CN108277181A - 一株单孢属菌j3及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株单孢属菌J3及其应用，该菌株已于2017年11月27日保存于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址为中国武汉，武汉大学，保藏号为CCTCC M 2017739。本发明提供的单孢属菌(Brevundimonas naejangsanensis)J3在无机盐培养基中5d对菌核净(50.0mg/L)的降解率达到51.65％，7d菌核净降解60.27％。这表明该菌株能够高效降解菌核净，可有效修复菌核净污染的土壤和水体，解决农产品生产中农药残留超标问题及环境污染问题，保护生态环境和人类健康。

Description

一株单孢属菌J3及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其是涉及一株单孢属菌J3及其应用。

技术背景

菌核净(Dimetachlone)，又称纹枯利，分子式C₁₀H₇C_l2NO₂，其相对分子 质量244.07，化学名为：N-(3,5-二氯苯基)丁二酰亚胺。菌核净纯品为白色鳞 片状结晶，原药为浅黄色粉末状。菌核净的熔点在137.5-139℃范围内，易溶于 四氢呋喃、丙酮、二甲基亚砜等有机溶剂，可溶于甲醇、乙醇，难溶于正己烷、 石油醚，几乎不溶于水。因其在常温下贮藏时有效成分的含量变化很小，对酸、 热较为稳定，但遇碱及光照条件下则相对不稳定，易分解，故应贮藏于遮光阴凉 的地方，且避免与强碱性药物混用。

菌核净为丁二酰亚胺有机杂环类强效杀菌剂，对烟草赤星病、油菜和芹菜菌 核病等病害具有良好的防治效果，在我国应用范围广泛。由于菌核净对哺乳动物 内分泌具有干扰作用，对人体肾脏也有毒害作用，该杀菌剂在环境中，尤其是农 产品中的残留已引起人们的高度关注。因此，消除或减少菌核净在环境及农产品 中的残留已引起科研工作者的高度重视，已成为一个重要的研究课题。

最近几年来，生物修复(Bioremediation)理论渐渐成为大家关注的焦点，生 物修复技术因其操作简便、经济实用、环境友好等优点已成为处理环境中有机污 染物的有效措施。国际上已有利用生物技术成功治理石油污染的先例。近年来， 研究利用生物修复技术治理农药残留污染已成为研究热点。目前许多发达国家和 大公司都投入巨资以从事农药残留生物降解制剂的研究和开发，如美国BCI公 司、美国工程服务生物修复公司已经成功将降解制剂产品规模化生产，国内的北 京佳农新贸易发展有限公司已经成功生产“比亚”生物降解制剂可以用于去除有 机磷类农药残留。但是，由于农药结构多样性，而微生物降解农药往往具有很强 的针对性，导致现有降解菌资源库远不能满足农药残留污染生物修复的实际需 求。目前还没有专门针对菌核净的降解微生物及其相关降解制剂产品。因此，有 针对性的筛选有效降解菌株，研究微生物修复剂，通过人工接种加速环境中杀虫 剂的降解，消除残留药害是一项十分必要的工作和切实可行的途径。

发明内容

本发明的目的：提供一株单孢属菌J3及含有该菌株的生物菌剂的应用。

本发明的另一目的是提供该菌株在降解菌核净农药残留中的应用。

本发明是这样实现的：单孢属菌J3，其保藏号为CCTCC M 2017739。

该菌株16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

含有该菌株单孢属菌J3生物菌剂，即将单孢属菌J3的菌株作为活体成分， 制备获得的液体菌剂。

含有该菌株单孢属菌J3生物菌剂，即将单孢属菌J3的菌株作为活体成分， 制备获得的固体菌剂。

单孢属菌J3在降解菌核净农药残留中的应用。

采用单孢属菌J3生产降解菌液体制剂的方法，将单孢属菌J3的菌株作为活 体成分，制备获得降解菌核净的液体菌剂。

采用单孢属菌J3生产降解菌液体固体制剂的方法，将单孢属菌J3的菌株作 为活体成分，制备获得降解菌核净的固体菌剂。

本发明所提供的细菌是单孢属菌(Brevundimonas naejangsanensis)J3，所述 菌株已于2017年11月27日保存于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址为 中国武汉，武汉大学，保藏号为CCTCC M 2017739。

