CN113801805B

CN113801805B - 一种能同时降解手性除草剂喹禾灵两种异构体的菌株及其应用

Info

Publication number: CN113801805B
Application number: CN202110685560.5A
Authority: CN
Inventors: 张龙; 宋嫚; 李峰; 毛振波; 王光利; 刘远
Original assignee: Huaibei Normal University
Current assignee: Huaibei Normal University
Priority date: 2021-06-21
Filing date: 2021-06-21
Publication date: 2023-03-14
Anticipated expiration: 2041-06-21
Also published as: CN113801805A

Abstract

本发明公开了一种能同时降解手性除草剂喹禾灵两种异构体的菌株及其应用。菌株S1经鉴定为Brevundimonas sp.，2021年5月24日寄存于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC M 2021604。本发明所述的降解菌株S1可广谱降解芳氧苯氧丙酸酯类除草剂喹禾灵两种异构体以及精喹禾灵、吡氟禾草灵、精吡氟禾草灵或精恶唑禾草灵等，降解菌剂产品可使土壤中(R,S)‑QE等残留量降低88.6％以上，可有效解决了农业生产过程中芳氧苯氧丙酸酯类除草剂在土壤和水体环境中污染和对作物药害等问题，保护生态环境。

Description

一种能同时降解手性除草剂喹禾灵两种异构体的菌株及其应用

技术领域

本发明涉及一种能同时降解手性除草剂喹禾灵两种异构体的降解菌株及其生产的菌剂，属于生物高技术领域，是利用微生物高效降解除草剂的残留，适用于土壤、水体、污泥的微生物强化修复。

背景技术

化学农药(包括除草剂、杀菌剂和杀虫剂)的广泛使用为农业的增产保收起到了不可替代的重要作用，其中化学除草剂的使用量已位居第一。据统计，我国常用农药中，约有40％的化学农药具有手性结构(化合物的分子结构与其镜像不能互相重叠)，而其中具有手性结构的除草剂(手性除草剂)占比巨大。研究表明，手性除草剂在药效、环境安全性等方面存在不可忽视的对映异构体差异。而且，其异构体间还可能具有不同的生物活性和生态毒理。例如，手性化合物“反应停”(沙利度胺)曾给人类留下惨痛教训。R-沙利度胺有镇静作用，可治疗怀孕期间的孕吐反应，而S-沙利度胺有很强的致畸作用，曾导致大量畸形儿的产生。然而，大多数手性除草剂至今仍是以外消旋体(具有旋光性的手性分子与其对映体的等摩尔混合物)形式生产和施用，不可避免地导致手性除草剂的不同异构体同时进入到生物体、土壤和水体等环境体系中。因此，手性除草剂在环境中的消亡已受到广泛关注。

喹禾灵(Quizalofop-ethyl，QE)，又名(RS)-2-(4-(6-氯-2-喹喔啉氧基)苯氧基)丙酸乙酯，是全世界广泛使用的芳氧苯氧丙酸酯类手性除草剂之一。QE通过抑制乙酰辅酶A羧化酶活性使杂草死亡，主要用于阔叶作物田防除禾本科杂草。商品化使用的喹禾灵是由(R)-构型[(R)-QE](商品名为精喹禾灵)和(S)-构型[(S)-QE]的喹禾灵等摩尔混合的外消旋体，其除草活性主要来源于(R)-构型。喹禾灵虽为低毒性除草剂，但其在环境中的残留会对后茬作物产生药害，影响非靶标生物的生态安全。已有研究表明(R)-QE可损伤大鼠睾丸生殖细胞，具有雄性生殖毒性。而(S)-型对映体虽然没有除草活性，但两种异构体在环境中存在相互转化的现象。因此，喹禾灵不同手性异构体在环境中残留动态引起广泛关注。人们迫切希望有一种切实可行方法，可以有效的去除环境中的QE残留。

微生物是促使化学农药在环境中代谢消亡的主力军。而且，由于数量巨大、种类繁多、繁殖迅速、对环境适应性强以及不易产生二次污染等特点，被广泛应用于治理除草剂污染的土壤、水体甚至是农产品除草剂残留的祛除中。利用微生物的新陈代谢作用，对易残留的除草剂进行转化，使其无毒化，也是目前研究的热点。

