CN110317760A

CN110317760A - 一株PAHs-重金属复合污染降解/吸附菌及其在环境污染修复中的应用

Info

Publication number: CN110317760A
Application number: CN201910658863.0A
Authority: CN
Inventors: 刘沙沙; 付建平; 袁国栋; 吴贤格; 吴国彤; 李晓峰
Original assignee: Zhaoqing University
Current assignee: Zhaoqing University
Priority date: 2019-07-22
Filing date: 2019-07-22
Publication date: 2019-10-11
Anticipated expiration: 2039-07-22
Also published as: JP2021016385A; CN110317760B; JP6782036B1

Abstract

本发明公开了一株PAHs‑重金属复合污染的降解/吸附菌及其在环境污染修复中的应用，该菌株为鞘脂菌(Sphingobium sp.)PM1B，于2019年3月28日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO:M 2019212，该菌株对多环芳烃具有很好的降解效果，同时对重金属有吸附作用，可以用于PAHs‑重金属复合污染环境的治理与修复，包括电子垃圾拆解区、污灌区、工矿区和污染场地等的水体和土壤环境，具有广阔的应用前景。

Description

一株PAHs-重金属复合污染降解/吸附菌及其在环境污染修复中的应用

技术领域

本发明涉及环境污染物生物处理领域，具体涉及一株PAHs-重金属复合污染降解/吸附菌株及其在环境污染修复中的应用。

背景技术

多环芳烃(PAHs)是一类普遍存在的持久性有机污染物，其主要来源于石油的泄露事故，煤、石油、木材、有机高分子化合物或化学燃料的不完全燃烧。随着经济的发展，工业化进程逐渐加快，越来越多的PAHs进入到环境中，造成严重污染。同时，由于采矿、废气排放、固体废弃物堆积、污水灌溉、农用化学品的不合理使用等导致大量的重金属进入到环境中并持续积累。环境中的污染物不是以单一形式存在的，调查研究表明，我国许多地区的大气、水体和土壤已受到不同程度的PAHs-重金属复合污染。例如，练江、大燕河和珠江出海口水体、沉积物、水生生物体内，以及电子垃圾拆解区土壤和大气环境等均同时检测到PAHs和重金属污染物。

重金属是一种难降解的有毒污染物，具有生物累积性、毒性大等特点，PAHs具有致癌、致畸和致突变等作用。重金属和PAHs不仅能够破坏生态环境，还可以通过直接接触或食物链进入人体，对人类健康造成严重的威胁。这两种污染物在环境中的存在均具有持久性，形成的复合污染对环境和人类的危害更大。因此，开展PAHs-重金属复合污染环境的治理与修复迫在眉睫。由于重金属和PAHs在环境中长期共存，两者之间的物理化学性质相差较大，而且还会发生复杂的相互作用，增加了复合污染的修复难度。

目前，关于PAHs-重金属复合污染修复技术主要有物理化学法和生物法。物理化学修复技术包括吸附法、氧化还原、客土法、淋洗法和改良法等，虽然操作简单，修复速度快。但是投资成本较高，对于同时含有PAHs和重金属的废水或土壤的处理效果并不明显，容易破坏生态环境，造成二次污染等问题。微生物修复是去除环境中污染物的有效方法之一，具有经济、简便、不易产生新的污染等优点。微生物可以通过自身的代谢活动将高毒、结构复杂的污染物降解为低毒或无毒的化合物，是环境中PAHs去除的主要途径。近年来，国内外学者对降解PAHs的微生物进行了广泛研究，已经分离出的能够降解PAHs的微生物有70多个属，200余种，包括细菌、真菌、放线菌和藻类等。同时，由于微生物细胞表面存在大量的官能团(例如：羧基、羟基、氨基和酰胺基)和活性位点而对重金属有很好的吸附作用，利用微生物作为高效的吸附材料去除环境介质中的重金属也得到了广泛的关注。

发明内容

针对上述问题，本发明提供一株PAHs-重金属复合污染降解/吸附菌株及其应用方法。

本发明的目的采用以下技术方案来实现：

本申请提供一株鞘脂菌(Sphingobium sp.)PM1B，于2019年3月28日保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO:M 2019212，保藏地点为中国武汉武汉大学，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山。