本发明的这种菌株经形态学特征、生理生化特性、16S rDNA序列分析鉴定 为单孢属菌(Brevundimonas naejangsanensis)，该菌株在牛肉膏蛋白胨固体培养 基中生长迅速，呈细密的圆形或椭圆形，质地软，稍有光泽的淡黄色菌落，不粘 稠易挑取。通过生理生化特性测定，显示该菌株对常见的抗生素，如阿米卡星、 亚胺培南、左氧氟沙星、美诺培南、哌拉西林、复方新诺明、头孢噻肟、头孢他 啶表现为敏感；降解菌对头孢吡肟、环丙沙星及氯霉素表现为中度敏感；对氨曲 南、头孢唑啉、庆大霉素则表现为不敏感。该菌株能直接利用L-谷氨酸、精氨 酸、L-亮氨酸，对其它碳源则不能直接利用。

本发明筛选获得一株单孢属菌(Brevundimonas naejangsanensis)J3，该菌株 可在短时间内有效降解菌核净残留，保护生态环境和人类健康，且使用方便，成 本低，5d菌核净去除率为51.65％，7d菌核净去除率达60.27％，可用于修复菌 核净污染的水体、土壤等自然环境，解决农业生产中杀虫剂残留超标问题及环境 污染问题，保护生态环境和人类健康。使用单孢属菌J3生产制备得到的菌剂， 具有生产成本低，使用方便，去除效果好等优点，适合治理水体和土壤等环境中 菌核净造成的污染，具有非常重要的理论和应用价值。

附图说明

图1为单孢属菌J3的在平板培养基的形态图；

图2为菌核净标准品色谱图；

图3为单孢属菌J3对菌核净(50mg/L)的降解率；

图4为单孢属菌J3固体制剂。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但不作为对本发明的任何限制。

实施例1：单孢属菌J3的分离与鉴定

1)单孢属菌J3的分离与筛选

称取长期受菌核净污染的土壤10.0g置于250mL三角瓶中，并加入100mL 的灭菌无机盐培养基，添加农药标样至25mg/L，置于摇床，在30℃，150rpm 的条件下震荡培养5d。从培养液中取0.5mL上清液于新的含25mg/L农药的无 机盐培养液中，在同样条件下培养至培养液变浑浊，再取上清液按10％接种量接 种于新的培养液，重复以上操作，并逐级提高农药的浓度至1000mg/L(农药浓 度分别为25mg/L、50mg/L、75mg/L、100mg/L、1000mg/L)，得到富集降解 菌液。

富集培养结束后，取培养体积的20％，10000rpm离心5min收集菌体，然 后分别转接到无机盐基础培养基(MSM)中，添加菌核净至浓度为100mg/L， 相同培养条件下再分别驯化两周。在固体培养基中加入菌核净标准液，使其浓度 达到100mg/L。将驯化后的培养液用无菌水逐级稀释，取稀释等级为10^-2、10^-3、 10^-4的培养液于含菌核净的固体平板中均匀涂布，25℃培养。

待25℃条件下恒温倒置培养的无机盐培养基上的菌落长出，选择菌落疏密 适当的平板进行观察，选取颜色不同、边缘不同、光滑程度不同的单菌落在固体 培养基上划线反复纯化，得到传代稳定的单菌落后，观察其生长情况，选择生长 良好的菌种分别编号，保存、备用。

经过大量的富集培养，分离得到一株能够在含菌核净100mg/L的分离培养 基上以菌核净为唯一碳源的无机盐培养基中能够生长的菌株，并使用气相色谱法 验证其降解效果。将该菌株命名为降解菌J3，在试验时间范围内，该菌株能够 在纯培养条件下，将初始浓度50mg/L的菌核净在5d降解率51.65％，7d菌核 净被降解了60.27％。

