGACTCGACGGCCCACCTGGCCGTCGTTTTTCCTACGTTAACACCAATTACTTCCTGCTCGCAGAAATCGTGGAACGCCTAACCGGAAAGTCATTTCCGGATGCTGCGCGGGAACGGCTCTTCAAGCCGGCGGGCATGACGGAAACTCGCGCAACGCTTGATACGACCAGTCTCATTGCAGGTGACGCGCGCGGCTATCAAATCGACAAGAACGGTAGCTTTGTCTCCGCAGCCTGGGCCTGGCAAGGCTATGGCGACCGCGGCGTGCGGACTACTGTTGGCGATCTTGCTCTTTGGCATGGTGCATCGCTCGCGGCGACAACCGGCGGTCAGGCGCTCGAAGTGGCGCGCCTCGCGAACGGGAAACTGCATTCTGGCAGACCTGTCGATTATGCCGGTGGGTTGTTCGTGGATGATCGGCAAAGCGAGCGTGTTGTGTCGCATTCGGGCTTGGTTGTGGGCAATCGCGCCATGGACGTACTTTATCCGGAGAGCGGGATTGGTATCAGCGTGATGTGTAATCGCGACGATATCTCGCCAGCTGAGCGTGCGCGCAAAATTGCTTTGCTCGTGAAGCCCGGGGCGCCCGATCCAGCTTTTGACCGCGCAATTGATCCTGCCGAAATGAAACGCCTGGGAAAAGTTGGCGACCTGCGCTCCGCGCCTGATGGCTATTATCGCGATCCCTTGTATGGACAGTATCTCATCGTCGCTCACCGTGACGGTGAGCCGATTGTCAGCTACAATATGCGAGCTGAGAAAGTGACGCGCCGCCAGGACGGCATCTACCGCGCGCGCCGAGGTGTTCTGCTGAGCTATGCAGTCATACAGAGTGGAATCAAGCGCGTCGTTCAGTGGACTGAGAGTGGACCAATACCGTACCAATATGTTGGAACTGGCGCACCTGAAACCAAATTGTTTTGGCCCGGACAATATCGCAGCGATGAGCTTGGTATTACCGTAACCCTGTCACGGGATCAGAAGGGATGGTTGCTCGATACTCCGGCAGGTGCGGTGCCGTTAGCTGCTGCGATGGCAGATGACCTTGTGGGCCCGAACGCCGCATTTTCATTACATGCTGTTGGTCCTCAAATCTTTACATTTCACACCGTCAATCTGAACGGGATAGTGTTCAGGCGGCTTCGATAA
上述序列由1626个碱基(bp)组成。
mlrC:
ATGGCTGGATCGAAGGCGACAGGTGCAGCGCTGCCGGGGCGACGGTTGCGCGTGTTTGTGGCGACCTTGGGTACTGAGACGAATTCATTCTCACCTCTGCCAACCGGACTGGATGCGTTCCGGGCGACGATGCTCTGGCGCCCCGGAGAGCACCCGGATTTCGCAACCGAGGCGACCGGACCGCTGTGGGCCGCTCGAGAGCGTGCCCGCGAGGGACGCTACGAGGTCATCGAGGGAACCTGTGCCTTCGCCATGCCGGGTGGTCCAGTCAGCGCGCAAGCCTACCAACTACTGCGCGACGAGATCCTCGATCAACTGCGACGGGCAATGCCGGTGGATATCGTGGCTTTCGGTTTACACGGCGCAATGCTTGCCTTTGGCGAGGACGAGTGCGAGGCGGACCTTCTGGAGCGTGCCCGGGCGATTGTCGGGCCGGATGTTGCGCTAGGGGCCGAACTTGATCTTCACGCTCACTTGTCGCAGCGATTGGTCAGAGCTGCTGACGTACTCGTGGCATTCAAGTACTATCCGCATATCGACTACGTCGAGCGTGCGCGTGACCTTCTCGATCTACTCGAGAGAATCCGTGCGGGTGAGATCATGCCGACGTCGAGCCTGTTCAATTGCCAGATGGTTGCCGGACTGGCGACGCAGTCGTCACCGATGAAGGAATTGGTCGCAGACCTGTTTGAGCTCGAGCGGCGAGGGGAAGTCCTCTCCGGCTCACTGATCCAAGGCTTTCGTGCGGGCGATGTAGCGCGGATGGGGTCGAAAGTGCTGATCTATACCAACAACGATCAGCCAGCTGCTGCCTCTATCGCACAAGACTTCGGTCGGCGCTACCAAGCCATGGCTTCGATCATGAAAGGCAACGGCCCCGAGCGAAGCTTTGCGGCCGACATCGAGCTAGCCAAGGCGGCCACCGCATACCCGGTAATCCTGGTCGATAGTTCGGACAACCCCGGCGGTGGGGCTTCGGGTGACAATATGGCATTGGCCCGAGCGATGCTGGACAATGACCTCGTCCCGTCGTGCATTGGGCCGATATGGGATCCCCTGGCAGTACAATTGGGCTTTGAAGCCGGCCTTGGTGCCGATTTTTCCCTGCGCGTTGGCGGCAAGGTCGGCGAGGCATCCGGGCTACCTCTCGACGTTCGCGGCAAAATCACAGGGCTTGCCGAGAATGTCACCCAAAACCTTCAGGGCTCTCGGCCGCCTCTGGGGCGCGTCGTCTGCATCAGTACAGGTGGTCTCGACATCATCGTCAGCGAAATTCGCGACCAGTGCTACGGCCCCGATATGTTCCGGGCGCTCGGTGTTGAACCTGCGAACAAGCGCTATGTTGCCGTAAAGTCGTCCGAGCAATGGAGAATCGGTTTCGGGGACATGGGGCGCAGTGTGATCTACGTCGCTTCAAGCCAGCAGTCGTCCAACCGTCACTATCACAAGCGCTCCCGACCGATGTGGCCATTCGAGCCTGTCGACTTTTCAGCCTAG
