CN102757915A

CN102757915A - 一种氯代乙酰胺类除草剂降解菌及其生产的菌剂和应用

Info

Publication number: CN102757915A
Application number: CN2012102287721A
Authority: CN
Inventors: 何健; 李怡; 陈青; 李顺鹏
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2012-07-02
Filing date: 2012-07-02
Publication date: 2012-10-31
Anticipated expiration: 2032-07-02
Also published as: CN102757915B

Abstract

本发明属于环境污染生物修复领域，公开了一种氯代乙酰胺类除草剂降解菌及其生产的菌剂和应用。鞘酯菌（Sphingobium quisquiliarum）DC-2，2012年5月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2012190。该菌株制备的菌剂能同时降解甲草胺，乙草胺和丁草胺等多种氯代乙酰胺类除草剂，使用本菌剂可在短时间内使土壤和水体环境中甲草胺，乙草胺和丁草胺的残留量降低95％以上，消除农产品中甲草胺，乙草胺和丁草胺残留，解决甲草胺，乙草胺和丁草胺对土壤水体环境、农作物和人体健康的危害问题。

Description

一种氯代乙酰胺类除草剂降解菌及其生产的菌剂和应用

技术领域

本发明属于环境污染生物修复领域，涉及一种氯代乙酰胺类除草剂降解菌及其生产的菌剂和应用。

背景技术

氯代乙酰胺类除草剂是一类高效、高选择性除草剂，因分子结构中具有氯乙酰胺基团而得名。目前主要品种包括乙草胺、丁草胺、甲草胺和异丙甲草胺等，在农业上广泛用于防除一年生禾本科杂草及部分阔叶杂草。氯代酰胺类除草剂是目前国际上大量使用的除草剂之一，目前年产量与使用面积仅次于有机磷除草剂，居世界第二位,且随着农业劳动力的减少和农业耕种方式的改变，该类除草剂的需求和使用量还将持续增加。

氯代乙酰胺类除草剂不易挥发及化学水解，在土壤残留期长达1个月以上，其残留进入环境及农产品对人类健康和环境产生严重的危害，研究表明该类除草剂有些品种具有一定的致畸变和致突变性，乙草胺、丁草胺和甲草胺被美国环保局定为B-2类致癌物，异丙甲草胺被定为C类致癌物(USEAP，1994)。氯代乙酰胺类除草剂对鱼类有很强的毒性，比对哺乳动物的毒性大500-10000倍，如丁草胺对鲤鱼和蓝鳃鱼96h的致死浓度分别仅有0.32mL·kg^-1和0.044mL·kg^-1，因此该类除草剂进入水体将会对渔业资源带来严重的危害。此外，氯代乙酰胺类除草剂如乙草胺和丁草胺对农作物具有较严重的药害，特别是在有机质含量较低的砂型土壤、或用药量过大、或施药后遇持续低温高湿天气时，会严重影响作物的生长，近年来我国因乙草胺和丁草胺因使用不当带来的作物药害时有发生，对农业造成严重的损失。

因此，土壤和水体环境中氯代乙酞胺类除草剂残留污染严重危害人类健康、破坏生态环境及对作物具有严重药害，其在环境中的吸附、迁移、转化和降解等生态行为越来越受到关注。

微生物降解修复技术是近几十年才兴起的一种新型的环境污染修复技术。该技术和物理化学方法相比，具有很多无可比拟的优点，如处理效果好，适合有毒有害有机污染物大面积面源污染的降解修复，修复费用较低（仅为传统化学、物理修复经费的10％左右），不产生二次污染等。在国内外，生物修复技术已经广泛应用于石油、化工和农药残留有机污染的清除。

目前,国内外已经有关于氯代乙酰胺类除草剂微生物降解的报道,但到目前为止还未见能同时降解甲草胺，乙草胺和丁草胺等多种氯代乙酰胺类除草剂生物修复技术专利的研究和应用报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种氯代乙酰胺类除草剂降解菌。