Agilent6890N气相色谱仪，检测器：带μECD；色谱柱：HP-5石英毛细管 柱(30m×0.32mm×0.25μm)；进样口温度：260℃；检测器温度：280℃；柱箱 温度：程序升温方式，初始温度200℃，保持1min，以10℃/min升至270℃， 载气为高纯氮气，流速1.2mL/min；分流比为10:1；进样量：1μL。在上述条件 下，以菌核净标准溶液浓度(x)为横坐标，峰面积(y)为纵坐标绘制标准曲线。线 性方程为y＝991.37x+11.136，相关系数为：R²＝0.9998，在此条件下菌核净的 保留时间为7.018min(图2)。

降解率计算方法如下：

2)降解菌J 3的鉴定

(1)降解菌J3的形态学鉴定将处于对数生长期，且菌落大小稳定，上述 步骤一分离并纯化得到的降解菌J3进行单菌落状态描述，主要包括菌落的大小、 颜色、透明度、湿润度、菌落表面状态、菌落边缘状态。

结果表明，上述步骤一分离并纯化得到的降解菌J3在牛肉膏蛋白胨固体培 养基中生长迅速，呈细密的圆形或椭圆形，质地软，稍有光泽的淡黄色菌落，不 粘稠易挑取。

(2)生理生化特征分析

经Biolog自动分析仪进行生理生化分析测定降解菌J3的生理生化特征。

测定结果显示，该菌株对常见的抗生素，如阿米卡星、亚胺培南、左氧氟沙 星、美诺培南、哌拉西林、复方新诺明、头孢噻肟、头孢他啶表现为敏感；降解 菌对头孢吡肟、环丙沙星及氯霉素表现为中度敏感；对氨曲南、头孢唑啉、庆大 霉素则表现为不敏感。降解菌能直接利用L-谷氨酸、精氨酸、L-亮氨酸，对其 它碳源则不能直接利用，所述降解菌J3的生理生化特征测定结果如表1所示。

表1.J3的生理生化特征

注：“+”：阳性；“-”：阴性。

(3)降解菌16S rDNA的同源性分析

DNA测序由上海英骏生物技术有限公司完成，测序结果用Blast软件 Genbank中的16S rDNA序列进行同源性比较。

获得的J3的16S rDNA序列(SEQ ID NO.1)见后。

该菌株的16S rDNA序列已经提交到GenBank数据库(GenBank登录号： MF427702)，发现该序列与Brevundimonas naejangsanensis FJ544245属于同一 支，支持率高于50％，那么从系统发育学来讲，它们之间的亲缘关系相近。

3)降解特性分析

进行了菌株发酵最适碳源、氮源的种类和浓度生长实验。采用无机盐培养基， 分别在以可溶性淀粉、麦芽糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖、丙烯酰胺、牛肉膏问碳源， 其它成分及条件保持不变；以黄豆粉、硝酸铵、酵母膏、硝酸钠及蛋白胨为氮源， 其它成分及条件不变，培养、观察、记录菌株的生长情况，每个处理3次重复。 筛选得出最适碳源和氮源分别为麦芽糖和酵母膏。在筛选出菌株最优碳源和氮源 种类的基础上，以牛肉膏蛋白胨培养基为基准，将培养基的碳源设置为5个浓度 分别是1g/L、3g/L、5g/L、7g/L、9g/L；以筛选最佳氮源浓度为基础设置5个 浓度：6g/L、8g/L、10g/L、12g/L、14g/L；并进行无机盐氯化钠浓度的筛选， 以1g/L、3g/L、5g/L、7g/L、9g/L为浓度梯度进行试验。分别进行培养、观 察、记录菌株的生长情况，重复三次。得出单孢属菌J3的发酵培养基中麦芽糖 的最适浓度为1mg/L、氮源酵母膏最适浓度6g/L、无机盐氯化钠最适浓度为浓 度为1g/L。筛选出最优的碳源种类及浓度、氮源种类及浓度及无机盐浓度后， 采用L₉(3³)正交表进行3因素3水平的正交试验(正交表见表2)。结果表明， 菌株单孢属菌J3在麦芽糖7g/L、酵母膏8g/L、氯化钠3g/L是菌株J3的最优 发酵条件，其OD₆₀₀值可达21.11，对照则为0.8717.

