CN107306532A - 一种利用复合PAHs降解菌同时去除植物体内USEPA PAHs的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开的是一种利用复合PAHs降解菌同时去除植物体内USEPA PAHs的方法，将多种功能菌制成微生物复合功能菌剂，并加入植物吸收促进剂、细胞分裂素6‑BA或KT、生长素2,4‑D、半胱氨酸，制成降解剂，然后接种于植物体内，即可降低植物体内PAHs含量；所述复合功能菌剂是由8株降解谱不同的PAHs降解菌组成，分别是：鞘脂菌属(Sphingobium sp.RS1、RS2)、分枝杆菌属(Mycobacterium sp.Pyr9、033)、(Diaphorobacter sp.Phe15)、马赛菌属(Massilia sp.Pn2)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus sp.Phe3)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.Ph6)；本发明能够有效得去除和降解污染区植物体内萘，苊烯，苊，芴，菲，蒽，荧蒽，芘，苯并[a]蒽，苯并[b]荧蒽，苯并[k]荧蒽，苯并[a]芘，二苯并[a,h]蒽，苯并[ghi]苝和茚并[1,2,3‑cd]芘，且PAHs去除率高，具有高效、环保、易操作的优点。

Description

一种利用复合PAHs降解菌同时去除植物体内USEPA PAHs的 方法
技术领域
本发明涉及环境工程微生物技术领域，具体是涉及一种利用复合PAHs降解菌同时去除植物体内USEPA PAHs的方法。
背景技术
PAHs是一种持久性、高风险有机污染物。现发现已知的PAHs多达几百种，其中16种PAHs由于存具有致畸和致突变性的“三致”效应，被美国环保署列为优先控制PAHs。土壤是人类赖以生存的重要自然资源之一。污水灌溉、大气干湿沉降、等造成我国及全球土壤污染日趋严重。2014环境保护部、国土资源部发布的全国土壤污染调查公报显示，全国土壤PAHs点位超标率1.4％。土壤受到污染后，PAHs可在土壤-植物系统中迁移，进而危及农产品安全和人群健康。
目前常见的植物体内有机污染物去除方法，主要通过物理或化学方法将土壤中PAHs固定或降解，进而阻控土壤中PAHs向植物体内的迁移。但物理或化学方法往往会对土壤造成次生污染，修复过程不易控制，大规模的应用还需解决大量的问题。生物降解PAHs是一种高效环保的方式，但目前的研究主要集中于土壤中PAHs去除和降解，植物体内PAHs去除和降解技术鲜有涉及。因此，通过将多株PAHs降解菌复合，再重新定殖到污染植物体以降低植物PAHs污染风险的一种可行的手段。
发明内容
本发明旨在填补利用复合功能菌同时去除和降解植物体内USEPA PAHs技术应用的空白，提供一种利用复合PAHs降解菌同时去除植物体内USEPA PAHs的方法。
为达到上述目的，本发明的技术方案是：
一种利用复合PAHs降解菌同时去除植物体内美国环保署优先控制多环芳烃(USEPA Polycyclic Aromatic Hydrocarbons,USEPA PAHs)的方法，所述方法是将复合功能菌制成微生物复合功能菌剂，并加入植物吸收促进剂、细胞分裂素6-BA或KT、生长素2,4-D、半胱氨酸，制成降解剂，然后接种于植物体内，即可降低植物体内PAHs含量；
所述的复合功能菌是由8株降解谱不同的PAHs降解菌组成，分别是：鞘脂菌属(Sphingobium sp.RS1、RS2)、分枝杆菌属(Mycobacterium sp.Pyr9、033)、(Diaphorobacter sp.Phe15)、马赛菌属(Massilia sp.Pn2)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus sp.Phe3)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.Ph6)。
8株PAHs降解菌皆能够以PAHs为唯一碳源和能源生长，菌株之间无拮抗现象，其拮抗试验结果如附图2所示。
8株PAHs降解菌具有不同的降解谱，RS1、RS2可在不同程度上降解苊稀、菲、芘；Pyr9、Phe15为菲、芘降解菌；033可降解菲、蒽、荧蒽、苯并苝；Pn2可降解萘、苊稀、菲、芘、苯并芘；Phe3可降解萘、菲、芴、荧蒽、苯并芘；Ph6可降解苊稀、菲；