发明内容

本发明针对环境修复的实际问题和需求，提供一株能同时降解手性除草剂喹禾灵两种异构体的降解菌株。

本发明的另一目的是提供该降解菌株制备的菌剂。

本发明的又一目的是提供该降解菌剂的制备方法和应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

本发明提供一种(R,S)-QE高效降解菌株S1(2021年5月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO：M 2021604)。菌株S1的形态学特征为：在LB平板上呈橙黄色菌落，菌落凸起，表面湿润，光滑，边缘整齐，不透明(图1A)。主要生物学特性为：G^－，菌体为短杆状(0.7μm×1.1μm)，无鞭毛(图1B)，好氧；过氧化氢酶、氧化酶和吲哚反应阳性；V.P.反应为阴性；不能水解淀粉，使石蕊牛乳酸凝固。经16S rRNA测序比对并结合其生理生化特性，初步将菌株S1鉴定为Brevundimonas sp.(图2)。实验室摇瓶培养条件下，菌株S1可在96h内完全降解30mg/L的(R,S)-QE(图3)。该菌株可以用发酵工业通用发酵设备进行生产。

本发明所述的降解菌株S1在制备降解芳氧苯氧丙酸酯类除草剂两种异构体的菌剂中的应用；所述的芳氧苯氧丙酸酯类除草剂选自(R,S)-QE、精喹禾灵、吡氟禾草灵、精吡氟禾草灵或精恶唑禾草灵中的任意一种或多种，进一步优选(R,S)-QE和精喹禾灵。

一种用本发明所述的降解菌株生产的农药残留降解菌剂，由本发明所述的降解菌株发酵制得。

本发明所述的降解菌剂，优选通过以下方法生产而成：

(1)将(R,S)-QE降解菌株S1的试管种接种于LB培养基摇瓶中，振荡培养至对数期；

(2)将上述培养好的菌种按10％的接种量接种入种子罐，培养至对数生长期，种子罐所用的培养基配方为：葡萄糖8g/L，酵母膏5g/L，K₂HPO₄ 1g/L，NaCl 5g/L，CaCO₃ 2g/L，MgSO₄ 0.2g/L，大豆油0.1％(v/v)，pH值7.2-7.5；

(3)将种子液按10％的接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基与种子罐培养基相同；

(4)在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1:0.6-1.2，搅拌速度为180-240rpm，培养温度为30-35℃，全流程培养时间为96-108小时,发酵结束后菌体数量达到10亿个/mL以上,发酵液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型或采用泥炭吸附用包装袋分装成固体菌剂剂型。

一种制备本发明所述的降解菌剂的方法，包含以下步骤：

本发明所述的降解菌剂在降解芳氧苯氧丙酸酯类除草剂中的应用。

本发明所述的芳氧苯氧丙酸酯类除草剂降解菌株S1在降解芳氧苯氧丙酸酯类除草剂中的应用，优选在降解土壤中芳氧苯氧丙酸酯类除草剂中的应用。

其中，所述的芳氧苯氧丙酸酯类除草剂优选手性除草剂(R,S)-QE、精喹禾灵、吡氟禾草灵、精吡氟禾草灵或精恶唑禾草灵中的任意一种或多种，进一步优选(R,S)-QE和精喹禾灵。

有益效果

本发明提供一株能够高效、快速降解芳氧苯氧丙酸酯类手性除草剂(R,S)-QE的细菌S1。降解菌株S1具有广泛的降解谱，能降解芳氧苯氧丙酸酯类手性除草剂(R,S)-QE和吡氟禾草灵的外消旋体，以及其商品化的(R)-型异构体精喹禾灵、精吡氟禾草灵或精恶唑禾草灵等，并能在96小时内完全降解30mg/L的(R,S)-QE，具有广泛的应用潜力和价值。使用该细菌生产的降解菌剂具有生产使用成本低，使用方便，去除效果好的优点。适合在农业生产区或有绿色食品商标标志的地方大面积推广使用。本发明对于保护生态环境，保护人民的身体健康，提高农产品的附加值具有重要的意义。使用该降解菌剂可以在农作物播种前正常使用化学农药进行杂草防治而保证农产品中农药残留含量符合绿色食品要求。

本发明成功地解决了农业生产中农药残留超标问题，既充分发挥了化学农药在植物病虫害防治中的高效快速的作用，又可以成功治理芳氧苯氧丙酸酯类手性除草剂残留污染的土壤和水环境，保护生态环境。

附图说明

图1菌株S1的菌落照片(A)和电镜照片(B)

