CN113583899A

CN113583899A - 一株鞘氨醇菌属多环芳烃降解菌株jt-m9-h

Info

Publication number: CN113583899A
Application number: CN202110815164.XA
Authority: CN
Inventors: 李静华; 欧懿文; 郑悦; 陈婷; 常义爽; 袁凤玲; 袁铭玥; 陈明; 牛苗苗; 张昌甜
Original assignee: Henan Normal University
Current assignee: Henan Normal University
Priority date: 2021-07-19
Filing date: 2021-07-19
Publication date: 2021-11-02
Anticipated expiration: 2041-07-19
Also published as: CN113583899B

Abstract

本申请属于污染物处理技术领域，具体涉及一株鞘氨醇菌属多环芳烃降解菌株JT‑M9‑H及其应用专利申请事宜。该菌株命名为鞘氨醇菌JT‑M9‑H，Sphingbium sp.JT‑M9‑H，其保藏编号为CCTCC NO：M2021248；于2021年3月18日提交地址位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心进行保藏。本申请所提供的鞘氨醇菌JT‑M9‑H菌株，不仅可高效降解多环芳烃类污染物，同时由于对于重金属镉离子污染具有较好耐受性，且对于寡磷营养环境具有较好适应性，加上对于生长环境条件的pH、温度和盐度适应范围较广，因此，对于相关复杂成分污染物的降解处理具有较好的应用潜力。

Description

一株鞘氨醇菌属多环芳烃降解菌株JT-M9-H

技术领域

本申请属于污染物处理技术领域，具体涉及一株鞘氨醇菌属多环芳烃降解菌株JT-M9-H及其应用专利申请事宜。

背景技术

土壤作为污染物的“汇”，受工农矿业等人类活动影响，不同污染物通过大气沉降、污水灌溉和工业渗漏等途径同时或先后进入同一土壤中，在超过其自净能力后，形成了一种复合污染的土壤。典型的复合污染物，如疏水性持久有机污染物多环芳烃（PAHs）和无机污染物镉（Cd）等，广泛存在于污罐区，及焦化冶炼厂、煤化工和发电厂等附近的土壤中。由于复合污染物在土壤中具有协同或拮抗交互作用，具有普遍性和复杂性，可通过食物链富集或放大，因而对人民健康和生态安全构成了严重威胁。

现有技术中，针对土壤中有机污染物，常用的有化学处理法、物理吸附法等，但由于不同有机污染物类型所能适用的处理方法有所不同，同时，不同处理方法的处理效果也有明显差异，因此，从环境安全角度，探索合适的污染物降解处理方法是一个“永恒”的技术课题。

由于有机污染物中含有丰富的碳元素，因此，将有机污染物作为碳源和能源，利用微生物代谢方式来降解处理环境中有机污染物，是一种较为环保和可行的技术方案。也因此，筛选能够降解有机污染物的功能降解菌，是进行相关土壤修复、有机污染物处理的首要前提。

但另一方面，由于实际污染场地、污染土壤环境复杂，例如，石油化工、煤化工、金属冶炼厂、铅锌矿开采场等地污染环境中，有机污染物往往伴随有重金属污染，因此，筛选相关有机物降解菌株时，还需注意考察相关降解菌株对其他污染因子的耐受性，从而才能为微生物在土壤修复、环境污染物处理中应用奠定一定应用基础。

发明内容

本申请目的在于提供一株能够耐受重金属离子镉，同时具有一定的溶磷功能的多环芳烃降解菌株，从而可以满足相关环境条件下的有机污染物降解、土壤修复的技术需要。

本申请所采取的技术方案详述如下。

一株鞘氨醇菌属多环芳烃降解菌株JT-M9-H，该菌株属于鞘氨醇菌属（Sphingbium），初步鉴定后将该菌株命名为鞘氨醇菌属JT-M9-H（Sphingbium sp. JT-M9-H），其保藏编号为CCTCC NO：M2021248；于2021年3月18日提交地址位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心（CCTCC）进行保藏，并于2021年3月25日鉴定所保藏菌株状态为存活。

所述多环芳烃降解菌株鞘氨醇菌JT-M9-H在有机污染物降解中应用，该菌株可高效降解多环芳烃中的菲和/或芘，耐受重金属离子镉，同时具有一定的溶磷功能。

本申请筛选所得鞘氨醇菌JT-M9-H菌株，对于多环芳烃类的菲、芘具有较好的降解作用，但同时与已有报道的其他鞘氨醇菌属的多环芳烃降解菌株不同的是，本申请所提供菌株对于重金属离子镉具有较好耐受性；同时，菌株代谢过程中，可将不溶性磷酸盐溶解转换为可溶性磷盐，进而可为其他生物例如植物生长提供营养物质或者进一步络合或者稳定其他金属离子。