上述序列由1497个碱基(bp)组成。
mlrD:
GTGAGCGTCATGTCCCGGTGGCTTCCGAAAACGTTTCGGGATCACCCAGCGGTATTGCTGCTGGCTGCGAAGGAAATGTGGGAGGCCTTCTCCTATGTCGGGCTCAGAACCGTACTGGTCTACTACCTTACGCAAGACCTGGGCTATTCGACCGAGGACGCCTCACTTATCTATGGGACGTTCCTCGGCGTAGCCTATGTAACGCCAATCCTGGGAGGGTGGATCGCTGATAGGTTTATTGGCCGATCTGCGGCAATTGTCGGTGGCGCATTGCTGAAGATGGCCGGTTACATCGGCCTTGTGATTGGCGCGAACGTCACGGGTTGCCTCGCCGCAATTGTCATTGGCAATGGCCTGTTTCTTCCCACTCTGCCCGCTACTCTGGGTGCACTTTTTTCGCCGAACGCCCCCGATCGCCAGCGCAGTTTCAGCTTCTACTATCTCGCAGTGAGCGCTGGTGCGCTGCTGGCACCGCTGATCTGCGGCACGCTTGGAGAGAATTTCGGCTGGCGCTACAGCTTCCTCGCTTCCGCTAGCGGGCTTGCGGCTGCCATTGTTATCTTTCTCGCCGGACGCCATCTGCTGCCGCCAGACCGACCTGCAGCAGCGTCCCATCCGGTCGACGAAGCGCCGGTCGCGGCTACGAGCCTGTCCGTCATCCCGCTTCTGGCAGGTGTCCTCGCAGCAGTCATCGTCTTGCGGGTCGCTTACGAGCAGCTCGGCAACACTGTCGCGCTTTTCGCCGCCAGCCAGGTCGATCGTTCGTTGGGGGCAGATATCACCATCCCCTATACCTGGTTTCAGTCGCTCAATCCCCTGGGAGTCATTCTGTTCACCCCTCTGCTCGTCTGGGGCTGGCGTAAGGCCGCCGCGAGAGGTGGCGCGCAGAACGACTACTTCAGAATGGCCATTGGTAGCTGCATCATGGCCGCGGCCTTTGTTGGGCTCGCACTGATCATCAAGCTAGGGCAACCTGGTGAGATTTCCTGGCCTGTTCTTGCAGCATTCTTCCTGATGGTAACCTTTGGCGAGTTGTGGGTGCTTCCGGTTGGACTCAGTCTGTTTGCGCGCCTGGCGCCCGCAGGACGAGGTGCAATCACCATCGCGTTCTGGTACAGTGCGCGTGCGGCTGGCAATTTTCTTGCTGGATTGATGGGCCGCGCCGAACCTGCGCTCGGATATGGTAACTTCTTCCTGCTTTGCGCAGTATTTCCTCTGCTAGCAGCAACGATCTTCGTCGCGATAGGCAGGCGCTCCCGTCGAATTATCGAAGCCGCCTGA
上述序列由1281个碱基(bp)组成。
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种嗜芳烃新鞘氨醇菌P6D9，分类命名为Novosphingobium aromaticivoransP6D9，菌种保藏编号是CCTCC NO:M 20211126。
2.权利要求1所述的嗜芳烃新鞘氨醇菌P6D9在降解微囊藻毒素(MCs)中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述MCs为MC-LR。
4.根据权利要求1所述的嗜芳烃新鞘氨醇菌P6D9在制备降解MCs的微生物制剂中的应用。
优选地，所述微生物制剂为嗜芳烃新鞘氨醇菌P6D9的菌体制剂或为嗜芳烃新鞘氨醇菌P6D9的酶制剂。
5.一种菌体制剂，含有权利要求1所述的嗜芳烃新鞘氨醇菌P6D9菌体。
6.一种酶制剂，含有权利要求1所述的嗜芳烃新鞘氨醇菌P6D9的胞内酶液。
7.权利要求5所述的菌体制剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
将嗜芳烃新鞘氨醇菌P6D9菌种子液按0.5-1.5％接种量接种于液体培养基中，培养后离心得到菌体；将清洗后的菌体重悬于MSM培养液中或者加入保护剂后冻干，得到所述菌体制剂。
8.权利要求6所述的酶制剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
对嗜芳烃新鞘氨醇菌P6D9菌种子液进行离心，得到菌体和细菌培养上清液，将清洗后的菌体重悬于原菌液8-15vt％体积的生理盐水中，立即冰浴，在冰浴环境中进行超声波破碎，细胞破碎结束后，离心，得到的上清液为所述嗜芳烃新鞘氨醇菌P6D9菌株的胞内酶液，即为酶制剂。
9.一种降解MCs的方法或处理MCs污染的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将权利要求5所述的菌体制剂和/或权利要求6所述的酶制剂投入到MC-LR污染的水体或其它生态环境中。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述水体为轻度至重度污染水体，所述其它生态环境为土壤等生态环境。
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Yi et al. Sphingomonas humi sp. nov., isolated from soil

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