所述鞘脂菌(Sphingobium sp.)PM1B从广东清远龙塘镇电子垃圾拆解区焚烧迹地中驯化、筛选、分离获得，所述鞘脂菌PM1B在平板上的形态，菌落呈亮黄色，球形，边缘整齐，表面隆起，表面光滑湿润，不透明；电子显微镜下观察到该菌的形状为杆状。

采用16S rDNA序列分析对菌株进行分类鉴定，委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成，得到了长度为1428bp的序列。经过对菌株进行同源序列对比，PM1B的16S rDNA序列与鞘脂菌(Sphingobium sp.)的同源性达99％，将该菌种归于鞘脂菌属。

所述鞘脂菌(Sphingobium sp.)PM1B的16S rDNA的核苷酸序列如Seq ID No:1所示。

本申请的目的之二在于提供所述的鞘脂菌(Sphingobium sp.)PM1B在降解PAHs和/或吸附转化重金属中的应用。

优选地，所述PAHs为芘和/或菲。

优选地，所述重金属为铜和/或镉。

本申请的目的之三在于提供一种降解PAHs和/或吸附转化重金属的降解菌剂，包含上述所述鞘脂菌(Sphingobium sp.)PM1B菌株。

本发明的有益效果为：

由于大部分菌株只能降解PAHs而对重金属没有耐受性和吸附能力，或者能够吸附重金属而不能降解PAHs，目前的研究主要集中在微生物对单一的重金属或PAHs的去除；本发明筛选得到一株鞘脂菌，能够高效降解多种PAHs且吸附重金属，可以用于PAHs-重金属复合污染水土环境的治理与修复，应用对象包括电子垃圾拆解区、污灌区、工矿区和污染场地等及周边环境等，能有效减轻重金属和PAHs对生态环境和人类健康的危害。

利用本发明提供的鞘脂菌处理PAHs和重金属污染，与物理吸附、化学改良和氧化还原方法相比，具有处理效果好、成本低、环保等优点，在环境修复领域有着广阔的应用前景。

附图说明

利用附图对本发明作进一步说明，但附图中的实施例不构成对本发明的任何限制，对于本领域的普通技术人员，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据以下附图获得其它的附图。

图1为鞘脂菌PM1B在平板上的形态；

图2为鞘脂菌PM1B在电子显微镜下的形态；

图3为在芘、菲、铜和镉的复合体系中菌PM1B对菲和芘的降解效果与时间的关系图；

图4为在芘、菲、铜和镉的复合体系中菌PM1B对铜和镉的吸附效果与时间的关系图；

图5为菌液对土壤样品中芘、菲、铜和镉的去除效果。

具体实施方式

结合以下实施例对本发明作进一步描述。

实施例1

鞘脂菌PM1B菌株的分离鉴定

1、土壤样品

供试土样取自广东清远龙塘镇电子垃圾拆解区焚烧迹地，表层土去掉后，取5～20cm深度范围的土壤放入密封袋，带回实验室放置-20℃冰箱中保存。

2、培养基及溶液的配制

无机盐培养基(MSM)的组成如下：5mL磷酸盐缓冲溶液(KH₂PO₄8.5 g/L，K₂HPO₄·3H₂O 21.75g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 33.4g/L，NH₄Cl 5.0g/L)；3mL MgSO₄溶液(22.5g/L)；1mLFeCl₃溶液(0.25g/L)；1mL CaCl₂溶液(36.4g/L)；1mL微量元素液(MnSO₄·H₂O 39.9mg/L，ZnSO₄·H₂O 42.8mg/L，(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 34.7mg/L)，定容至1L，pH值为7.2～7.4。