所述微生物复合功能菌剂与所述植物吸收促进剂、细胞分裂素6-BA或KT、生长素2,4-D、半胱氨酸之间的配比为：(1×106CFU-1×107CFU):(0.2-0.5mg):(0.01-0.1mg):(0.03-0.2mg):(0.5-2mg)；将植物吸收促进剂、细胞分裂素6-BA或KT、生长素2,4-D、半胱氨酸依次加入到所述微生物复合功能菌剂中，搅拌速度为100-200r/min，搅拌时间为13-20min，即得到所述降解剂；
所述接种方式为浸种或喷叶，采用浸种方式接种后，对植物种子进行连续红光光照处理2-6天，采用喷叶方式接种后，对植物叶片进行间隔红光光照处理5-7天，每天的光照时长为4-10h。
进一步地，在上述方案中，所述微生物复合功能菌剂的制备方法为：将各菌种分别培养，然后调整各菌种OD600nm混合制成微生物复合功能菌剂，具体包括以下步骤：
(1)菌悬液的制备：将8株PAHs降解菌在LB固体平板进行活化，用接种环从活化平板挑取各单菌落分别接种于无菌LB液体培养基中，置于30℃、150r/min扩大培养至对数期，培养完成后，8000r/min 4℃离心5min，弃去上清液，加入无菌MSM使菌体混合均匀，再次离心，该操作重复两次，以充分洗去菌体中残留的LB培养基；最后用无菌MSM调整菌悬液浓度OD600nm分别为0.2、0.5、1.0、1.5；
(2)将获得的菌悬液按等体积比混合，制得不同浓度OD600nm复合降解菌储备液，4℃保存备用；通过LB固体培养基进行对峙试验，每天观察菌落变化及划线交叉点处各细菌生长情况，判断不同菌株之间是否有拮抗，若交叉点处两菌株均可生长，则说明二者之间无拮抗作用；反之则二者之间存在拮抗。
进一步地，在上述方案中，所述复合功能菌浓度OD600nm为0.2、0.5、1.0、1.5。
优选地，所述复合功能菌悬液浓度OD600nm为0.5。
进一步地，在上述方案中，所述植物吸收促进剂是由硫酸锰、天冬氨酸、琥珀酸三种成分按照3:4:1的重量比组成的混合物。
进一步地，在上述方案中，所述浸种方式是指，播种前将植物种子在降解剂中浸泡6h；所述喷叶方式是指，待植物长至一定大小时，在成熟前分三次将降解剂喷洒于植物叶片表面。喷洒时要在叶片的两面都进行喷洒，喷洒的距离≦5-8cm，喷洒时要避开雨天和晴天，尽量选择无风的阴天。
所述的一种利用复合PAHs降解菌同时去除植物体内USEPA PAHs的方法，所述的降解剂在降解水体、土壤或者植物体内多环芳烃的应用。
进一步地，所述的应用，是指同时去除或降解9种及以上USEPA PAHs。
本发明所述方法中：PAHs为萘，苊烯，苊，芴，菲，蒽，荧蒽，芘，苯并[a]蒽，苯并[b]荧蒽，苯并[k]荧蒽，苯并[a]芘，二苯并[a,h]蒽，苯并[ghi]苝和茚并[1,2,3-cd]芘。
本发明的有益效果是：本发明能够有效的去除和降解污染区植物体内萘，苊烯，苊，芴，菲，蒽，荧蒽，芘，苯并[a]蒽，苯并[b]荧蒽，苯并[k]荧蒽，苯并[a]芘，二苯并[a,h]蒽，苯并[ghi]苝和茚并[1,2,3-cd]芘，且PAHs去除率高，本发明的方法具有高效、环保、易操作的优点。
附图说明
图1是菌株透射电镜图。
图2是各菌株间竞争性试验。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明的保护范围不限于此：实施例1：
将上海青种子接种复合功能菌，以降低其体内的PAHs含量。
制备微生物复合功能菌剂：
该复合功能菌是由8株降解谱不同的PAHs降解菌组成，分别是：鞘脂菌属(Sphingobium sp.RS1、RS2)、分枝杆菌属(Mycobacterium sp.Pyr9、033)、(Diaphorobacter sp.Phe15)、马赛菌属(Massilia sp.Pn2)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus sp.Phe3)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.Ph6)；
将各菌种分别培养，然后调整各菌种OD600nm混合制成微生物复合功能菌剂，具体包括以下步骤：