本发明的另一目的是提供该氯代乙酰胺类除草剂降解菌生产的菌剂。

本发明的友谊目的是提供该降解菌的应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

鞘酯菌（Sphingobium quisquiliarum）DC-2，2012年5月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2012190。

一种用所述的鞘酯菌DC-2生产的环境修复菌剂，是通过以下方法生产而成：

1)将保藏编号为CCTCC NO：M 2012190的鞘酯菌DC-2试管种接种于发酵培养基中，振荡培养至对数期；

2)将上述培养好的菌种按1%的接种量接种入种子罐，培养至对数生长期；

3)将种子液按10%的接种量接入生产罐培养；

4)在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1:0.6-1.2，搅拌速度为180-240转/分，培养温度为30℃，全流程培养时间为48-60小时，发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上，发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂；

其中，所述的发酵培养基、种子罐所用的培养基、生产罐所用的培养基相同，配方均为：葡萄糖0.1wt%，NaCl 1.0wt%，蛋白胨0.5wt%，酵母膏0.25wt%，pH7.2-7.5。

所述的保藏编号为CCTCC NO：M 2012190的鞘酯菌DC-2在降解氯代乙酰胺类除草剂中的应用。

优选所述的鞘酯菌DC-2在降解土壤或水体环境中氯代乙酰胺类除草剂中的应用。

所述的氯代乙酰胺类除草剂优选甲草胺,乙草胺和丁草胺中的一种或多种。

所述的由保藏编号为CCTCC NO：M 2012190的鞘酯菌DC-2环境修复菌剂在降解氯代乙酰胺类除草剂中的应用。

优选所述的环境修复菌剂在降解土壤或水体环境中氯代乙酰胺类除草剂中的应用。

有益效果：

本发明筛选获得一株鞘酯菌（Sphingobium quisquiliarum）DC-2（CCTCC NO：M2012190），该菌株制备的菌剂能同时降解甲草胺，乙草胺和丁草胺等多种氯代乙酰胺类除草剂，使用本菌剂可在短时间内使土壤和水体环境中甲草胺，乙草胺和丁草胺的残留量降低95％以上，消除农产品中甲草胺，乙草胺和丁草胺残留，解决甲草胺，乙草胺和丁草胺对土壤水体环境、农作物和人体健康的危害问题。

本发明描述的环境修复菌剂可以用发酵工业通用发酵设备进行生产，具有生产成本低，使用方便，去除效果好的优点，适合治理土壤和水体环境中甲草胺，乙草胺和丁草胺造成的污染。本发明对于保护生态环境，降低除草剂对农作物药害，保护人民的身体健康，提高农产品的附加值具有重要的意义。

附图说明

图1菌株DC-2菌落照片和电镜照片

A图为菌株DC-2菌落照片，B图为菌株DC-2电镜照片。

生物材料保藏信息

氯代乙酰胺类除草剂降解菌DC-2（Sphingobium quisquiliarum DC-2），保存在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址为中国武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2012190，保藏日期为2012年5月30日。

具体实施方式

实施例1菌株的分离和鉴定

用来富集氯代乙酰胺类除草剂降解菌株的富集基质取自江苏昆山市绿利来农药厂农药废水生化处理池的活性污泥，取活性污泥5.0g加入100ml基础盐培养基中，加入50mg·L^-1的丁草胺，30℃，180r·min^-1培养7d天，以5%的接种量转接到相同的培养基中，连续转接3次，梯度稀释富集液，取10^-4～10^-7稀释度的富集液各0.1mL涂布于加有100mg·L^-1丁草胺的固体培养基平板上，30℃培养4d后，挑取长出的单菌落接种于分别含100mg·L^-1各种氯代乙酰胺类除草剂（丁草胺、乙草胺、甲草胺和异丙甲草胺）的培养基中，30℃，180r·min^-1摇床培养5d，验证其降解效果。基础盐培养基配方为：5.0g葡萄糖,1.0g NH₄NO₃,1.0g NaCl,1.5g K₂HPO₄, 0.5g KH₂PO₄,0.2g MgSO₄·7H₂O.加水至1L，pH 7.0.固体培养基加15.0g琼脂。