图2菌株S1的16S rRNA基因系统发育分析

图3菌株S1对(R,S)-QE的降解

图4菌株S1降解(R,S)-QE的液相检测图(A)及其破碎粗酶液的降解效果图(B)

图5菌株S1对(R,S)-QE不同异构体的选择性降解液相检测图

图6温度对菌株S1降解(R,S)-QE的影响

图7初始pH对菌株S1降解(R,S)-QE的影响

图8接种量对菌株S1降解(R,S)-QE的影响

图9菌株S1底物谱的紫外检测效果图

生物材料保藏信息

S1，分类命名为Brevundimonas sp.，保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO：M 2021604，保藏日期为2021年5月24日，保藏地址为湖北省武汉市，武汉大学。

具体实施方式

实施例1、菌株的分离与鉴定

本发明提供一种能高效降解手性除草剂(R,S)-QE两种手性异构体的菌株及其生产的菌剂，所用菌株为革兰氏染色阴性菌株S1，分离自江苏南京某废弃农药厂厂区的土壤中。菌株具体的分离筛选方法为：

取土样10.0g加入到100mL含有30mg/L(R,S)-QE的液体无机盐培养基(以下简称MSM)，30℃、180rpm摇床培养7d，以15％接种量(v/v)转接至新鲜的相同培养基中，连续富集传代培养四次。利用紫外分光光度计在200-350nm范围内扫描，检测第五代富集液的降解效果。将有效果的富集液在含有30mg/L(R,S)-QE的LB固体培养基上稀释涂布，30℃培养5d，挑取平板上的单菌落于3mL液体LB试管培养基中，然后保存并转接至20mL含有30mg/L(R,S)-QE的MSM培养基中，30℃培养5d。随后用等体积的二氯甲烷进行萃取，紫外分光光度计检测效果，从而获得(R,S)-QE降解菌株。

2021年5月24日寄存于中国典型培养物保藏中心,菌种保藏号为CCTCC NO：M2021604，经鉴定属于Brevundimonas sp.。主要生物学特性为G^－，菌体为短杆状，大小约0.7μm宽,1.1μm长，无鞭毛(图1B)，好氧；过氧化氢酶、氧化酶和吲哚反应阳性；V.P.反应为阴性；不能水解淀粉，使石蕊牛乳酸凝固。将菌株S1的16S rRNA基因序列在数据库EzBioCloud中比对分析，结果显示菌株S1与Brevundimonas属亲缘关系最近，其中与BrevundimonasvesicularisNBRC 12165^T和Brevundimonas nasdae GTC 1043^T的16S rRNA序列一致性最高，均为99.49％，与Brevundimonas intermedia ATCC 15262^T的16S rRNA序列一致性99.28％。结合菌株的菌落形态特征、生理生化特性以及16S rRNA基因比对分析。最终将菌株S1初步鉴定为Brevundimonas属(图2)。

实施例2、实验室降解实验

2.1种子液制备

将菌株S1接入100 mL LB培养基中，30℃、180 rpm摇床培养，48 h后6,000 rpm离心收集菌体，使用灭菌的MSM洗涤菌体两次，最后用10 mL灭菌的MSM重悬，作为种子液备用。

2.2菌株S1对手性除草剂(R,S)-QE的降解

将菌株S1按5％的接种量接至含有30 mg/L(R,S)-QE的100 mL MSM中，30℃、180rpm摇床培养，每隔12小时取样3 mL，取至第4天。检测(R,S)-QE残留量，计算降解率，绘制菌株S1对手性除草剂(R,S)-QE的时间-降解曲线。如图3，菌株S1能在96 h内完全降解30mg/L的(R,S)-QE。液相色谱检测结果显示，菌株S1可以降解(R,S)-QE同时积累一种代谢产物(图4A)。同时，菌株S1的粗酶液降解实验结果显示，其粗酶液可以在加有30 mg/L(R,S)-QE的琼脂糖平板上产生透明圈(图4B)。