(1)菌悬液的制备：将8株PAHs降解菌在LB固体平板进行活化，用接种环从活化平板挑取各单菌落分别接种于无菌LB液体培养基中，置于30℃、150r/min扩大培养至对数期，培养完成后，8000r/min 4℃离心5min，弃去上清液，加入无菌MSM使菌体混合均匀，再次离心，该操作重复两次，以充分洗去菌体中残留的LB培养基；最后用无菌MSM调整菌悬液浓度OD600nm为0.2；
(2)将获得的菌悬液按等体积比混合，制得浓度OD600nm为0.2的复合降解菌储备液，4℃保存备用；通过LB固体培养基进行对峙试验，每天观察菌落变化及划线交叉点处各细菌生长情况，判断不同菌株之间是否有拮抗，若交叉点处两菌株均可生长，则说明二者之间无拮抗作用；反之则二者之间存在拮抗。
制备降解剂：将植物吸收促进剂、细胞分裂素6-BA、生长素2,4-D、半胱氨酸依次加入到微生物复合功能菌剂中，植物吸收促进剂是由硫酸锰、天冬氨酸、琥珀酸三种成分按照3:4:1的重量比组成的混合物；微生物复合功能菌剂与植物吸收促进剂、细胞分裂素6-BA、生长素2,4-D、半胱氨酸之间的配比为：1×106CFU:0.2mg:0.01mg:0.03mg:0.5mg；搅拌速度为100r/min，搅拌时间为13min，即得到降解剂。
然后通过浸种的方式将上海青种子接种复合功能菌，在播种前将上海青种子在降解剂中浸泡6h，接种后，对上海青种子进行连续红光光照处理2天，即可降低植物体内PAHs含量。
实施例2：
将上海青叶片接种复合功能菌，以降低其体内的PAHs含量。
制备微生物复合功能菌剂：
该复合功能菌是由8株降解谱不同的PAHs降解菌组成，分别是：鞘脂菌属(Sphingobium sp.RS1、RS2)、分枝杆菌属(Mycobacterium sp.Pyr9、033)、(Diaphorobacter sp.Phe15)、马赛菌属(Massilia sp.Pn2)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus sp.Phe3)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.Ph6)；
将各菌种分别培养，然后调整各菌种OD600nm混合制成微生物复合功能菌剂，具体包括以下步骤：
(1)菌悬液的制备：将8株PAHs降解菌在LB固体平板进行活化，用接种环从活化平板挑取各单菌落分别接种于无菌LB液体培养基中，置于30℃、150r/min扩大培养至对数期，培养完成后，8000r/min 4℃离心5min，弃去上清液，加入无菌MSM使菌体混合均匀，再次离心，该操作重复两次，以充分洗去菌体中残留的LB培养基；最后用无菌MSM调整菌悬液浓度OD600nm为0.2；
(2)将获得的菌悬液按等体积比混合，制得浓度OD600nm为0.2的复合降解菌储备液，4℃保存备用；通过LB固体培养基进行对峙试验，每天观察菌落变化及划线交叉点处各细菌生长情况，判断不同菌株之间是否有拮抗，若交叉点处两菌株均可生长，则说明二者之间无拮抗作用；反之则二者之间存在拮抗。
制备降解剂：将植物吸收促进剂、细胞分裂素KT、生长素2,4-D、半胱氨酸依次加入到微生物复合功能菌剂中，植物吸收促进剂是由硫酸锰、天冬氨酸、琥珀酸三种成分按照3:4:1的重量比组成的混合物；微生物复合功能菌剂与植物吸收促进剂、细胞分裂素KT、生长素2,4-D、半胱氨酸之间的配比为：1×107CFU:0.35mg:0.05mg:11mg:1.25mg；搅拌速度为150r/min，搅拌时间为16min，即得到降解剂。
然后通过喷叶的方式，待上海青长至一定大小时，在成熟前分三次将降解剂喷洒于上海青叶片表面。喷洒时要在叶片的两面都进行喷洒，喷洒的距离为5cm，喷洒时要避开雨天和晴天，尽量选择无风的阴天。接种后，对上海青叶片进行间隔红光光照处理6天，每天的光照时长为7h，即可降低植物体内PAHs含量。
实施例3：
将上海青种子接种复合功能菌，以降低其体内的PAHs含量。
制备微生物复合功能菌剂：
该复合功能菌是由8株降解谱不同的PAHs降解菌组成，分别是：鞘脂菌属(Sphingobium sp.RS1、RS2)、分枝杆菌属(Mycobacterium sp.Pyr9、033)、(Diaphorobacter sp.Phe15)、马赛菌属(Massilia sp.Pn2)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus sp.Phe3)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.Ph6)；