降解效果的验证方法：在培养液中加入等体积的二氯甲烷进行全量提取，剧烈振荡后静置分层，然后取1ml下层二氯甲烷挥发完全后，加入1mL甲醇溶解(色谱纯)，用滤膜(孔径0.22μm)过滤。采用紫外和高效液相色谱测定提取液中丁氯代乙酰胺类除草剂的含量，液相色谱条件：流动相为甲醇：水(80：20，V/V)，Zorbax C218 ODS Spherex反相柱(5μm，4.6mm×250mm，Agilent，USA)，柱温为室温，紫外检测器，测定波长230nm，进样量20μL，流速为0.8mL·min^-1。外标法按峰面积定量。另外还可采用气相色谱检测提取液中氯代乙酰胺类除草剂的含量，检测方法：柱型：BD-5MS石英毛细管柱(15m×0.25mm×0.25μm)；样品进样量：2μL；分流比：30；载气：氦气；载气流速1ml/min；进样口温度为230℃，柱温为200℃。一级质谱条件：离子检测方式为多反应离子检测；离子极性为负离子；离子化方式为电喷雾离子化；毛细管电压为4000伏；干燥气温度：330℃；干燥气流速：10.0L/min，雾化气压力：35psi，碰撞电压：135伏；质量扫描范围（m/z）：300-500。二级子离子质谱条件：碰撞电压：90伏；质量扫描范围（m/z）：30-400。

从富集液中，分离到1株氯代乙酰胺类除草剂降解菌，命名为DC-2。菌株DC-2降解丁草胺、乙草胺和甲草胺前后的有机相提取液紫外扫描和液相色谱检测结果表明菌株DC-2能降解丁草胺、乙草胺和甲草胺。菌株DC-2在固体培养基上生长3d后，菌落表面光滑，有光泽，边缘整齐，隆起，呈淡黄色，经过负染，在透射电子显微镜下该菌呈杆状，无鞭毛，无荚膜，不形成芽孢（图1）。G^-，菌体为短杆状，大小为0.5-1.0×1.0-1.5μm。好氧生长，具有过氧化氢酶和氧化酶活性，V.P.反应为阳性，甲基红反应为阴性，产黄色色素，菌体周围产荚膜，能利用葡萄糖、半乳糖和木糖糖氧化产酸。菌株DC-2的形态和生理生化特征和Bergey′s manual of systematic bacteriology上对鞘酯菌属的描述是一致的。

以菌株DC-2的基因组DNA为模板，用细菌16S rRNA基因序列通用引物进行PCR扩增，得到长度约为1400bp的16S rRNA基因序列（Genbank登录号为EU781657.1）。在RDP数据库(https://rdp.cme.msu.edu/)中进行Blast，结果表明菌株DC-2与鞘脂菌属（Sphingobium）菌株的同源性最近，与模式菌株Sphingobium quisquiliarum P25的同源性为100％。结合生理生化特征将该菌鉴定为鞘酯菌属(Sphingobium quisquiliarum)，将该菌株送交位于中国武汉，武汉大学的中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC）保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 2012190，保藏日期为2012年5月30日。

实施例2修复菌剂的发酵

使用上述菌株DC-2生产修复菌剂的工艺为：斜面种—摇瓶种子液—种子罐—产品（包装剂型为液体菌剂）。

1）将DC-2（CCTCC NO：M 2012190）试管种接种于发酵培养基中，振荡培养至对数期；

2）将上述培养好的菌种按10%（v/v,以培养基体积为基准）的接种量接种入装液量为70%（v/v，以发酵罐体积为基准，下同）的500升种子罐，培养至对数生长期；

3）将种子液按10%（v/v,以培养基体积为基准，下同）的接种量接入装液量为70%的生产罐培养；

4）在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1:1.0，搅拌速度为220转/分，培养温度为30℃，全流程培养时间为50小时，发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上，发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂。