总体上，本申请所提供的鞘氨醇菌JT-M9-H菌株，不仅可高效降解多环芳烃类污染物，同时由于对于重金属镉离子污染具有较好耐受性，且对于寡磷营养环境具有较好适应性，加上对于生长环境条件的pH、温度和盐度适应范围较广，因此，对于相关复杂成分污染物的降解处理具有较好的应用潜力。

附图说明

图1为本发明菌株Sphingobium sp. JTM9-H的微观外貌特征及其系统发育树；

图2为本发明菌株Sphingobium sp. JTM9-H在不同菲和镉浓度下的生长曲线；

图3为本发明菌株Sphingobium sp. JTM9-H在不同镉浓度下对菲和芘的降解曲线；

图4为本发明菌株Sphingobium sp. JTM9-H在不同培养基生长过程中溶液磷含量的变化；

图5为本发明菌株Sphingobium sp. JTM9-H在不同环境条件下对菲芘的降解。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前，就下述实施例中部分实验背景情况简要介绍说明如下。

培养基类型及组分：

无机盐培养基M9：

KH₂PO₄ 3.0 g/L，HNa₂PO₄ 6.0 g/L，NaCl 0.5 g/L，NH₄Cl 1.0 g/L，微量元素2.5mL；

微量元素组成(g/L)为：MgCl₂ (10.75)，CaCO₃ (2.0)，FeSO₄ (4.5)，ZnSO₄(1.44)，MnSO₄(1.12)，CuSO₄ (0.25)，CoSO₄ (0.24)，H₃BO₄ (0.06)，HCL (51.3 ml)，MgSO₄(0.12)，FeSO₄(5.47)，pH 7.0；

基本培养基（MM培养基，氮磷含量较低的寡营养条件，单位 g/L）：

KH₂PO₄ （0.1），Na₂HPO₄（0.1），NaNO₃（0.25），NaSO₄（0.25），MgSO₄（0.2），CaCl₂（0.02），FeCl₂（0.002），MnSO₄（0.002）；pH 7.0；

MM固体平板培养基：上述MM营养液+18 g/L琼脂粉；

MM-1 g/L磷酸钙培养基：磷酸钙 (1 g/L)代替MM中的KH₂PO₄ (0.1 g/L)和HNa₂PO₄(0.1 g/L)；其它成分保持不变；

固体平板培养基LB：胰蛋白胨 10 g/L，酵母浸膏 5 g/L，NaCl 10 g/L，琼脂粉18g/L；

相关培养基使用前均采用121℃高温高压灭菌20 min的灭菌方式。

实施例1

本实施例中，就本申请所提供的鞘氨醇菌属JT-M9-H菌株的筛选、鉴定过程简介如下。

（一）样品来源

考虑多环芳烃降解菌株耐受性需要，发明人以新乡市工业园区贾屯生活污水处理厂活性污泥为样品来源，以期筛选获得既具有一定耐受性、同时能够降解多环芳烃的微生物菌株。

（二）筛选过程

菌株筛选时，大致筛选过程为：先对污泥中微生物菌株进行富集、随后对菌株分离，再后结合降解需要进行针对性筛选。具体操作可参考如下。

（1）富集培养：

将10 g湿重的菌源（即，工业园区活性污泥样品）加入到灭菌锥形瓶中，添加90 mL灭菌生理盐水及3-5颗 3 mm的玻璃珠，摇床160 rpm，30℃培养6个小时，转移上清液至M9培养基中（10 %，v/v），同时添加菲+芘作为碳源和营养来源（菲、芘初始浓度分别为50 mg/L），30℃、160 rpm摇床培养，每周传代至新鲜的含菲芘的M9培养基中。

（2）菌株分离

传代5次后，取上清液系列稀释，涂布在含菲芘的M9固体培养平板（菲、芘浓度分别为50 mg/L）上，两周后，从平板上挑选菌落转接至LB固体平板上，选择不同形态的菌株至含菲芘的M9液体培养基（菲、芘浓度分别为50 mg/L）中，培养基由无色变为黄色再变为棕色的样品，划线检测其纯度。

（3）菌株筛选

将上述步骤（2）中分离的纯菌株菌源添加至含菲芘的M9培养基（菲、芘浓度分别为50 mg/L）中，基于重金属离子Cd的耐受性需要，培养基中添加Cd(NO₃)₂·4H₂O使Cd²⁺的终浓度为环境中中等水平浓度3.64 mg/L，一周后检测其对菲芘的降解性能，选择对菲芘降解效果较好的菌株作为目标菌株，并进行进一步鉴定。