将各菌种分别培养，然后调整各菌种OD600nm混合制成微生物复合功能菌剂，具体包括以下步骤：
(1)菌悬液的制备：将8株PAHs降解菌在LB固体平板进行活化，用接种环从活化平板挑取各单菌落分别接种于无菌LB液体培养基中，置于30℃、150r/min扩大培养至对数期，培养完成后，8000r/min 4℃离心5min，弃去上清液，加入无菌MSM使菌体混合均匀，再次离心，该操作重复两次，以充分洗去菌体中残留的LB培养基；最后用无菌MSM调整菌悬液浓度OD600nm分别为:0.5；
(2)将获得的菌悬液按等体积比混合，制得浓度OD600nm为0.5的复合降解菌储备液，4℃保存备用；通过LB固体培养基进行对峙试验，每天观察菌落变化及划线交叉点处各细菌生长情况，判断不同菌株之间是否有拮抗，若交叉点处两菌株均可生长，则说明二者之间无拮抗作用；反之则二者之间存在拮抗。
制备降解剂：将植物吸收促进剂、细胞分裂素6-BA、生长素2,4-D、半胱氨酸依次加入到微生物复合功能菌剂中，植物吸收促进剂是由硫酸锰、天冬氨酸、琥珀酸三种成分按照3:4:1的重量比组成的混合物；微生物复合功能菌剂与植物吸收促进剂、细胞分裂素6-BA、生长素2,4-D、半胱氨酸之间的配比为：1×107CFU:0.5mg:0.1mg:0.2mg:2mg；搅拌速度为200r/min，搅拌时间为20min，即得到降解剂。
然后通过浸种的方式将上海青种子接种复合功能菌，在播种前将上海青种子在降解剂中浸泡6h，接种后，对上海青种子进行连续红光光照处理6天，即可降低植物体内PAHs含量。
另外实施例4-16分别按照下述植物及OD600nm复合功能菌浓度来对植物体内PAHs进行去除，其它参数同实施例1相同(如表1所示)，植物生长周期为45天，之后收获植物进行PAHs检测。
表1不同OD600nm复合功能菌及接种方式对植物体内PAHs去除率的影响
待测植物的采集及其PAHs含量的测定：
植物种子或幼苗通过上述浸种或喷叶方式接种复合功能菌，植物收获后，用无菌水充分清洗植物表面，并用吸水纸吸干植物表面水分，将新鲜的植物样品置于-40℃冷冻干燥后充分研磨，-20℃保存待测。
取上述制备好的植物样品于20mL玻璃离心管中，加入10mL二氯甲烷，盖紧后于超声水浴中超声萃取30min，以4000r·min-1离心10min，取3mL上清液过层析柱(上层2g无水硫酸钠，下层2g硅胶)净化并用11mL 1:1的二氯甲烷和正己烷溶液洗脱；过柱后萃取液和洗脱液收集至旋转蒸发瓶，40℃恒温下浓缩至干，用甲醇润洗定容到2mL，过0.22μm孔径有机相滤膜后，HPLC/UV-FLD分析。HPLC/UV-FLD分析条件：色谱柱为Ф4.6×250mm Inertsil ODS-PAHs专用反相色谱柱，流动相为甲醇-水，采用梯度淋洗和紫外、荧光检测器串联的方法分离PAHs。紫外和荧光检测均采用波长切换，并且紫外检测器开启双波长检测模式。流动相流速为1.0mL/min，柱温40℃，进样量为20μL。总PAHs去除率：
苯并[a]芘等效毒性(TEFs)：
Ci：植物体内PAHi含量；TEFi：PAHi苯并芘等效毒性当量因子(见表2)
表2：多环芳烃的苯并[a]芘等效毒性当量因子
测试结果见表3：
表3经实施例1～16处理后植物体内USEPA PAHs去除率及苯并[a]芘等效毒性
由表3可知，实施例3、实施例11对上海青、小白菜USAEPA PAHs去除率较高，苯并[a]芘等效毒性较低；实施例8、实施例16对上海青、小白菜USAEPA PAHs去除率低，但苯并[a]芘等效毒性较低。实施例5植物体内PAHs去除率可达70％，但其苯并[a]芘等效毒性较高，且复合功能菌浓度OD600nm较高。由实施例3和11可得出，本发明中优先接种方式为浸种，复合功能菌浓度OD600nm为0.5。
可见，本发明公布的一种利用复合PAHs降解菌同时去除植物体内USEPA PAHs的方法，能够有效的去除和降解植物体内USEPA PAHs，降低植物体内PAHs对人体毒害，去除率高达50％以上，且对土壤理化性质无不良影响，具有环保、高效的特点。
根据以上描述，本领域技术人员可以容易地确定本发明的必要特性，并且在不背离其精神和范围的情况下，可以做出本发明的多种变化和修改以使其适应多种用途和情况。因此，其他实施方案也在权利要求的范围内。