以上所用的发酵培养基、种子罐培养基及生产罐培养基相同，配方为：葡萄糖0.1wt%，蛋白胨0.5wt%，酵母膏0.25wt%，pH7.2-7.5。

实施例3培养基中DC-2对氯代乙酰胺类除草剂生物降解实验

在基础盐培养基（同实施例1）中加入终浓度为100mg/L的甲草胺，乙草胺和丁草胺，1％的接种量接入DC-2（CCTCC NO：M 2012190）菌液，设接种灭活的DC-2（CCTCC NO：M 2012190）对照，30℃恒温培养箱中培养。定时取样检测菌株对甲草胺，乙草胺和丁草胺的降解情况，结果见表1。菌株DC-2（CCTCC NO：M 2012190）在3天内对甲草胺，乙草胺和丁草胺的降解率分别达到93.4％、96.7％和90.5％，5天内对甲草胺，乙草胺和丁草胺的降解率分别达到98.2％、99.6％和95.7％。

表1菌株DC-2在培养基中对甲草胺，乙草胺和丁草胺解效果

实施例4菌株DC-2在土壤中对氯代乙酰胺类除草剂的降解试验

采取菜园土作为供试土样。将土样过2mm筛，取一定量的甲草胺，乙草胺和丁草胺乳油溶于10ml丙酮中，然后将其均匀拌入500g土壤中，使土壤中乙草胺的甲草胺，乙草胺和丁草胺终浓度均为50mg/kg。新鲜的DC-2（CCTCC NO：M 2012190）培养液（制备方法参见实施例2）5，000rpm离心5min后，收集菌体，用无菌去离子水洗涤3次后再用无菌水悬浮，调节菌体浓度约为1.0×10⁹cfu mL^-1。以10%的接种量接入到上述土壤中。于30℃恒温培养箱中培养，不接菌的作为对照，期间土壤的持水量保持在60%。培养10天后，利用液相色谱测定残留量。土壤中残留的甲草胺，乙草胺和丁草胺的检测方法参照前面所述。测定结果如表2。

从表2可以得出，菌株DC-2在5天内对甲草胺，乙草胺和丁草胺的降解率分别达到64.5％、55.8％和51.3％，10天内对甲草胺，乙草胺和丁草胺的降解率分别达到96.3％、97.3和95.9％。

表2菌株DC-2在土壤中对甲草胺，乙草胺和丁草胺的降解

Claims

1.鞘酯菌（Sphingobium quisquiliarum）DC-2，2012年5月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2012190。

2.一种用权利要求1所述的鞘酯菌DC-2生产的环境修复菌剂，其特征在于是通过以下方法生产而成：

1)将保藏编号为CCTCC M2012190的鞘酯菌DC-2试管种接种于发酵培养基中，振荡培养至对数期；

3)将种子液按10%的接种量接入生产罐培养；

其中，所述的发酵培养基、种子罐所用的培养基、生产罐所用的培养基相同，配方均为：葡萄糖0.1wt%，NaCl1.0wt%，蛋白胨0.5wt%，酵母膏0.25wt%，pH7.2-7.5。

3.权利要求1所述的鞘酯菌DC-2在降解氯代乙酰胺类除草剂中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的鞘酯菌DC-2在降解土壤或水体环境中氯代乙酰胺类除草剂中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述的氯代乙酰胺类除草剂选自甲草胺,乙草胺和丁草胺中的一种或多种。

6.权利要求2所述的环境修复菌剂在降解氯代乙酰胺类除草剂中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于权利要求2所述的环境修复菌剂在降解土壤或水体环境中氯代乙酰胺类除草剂中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述的氯代乙酰胺类除草剂选自甲草胺,乙草胺和丁草胺中的一种或多种。