高效液相色谱法检测手性除草剂(R,S)-QE：取3 mL待测样品，加入等体积的二氯甲烷进行萃取，漩涡震荡2 min后静置。待水相与有机相呈现明显分层，去除上层水相，并向下层有机相中加入过量无水硫酸钠以彻底除去残余水分。然后吸取2 mL处理完毕的有机相到离心管中并将其放置于通风橱，直至二氯甲烷挥发完全，随后向离心管中加入350μL甲醇，震荡混匀，用直径为0.22μm的有机相滤器过滤后在液相色谱仪上检测。液相色谱检测条件：仪器，Shimadzu LC-20A(Shimadzu corporation)；手性色谱柱，Superchiral S-AD(Chiralway BiotechCo.,ltd.),0.46 cm I.D.*15 cm Length,5μm；柱温设定为40℃；流动相，正己烷：异丙醇：三氟乙酸＝90:10:0.05(v/v/v)，流速设定为0.9 mL/min；紫外检测器检测波长，230 nm；进样量，10μL。根据标曲的锋面积计算含量。非手性色谱柱的液相色谱检测条件：Thermo scientific^TMAcclaim^TM 120 C18反相柱(4.6×250 mm,5μm,

)，流动相为甲醇：水：乙酸(80：20：0.5，v/v/v)，流速1 mL/min，柱温40℃，进样量20μL，紫外检测波长为230 nm。

配备手性色谱柱的液相检测结果显示，菌株S1降解(R,S)-QE具有明显的手性选择性，菌株S1降解(R)-QE速率显著大于(S)-QE(图5)。

2.3温度对菌株S1降解(R,S)-QE的影响

在添加(R,S)-QE终浓度为30mg/L的MSM培养基中，按5％接种量接入菌株S1的种子液，分别于4、16、25、30、35、37和45℃条件下，180rpm摇床培养，3d后取样检测(R,S)-QE的残留量，计算降解率，确定温度对菌株S1降解(R,S)-QE的影响。图6所示，菌株S1在30℃时对(R,S)-QE的降解率最高。

2.4初始pH对菌株S1降解(R,S)-QE的影响

在初始pH分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0的MSM培养基中，加入30mg/L的(R,S)-QE，按5％接种量接入菌株S1的种子液，于30℃、180rpm摇床培养，3d后取样检测(R,S)-QE的残留量，计算降解率，确定pH对菌株S1降解(R,S)-QE的影响。以不接种降解菌株的为对照。由图7所示，菌株S1在pH 7.0时对(R,S)-QE的降解效果最好；在pH 6.0-8.0的范围内均能较好的降解(R,S)-QE；而当pH小于5.0和pH大于9.0时，其降解能力明显下降。

2.5接种量对菌株S1降解(R,S)-QE的影响

按1％、3％、5％、8％、10％与12％的接种量分别接入含30mg/L(R,S)-QE的MSM培养基中，30℃、180rpm摇床培养，48h时测定一次(R,S)-QE的含量。由图8所示，接种量的大小对(R,S)-QE的降解效率有直接的关系，接种量越大，(R,S)-QE的降解效率就越高。

2.6菌株S1的底物谱

按5％接种至分别含30mg/L不同底物[(R,S)-QE、精喹禾灵、精恶唑禾草灵、吡氟禾草灵和精吡氟禾草灵的MSM培养基中，于30℃、180rpm摇床培养5d后，高效液相色谱检测不同底物的降解情况(图9)。结果显示菌株S1可以降解(R,S)-QE、精喹禾灵、精恶唑禾草灵、吡氟禾草灵和精吡氟禾草灵。

实施例3、土壤降解实验

采取菜园土作为供试土样。将土样过2mm筛，分别取一定量的(R,S)-QE、精恶唑禾草灵和精吡氟禾草灵粉剂溶于10mL丙酮中，然后浸泡硅藻土，使农药被完全吸附。浸泡后的硅藻土置于通风橱中吹干，将其拌入土壤中，使土壤中农药的浓度约为30mg/kg。每一种土样各取500g于30℃恒温培养箱中培养，按10％的接种量接入S1种子液，以不接菌的作为对照，土壤的持水量保持在60％。培养7天后，每种处理每次取3个样品，每个样品重20g。样品用两倍体积的二氯甲烷作为提取液，放于机械振荡器中振荡2h(30℃,200rpm)。待振荡结束，去下层有机相，合并萃取液至旋转蒸发浓缩仪中浓缩后氮吹至干。用l mL甲醇定容，过0.22μm的有机相微孔滤膜，然后HPLC检测，测定三种化合物的残留量。

从表1可以得出，经过7天培养，菌株S1对(R,S)-QE、精恶唑禾草灵和精吡氟禾草灵的降解率分别达到88.6％、85.5％和83.6％。以上结果说明，菌株S1在施入土壤中后，没有出现不降解或降解效率急剧下降的现象，其降解性能稳定，这就为菌株S1对(R,S)-QE、精恶唑禾草灵和精吡氟禾草灵污染土壤的修复提供了科学依据。