PAHs储备溶液：以丙酮为溶剂分别配制芘(1g/L)和菲(1g/L)的母液，置于冰箱中4℃ 保存备用。

重金属储备液：称取一定量的Cd(NO₃)₂、Cu(NO₃)₂分别溶解于去离子水中，配制成浓度为1g/L的Cd²⁺、Cu²⁺储备液。

3、PAHs-重金属降吸附菌的驯化、筛选和分离

称取10g土壤到250mL的三角瓶，加100mL已灭菌的焦磷酸钠溶液(Na₂P₂O₇·7H₂O，2.8g/L)，用超声波振荡(3min)均匀，置于摇床中振荡过夜，得到备用菌液，备用。

先将10mL上述备用菌液接种到含有芘和菲的MSM培养基中，150rpm，30℃，培养7d，然后从中取10mL上清液转接至含有菲(50mg/L)、芘(10mg/L)、Cd²⁺(5mg/L)、Cu²⁺(20mg/L)的MSM培养基，培养体系的总体积为100mL，重复以上步骤，进行驯化5次。

取最后一个周期的驯化培养菌液5mL，按10倍稀释法将菌液稀释成10^-1～10^-7梯度的菌悬液，然后取0.1mL涂布于肉汤固体培养基上，将平板倒扣放置于30℃生化培养箱中，3～4 天后，待菌落长好，观察菌落的形态。

在平板上选择不同形态特征的菌落，重新转接至100mL含有50mg/L菲、10mg/L芘和5mg/L Cd²⁺、20mg/L Cu²⁺的MSM培养基中，摇床培养以验证其是否具备降解PAHs和吸附重金属的能力，选择培养液变色变浑浊的摇瓶，重复上述步骤，进行纯化3次，确保获得菌株的纯度和降解/吸附性能的稳定。最后筛选获得一株对芘/菲-镉/铜复合污染的降解吸附能力最好、生长性能稳定的作为目标菌株，编号为PM1B。

实施例2

鞘脂菌(Sphingobium sp.)PM1B菌株的降解吸附性能

用MSM溶液将菌株制成菌悬液，调节OD₆₀₀为0.6，按10％的比例加入到含有50mg/L菲、10mg/L芘、5mg/L Cd²⁺和20mg/L Cu²⁺的18mL MSM培养体系中，每个处理设置三个重复，在30℃，150rpm条件下进行震荡培养，定时取样测定PM1B的生长量和溶液中剩余的菲、芘、镉、铜的浓度，设置不加菌的空白对照来分析污染物在实验过程中的非生物损失。

菲和芘的浓度通过高效液相色谱法(HPLC)测定，在摇瓶中加入适量的色谱级甲醇色谱级，超声处理一段时间确保其中的菲和芘完全溶解，转移到50mL容量瓶并用甲醇定容，经 0.22μm有机相滤头进入HPLC测定菲的浓度，菲和芘的测定波长别为234和250nm，流动相为甲醇/超纯水(v/v，90/10)。各反应体系溶液进行离心，取定量上清液，经0.22μm滤头进行过滤，利用原子吸收光谱仪测定镉和铜的浓度。

实验结果如图3所示，在芘、菲、铜和镉的复合体系中，随着时间的延长，菌PM1B对菲和芘的降解效果逐渐增加。在120h时，菲和芘的去除率分别达到了89.58％和38.81％。同时，PM1B对铜和镉也有一定的吸附作用(见图4)，吸附率随着时间的推移也是逐渐递增的，在36h时对镉和铜的吸附率达到最高，分别为63.03％和48.04％。随后菌PM1B对铜表现出轻微的解吸作用，但吸附率基本上维持在40％左右。

本发明要求保护的一株鞘脂菌，能够高效降解多种PAHs且吸附重金属，可以用于PAHs- 重金属复合污染水土环境的治理与修复。

实施例3

鞘脂菌PM1B对电子垃圾拆解区土壤的修复

土壤样品采自广东清远龙塘镇电子垃圾拆解区附近农田，其中含有多种重金属和PAHs 污染物，称取一定量的污染土壤放置在玻璃培养装置中，将菌液接种到土壤中，土壤湿度保持为田间最大持水量的60％，设置不加菌的对照组，30℃条件下，自然光照培养60d，取样测定土壤中芘、菲、铜和镉的残余浓度。实验结果如图5所示，经过两个月的微生物降解/吸附，土壤中芘、菲、铜和镉的去除率分别为79.47％、34.92％、59.12％和37.98％，说明鞘脂菌PM1B对实际的PAHs-重金属复合污染土壤具有较好的修复效果。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