（三）菌株鉴定

基于上述步骤（二）初步筛选结果，选择菲芘降解性能较好、同时对于Cd具有较好耐受性的JTM9-H菌株，对其进行进一步鉴定。

其中，生理培养形态结果如图1所示，其形态特征为：短杆状，黄色菌落；通过扫描电子显微镜观察菌体长度约为0.45 µm，结合其初步生理特性判定，该菌株为一种革兰氏阴性菌。

进一步送至上海美吉生物医药科技有限公司对其进行DNA测序鉴定。通过对其16SrDNA 序列的测序和比对（测序结果同GenBank上登录号为：MW741723的序列），以及通过构建进化树（图1所示），可初步判定该菌株属于鞘氨醇单胞菌属（Sphingobium）一种。

鉴于该菌株的良好的重金属离子Cd离子耐受性能，同时基于该菌株对于菲芘的较好降解性能，发明人将该菌株于2021年3月18日提交地址位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心（CCTCC）进行保藏，并于2021年3月25日鉴定所保藏菌株状态为存活，其保藏编号为CCTCC NO：M2021248。

实施例2

针对实施例1中筛选所确定的鞘氨醇菌JT-M9-H菌株，为进一步研究和明确其潜在的对于菲芘的降解能力和对镉的耐受性，发明人进行了不同角度的探究实验，具体情况简介如下。

（一）菌株在不同浓度菲芘、不同镉浓度下的生长耐受情况

不同浓度菲芘条件设置：

单独高浓度菲及添加不同浓度的菲芘(溶于正己烷，待正己烷挥发），添加灭菌M9培养基及菌源，30℃、160 rpm摇床培养，培养期间不再添加营养物质，每隔一定时间，600nm下测吸光度。

具体生长曲线如图2所示。可以看出，随着菲浓度（20~900mg/L）的增加，JT-M9-H的生长量也逐渐增加，当菲浓度达到900 mg/L 时，对JT-M9-H的生长仍没有抑制(图2 a)，这一结果表明，鞘氨醇菌JT-M9-H菌株可以菲作为生长所需碳源，能够明显转化、降解环境中的菲污染物；而在总浓度固定、但不同比例的菲芘时，其生长曲线也有明显不同，其中当菲、芘浓度分别为80 mg/L和20 mg/L时，JT-M9-H生长最好(图 2 b)。

综合这些结果可以看出，鞘氨醇菌JT-M9-H菌株对菲的降解利用效果优于芘的降解利用效果，但适量芘存在条件下，可以促进菲的降解。

不同镉浓度条件设置：

为了减小培养基中PO₄ ^3-对有效镉的影响，在检测镉的影响时，选择寡营养培养基MM（MM-1 g/L磷酸钙培养基）。菲芘浓度分别为80和20 mg/L，添加寡营养培养基MM和菌源，及不同浓度的四水硝酸镉，每隔一定时间，600 nm下测吸光度。

培养期间，以与未添加镉离子培养基作为对照。

具体生长曲线如图2c所示。可以看出，不同浓度Cd²⁺条件下、在不同培养时间时，对于菌体生长的影响有一定差异。但总体而言，其中，当Cd²⁺浓度＜1.82 mg/L时，对JT-M9-H的生长有明显促进，但随着镉离子的浓度升高，初期对菌的生长会存在明显的抑制现象，但经过一段时间的适应，JT-M9-H生长会更优于无镉的培养条件下(图2 c)。这一结果表明，JT-M9-H菌株不仅能够耐受Cd污染，同时Cd有可能是其生长繁殖必需的微量元素。

基于上述实验结果可以看出，本申请所提供的JT-M9-H菌株，对于菲、芘均有较好的降解效果，其中与已有报道的其他多环芳烃降解的鞘氨醇菌属菌株更为明显的不同在于，该菌株对于镉离子具有较好耐受性，但在与高浓度镉离子共培养过程中，需要适应一定时间后菌株才能会复苏，而随着镉离子浓度升高，其所需要的适应时间也越久，但一旦菌株复苏，其生长速度则会快速增加，其生长趋势甚至则较无镉培养情况下更好。

（二）不同镉浓度下对菲和芘的降解情况

降解实验采用序批式实验，具体操作而言：

MM培养基中，初始菌源为2×10⁷CFU/mL，菲芘初始浓度分别为80和20 mg/L，添加不同浓度的镉离子；在一定时间取出整瓶，萃取菲芘，高效液相HPLC检测其残留浓度。