Claims (9)

1.一种利用复合PAHs降解菌同时去除植物体内美国环保署优先控制多环芳烃(USEPAPolycyclic Aromatic Hydrocarbons,USEPA PAHs)的方法，其特征在于：所述方法是将多种功能菌制成微生物复合功能菌剂，并加入植物吸收促进剂、细胞分裂素6-BA或KT、生长素2,4-D、半胱氨酸，制成降解剂，然后接种于植物体内，即可降低植物体内PAHs含量；
所述的复合功能菌是由8株降解谱不同的PAHs降解菌组成，分别是：鞘脂菌属(Sphingobium sp.RS1、RS2)、分枝杆菌属(Mycobacterium sp.Pyr9、033)、(Diaphorobacter sp.Phe15)、马赛菌属(Massilia sp.Pn2)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus sp.Phe3)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.Ph6)；
所述微生物复合功能菌剂与所述植物吸收促进剂、细胞分裂素6-BA或KT、生长素2,4-D、半胱氨酸之间的配比为：(1×106CFU-1×107CFU):(0.2-0.5mg):(0.01-0.1mg):(0.03-0.2mg):(0.5-2mg)；将植物吸收促进剂、细胞分裂素6-BA或KT、生长素2,4-D、半胱氨酸依次加入到所述微生物复合功能菌剂中，搅拌速度为100-200r/min，搅拌时间为13-20min，即得到所述降解剂；
所述接种方式为浸种或喷叶，采用浸种方式接种后，对植物种子进行连续红光光照处理2-6天，采用喷叶方式接种后，对植物叶片进行间隔红光光照处理5-7天，每天的光照时长为4-10h。
2.根据权利要求1所述的一种利用复合PAHs降解菌同时去除植物体内USEPA PAHs的方法，其特征在于：所述微生物复合功能菌剂的制备方法为：将各菌种分别培养，然后调整各菌种OD600nm混合制成微生物复合功能菌剂，具体包括以下步骤：
(1)菌悬液的制备：将8株PAHs降解菌在LB固体平板进行活化，用接种环从活化平板挑取各单菌落分别接种于无菌LB液体培养基中，置于30℃、150r/min扩大培养至对数期，培养完成后，8000r/min 4℃离心5min，弃去上清液，加入无菌MSM使菌体混合均匀，再次离心，该操作重复两次，以充分洗去菌体中残留的LB培养基；最后用无菌MSM调整菌悬液浓度OD600nm分别为0.2、0.5、1.0、1.5；
(2)将获得的菌悬液按等体积比混合，制得不同浓度OD600nm复合降解菌储备液，4℃保存备用。
3.根据权利要求1所述的一种利用复合PAHs降解菌同时去除植物体内USEPA PAHs的方法，其特征在于：所述复合功能菌浓度OD600nm为0.2、0.5、1.0、1.5。
4.根据权利要求1所述的一种利用复合PAHs降解菌同时去除植物体内USEPA PAHs的方法，其特征在于：所述复合功能菌悬液浓度OD600nm为0.5。
5.根据权利要求1所述的一种利用复合PAHs降解菌同时去除植物体内USEPA PAHs的方法，其特征在于：所述植物吸收促进剂是由硫酸锰、天冬氨酸、琥珀酸三种成分按照3:4:1的重量比组成的混合物。
6.根据权利要求1所述的一种利用复合PAHs降解菌同时去除植物体内USEPA PAHs的方法，其特征在于：所述植物吸收促进剂是由硫酸锰、天冬氨酸、琥珀酸按照3:4:1的比例组成的混合物。
7.根据权利要求1所述的一种利用复合PAHs降解菌同时去除植物体内USEPA PAHs的方法，其特征在于：所述浸种方式是指，播种前将植物种子在降解剂中浸泡6h；所述喷叶方式是指，待植物长至一定大小时，在成熟前分三次将降解剂喷洒于植物叶片表面。
8.根据权利要求1所述的一种利用复合PAHs降解菌同时去除植物体内USEPA PAHs的方法，其特征在于：所述的降解剂在降解水体、土壤或者植物体内PAHs的应用。
9.根据权利要求8所述的一种利用复合PAHs降解菌同时去除植物体内USEPA PAHs的方法，其特征在于：所述的应用，是指同时去除或降解9种及以上USEPA PAHs。
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