序列表

<110>肇庆学院

<120>一株PAHs-重金属复合污染降解/吸附菌及其在环境污染修复中的应用

<160>1

<210>1

<211>1428

<212>DNA

<213>鞘脂菌（Sphingobium sp.）PM1B

<400>1

tggctcagaa cgaacgctgg cggcatgcct aatacatgca agtcgaacga gattttcgga 60

tgtagtggcg cacgggtggg ttacgcgtgg gaatttgccc ttgggttcgg aataacgttt 120

ggaaacgaac ggtaataccg gatgatgacg aaagtccaaa gatttatcgc ccagggatga 180

gcccgcgtag gattagctag ttggtgaggt aaaggctcac caaggcgacg atccttagct 240

ggtctgagag gatgatcagc cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg 300

cagcagtagg gaatattgga caatgggggc aaccctgatc cagcaatgcc gcgtgagtga 360

tgaaggcctt agggttgtaa agctctttta cccgggatga taatgacagt accgggagaa 420

taagccccgg ctaactccgt gccagcagcc gcggtaatac ggagggggct agcgttgttc 480

ggaattactg ggcgtaaagc gcacgtaggc ggcgatttaa gtcaggggtg aaagcccagt 540

gctcaacact ggaactgcct ttgagactgg attgcttgaa tcacggagag gtgggtggaa 600

ttccgagtgt agaggtgaaa ttcgtagata ttcggaagaa caccagtggc gaaggcggcc 660

cactggacgt gtattgacgc tgaggtgcga aagcgtgggg agcaaacagg attagatacc 720

ctggtagtcc acgccgtaaa cgatgataac tagctgctgg ggtgcatggc atttcagtgg 780

cgcagctaac gcattaagtt atccgcctgg ggagtacggt cgcaagatta aaactcaaag 840

gaattgacgg gggcctgcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgaag caacgcgcag 900

aaccttacca acgtttgaca tccctatcgc ggatcgtgga gacactttcc ttcagttcgg 960

ctggataggt gacaggtgct gcatggctgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta 1020

agtcccgcaa cgagcgcaac cctcgacttt agttgccatc atttagttgg gtactctaaa 1080

gtaaccgccg gtgataagcc ggaggaaggt ggggatgacg tcaagtcctc atggccctta 1140

cgcgttgggc tacacacgtg ctacaatggc gactacagtg ggcagccact ccgcgaggag 1200

gagctaatct ccaaaagtcg tctcagttcg gatcgttctc tgcaactcga gagcgtgaag 1260

gcggaatcgc tagtaatcgc ggatcagcat gccgcggtga atacgttccc aggccttgta 1320

cacaccgccc gtcacaccat gggagttgga ttcactcgaa ggcgttgagc taaccgcaag 1380

gaggcaggcg accacagtgg gtttagcgac tggggtgaag tcgtaaca 1428

Claims

1.一株鞘脂菌(Sphingobium sp.)PM1B，其特征在于，保藏编号为CCTCC NO:M2019212。

2.根据权利要求1所述的鞘脂菌(Sphingobium sp.)PM1B，其特征在于，所述鞘脂菌(Sphingobium sp.)PM1B的16S rDNA的核苷酸序列如Seq ID No:1所示。

3.根据权利要求1或2所述的鞘脂菌(Sphingobium sp.)PM1B在降解PAHs和/或吸附转化重金属中的应用。

4.根据权利要求3所述的鞘脂菌(Sphingobium sp.)PM1B在降解PAHs和/或吸附转化重金属中的应用，其特征在于，所述PAHs为芘和/或菲。

5.根据权利要求3所述的鞘脂菌(Sphingobium sp.)PM1B在降解PAHs和/或吸附转化重金属中的应用，其特征在于，所述重金属为铜和/或镉。

6.一种降解菌剂，其特征在于，包含有权利要求1或2所述鞘脂菌(Sphingobium sp.)PM1B菌株。