菲、芘的降解结果如图3所示。分析可以看出：

不添加镉离子时，菌株在96 h内可将菲去除99%以上(图 3 a)，芘去除率20%以上(图 3 b)；

当镉离子浓度为0.91 mg/L时，经过9天降解后，对菲的降解几乎没有影响，但对芘的降解有明显的促进，去除率可达50%，

但当Cd²⁺浓度＞0.91时，对菲芘的降解速度均有不同程度的影响。

而不同镉浓度条件下菌体生长情况测定结果表明，在菌株生长初期，重金属镉是抑制菌体活性、抑制其快速繁殖的，但是经过适应期后，并不影响菌体的菲芘降解能力。另一方面，就镉的用量影响而言，微量金属离子镉（＜1.82 mg/L）可适当促进菌株生长和对多环芳烃的降解；但当镉含量过高时（3.64-12.74 mg/L），菌株需要适应性扩增一段时间后，才能快速恢复生长活性，而在此期间，并不影响其代谢和降解多环芳烃。

（三）菌体的溶磷能力情况

在实际应用环境中，如水体和土壤，考虑基质中往往是寡营养状态，或者在有机污染场地中有机含量较高，导致碳氮磷比例失衡，尤其是氮磷匮乏是一种较为普遍现象。因此，如果菌株自身具备一定的溶磷能力，则对节约相关肥料成本及调整相关营养元素比例具有重要价值。为此，考虑磷元素对于作物生长的重要作用，发明人对该菌株的溶磷能力进行了初步检测，具体实验简介如下。

将菌株置于MM-1 g/L磷酸钙培养基中，接种菌量为4% (v/v)，不加菌的作为对照，不同天数取样，用磷钼蓝分光光度法测定培养基中可溶性磷的含量。

不同生长时间条件下P含量情况如图4所示。分析可以看出，该菌株可以将不溶的磷酸钙转化成溶解态磷，并且随着培养时间延长，溶磷量可以持续增加；测定结果表明，在不溶性磷酸钙培养基中，最高可溶出磷含量为67 mg/L (图 4 a)。

进一步的不同碳源（菲、芘）的降解对照实验表明，缺磷状态下可以促进芘的降解，但对菲的降解影响不大(图 4 b)。

（四）在不同环境条件下对菲芘的降解

为了检测菌株的应用潜力，发明人对该菌株对菲芘的降解能力进行了进一步测定，具体实验情况简介如下。

在MM培养基中，将菌株置于不同接种比例、不同pH、不同温度和不同盐度条件下培养，检测其对菲芘（初始浓度分别为80/20 mg/L）的降解性能。

具体结果如图5所示。分析可以看出，随着菌剂添加比例增加，对菲芘降解促进效果不显著，因此菌剂（菌源量为2×10⁷ CFU/mL）投加2 % (v/v)即可(图 5 a)。而就pH影响而言，可以看出，菌株具有广泛的pH适应范围，pH在4-10之间时，对降解影响不明显。

而就盐度和温度条件而言，可以看出，该菌株可以耐受不超过1%的盐度，但盐度过高时，菌株活性受到较大影响(图 5 b)；而就适用温度范围而言，可以看出，在25-35℃范围内具有较好生长效果，对菲芘降解效果较佳，但在超过35℃后，由于菌体生长活性降低，降解效果显然也有明显降低(图5 c)。

基于上述实验，可以看出：本申请所提供菌株，不仅可高效降解多环芳烃，且可耐受一定浓度的重金属镉，在寡营养环境中可溶出营养物质磷，同时适应较广的pH、温度和盐度等环境条件，因此在实际环境中具有较大的应用潜力。

Claims

1.一株鞘氨醇菌属多环芳烃降解菌株JT-M9-H，其特征在于，该菌株属于鞘氨醇菌属Sphingbium，将该菌株命名为鞘氨醇菌属JT-M9-H，Sphingbium sp. JT-M9-H，其保藏编号为CCTCC NO：M2021248；于2021年3月18日提交地址位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心进行保藏，并于2021年3月25日鉴定所保藏菌株状态为存活。

2.权利要求1所述多环芳烃降解菌株鞘氨醇菌株JT-M9-H在有机污染物降解中应用，其特征在于，该菌株用于降解多环芳烃中的菲和/或芘。

3.如权利要求2所述多环芳烃降解菌株鞘氨醇菌株JT-M9-H在有机污染物降解中应用，其特征在于，所述有机污染物中，含有重金属离子镉。

4.权利要求1所述多环芳烃降解菌株鞘氨醇菌株JT-M9-H在环境处理中应用，其特征在于，该菌株用于将非溶解态的磷盐转化成溶解态磷。