表1菌株S1在土壤中对相关农药的降解

本发明的详细实施步骤为：

将本发明的手性除草剂(R,S)-QE降解菌株S1的原种在试管斜面上活化，并测定降解性能，然后接种于试管斜面上备用。试管种接种于含200mL LB培养基(LB培养基配方：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠5g，水1L，pH 7.4)的1000mL摇瓶中，恒温振荡培养至对数期，准备接种一级种子罐。一级种子罐50L，投料量40L，培养基配方为：葡萄糖8g/L，酵母膏5g/L，K₂HPO₄ 1g/L，NaCl 5g/L，CaCO₃ 2g/L，MgSO₄ 0.2g/L，大豆油0.1％(v/v)，pH值7.2-7.5。

投料完毕后121℃高压湿热灭菌，冷却至30℃后，将上述培养好的摇瓶菌种按10％的接种量接种入50L一级种子罐，培养至对数生长期(约98小时)，搅拌速度为220rpm，无菌空气通入量为1：0.8。将到达对数期的种子液按10％的接种量接入二级种子罐。二级种子罐500L，投料量400L，培养基配方和培养条件与一级种子罐一致。将到达对数期的种子液按10％的接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基成分与种子罐培养基相同。生产罐容量5吨，投料量4.5吨。投料后的生产罐1.1kg/cm²的压力下，121℃高压湿热灭菌，灭菌后冷却至30℃，通无菌空气保持无菌状态备用。接种后的生产罐温度控制在30-35℃，生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1：1.0，搅拌速度为240rpm，整个工艺流程培养时间为100小时。发酵结束后菌体数量达到10亿个/mL以上。

发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型或采用泥炭吸附用包装袋分装成固体菌剂剂型。

Claims

1. 一株短波单胞菌Brevundimonas sp. S1，其特征在于，2021年5月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO:M 2021604。

2.权利要求1所述的短波单胞菌Brevundimonas sp. S1在制备降解芳氧苯氧丙酸酯类除草剂的菌剂中的应用；所述的芳氧苯氧丙酸酯类除草剂选自(R, S)-喹禾灵、精吡氟禾草灵或精恶唑禾草灵中的任意一种或多种。

3.权利要求1所述的短波单胞菌Brevundimonas sp. S1在降解芳氧苯氧丙酸酯类除草剂中的应用,所述的芳氧苯氧丙酸酯类除草剂选自(R, S)-喹禾灵、精吡氟禾草灵或精恶唑禾草灵中的任意一种或多种。

4.一种用权利要求1所述的短波单胞菌Brevundimonas sp. S1生产的农药残留降解菌剂，其特征在于由权利要求1所述的短波单胞菌Brevundimonas sp. S1发酵制得,所述的农药选自(R, S)-喹禾灵、精吡氟禾草灵或精恶唑禾草灵中的任意一种或多种。

5.根据权利要求4所述的降解菌剂，其特征在于通过以下方法生产而成：

（1）将权利要求1所述的短波单胞菌Brevundimonas sp. S1的试管种接种于LB培养基摇瓶中，振荡培养至对数期；

（2）将上述培养好的菌种按10 %的接种量接种入种子罐，培养至对数生长期，种子罐所用的培养基配方为：葡萄糖 8 g/L，酵母膏5 g/L，K₂HPO₄1 g/L，NaCl 5 g/L，CaCO₃ 2 g/L，MgSO₄ 0.2 g/L，大豆油0.1 %（v/v），pH值7.2-7.5；

（3）将种子液按10 %的接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基与种子罐培养基相同；

（4）在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1: 0.6-1.2，搅拌速度为180-240 rpm，培养温度为30-35 ℃，全流程培养时间为96-108小时, 发酵结束后菌体数量达到10亿个/mL以上, 发酵液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型或采用泥炭吸附用包装袋分装成固体菌剂剂型。

6.一种制备权利要求4所述的农药残留降解菌剂的方法，其特征在于包含以下步骤：

（1）将所述的短波单胞菌Brevundimonas sp. S1的试管种接种于LB培养基摇瓶中，振荡培养至对数期；

7.权利要求4所述的农药残留降解菌剂在降解芳氧苯氧丙酸酯类除草剂中的一种或多种中的应用;所述的芳氧苯氧丙酸酯类除草剂选自(R, S)-喹禾灵、精吡氟禾草灵或精恶唑禾草灵中的任意一种或多种。