表2.单孢属菌J3正交试验设计表

鉴于上述菌株J3的形态、生理生化特性和16S rDNA序列分析结果，将降 解菌J3鉴定为单孢属菌(Brevundimonas naejangsanensis)。单孢属菌 (Brevundimonasnaejangsanensis)J3于2017年11月27日保存于中国典型培养 物保藏中心(CCTCC)，地址为中国武汉，武汉大学，保藏号为CCTCC M 2017739。

实施例2：降解菌单孢属菌J3制剂的制备

1)液体降解菌剂制备

包括如下步骤：

(1)将单孢属菌J3的菌株接种5％的菌悬液于牛肉膏蛋白胨盐培养基中， 于30℃，150～200rpm下振荡培养6～13h，获得菌种。

(2)将菌种按牛肉膏蛋白胨盐培养基的体积比的1％的接种量接种入种子 瓶，30℃，150～200rpm下振荡培养6～13h，获得种子液。

(3)将获得的种子液按照10％的体积比的接种量接种入发酵培养基(麦芽 糖7g/L、酵母膏8g/L、氯化钠3g/L)中，在30℃、150～200rpm下发酵 培养13～14h，获得发酵液(OD600大于20)，将发酵液直接稀释即为J3 液体菌剂，液体菌剂的OD600为2。J3液体菌剂如图4所示。

2)固体菌剂制备

(1)将单孢属菌J3接种5％的菌悬液于牛肉膏蛋白胨盐培养基中，于30～ 35℃，150～200rpm下振荡培养至对数生长期，获得菌种；

(2)将上述菌种按牛肉膏蛋白胨盐培养基的体积比的1％的接种量接种入种 子瓶，30～35℃，150～200rpm下振荡培养至对数生长期，获得种子液；

将获得的种子液按照10％的体积比的接种量接种入发酵培养基中，在30～ 35℃、150～200rpm下发酵培养至稳定期，获得发酵液，以紫外分光光度计检 测发酵液的OD值，将发酵液直接稀释即为液体菌剂。

(4)将将单孢属菌J3的发酵液直接稀释得到固定液(OD₆₀₀＝3)，在固定 液中加入无菌的玉米秸秆粉末吸附载体(固定液：载体＝1:1.5)，充分混匀后放 置在黑暗处静置2d，然后在25～30℃条件下烘干，即成为将单孢属菌J3固体菌 剂。将单孢属菌J3固体菌剂如图4所示。

实施例3：降解菌J3对菌核净的降解效能

在无机盐培养基(同实施例1)中加入菌核净，使其终浓度为50.0mg/L； 将适量菌体加入含菌核净50mg/L无机盐培养基中，调其OD600为0.2，于摇床 中30℃、150rpm培养7d，每隔24h取样测定菌株的降解能力。以添加同样浓 度农药的不接菌无机盐培养基为对照。

应用气相色谱法测定菌核净的残留量并计算降解率，结果如图3所示，结果 表明，降解菌J3在短时间内可有效降解菌核净，5d对50.0mg/L菌核净的降解 率达到51.65％，7d菌核净降解率达60.27％，具有较好的生物降解效果。试验 结果表明，降解菌J3对50.0mg/L的菌核净具有很好的降解能力。这一结果表明， 本发明所提供的降解菌J3可有效降解菌核净，在修复菌核净污染的水体和土壤 方面具有广阔的应用前景。

上述实施例中使用的培养基如下：

无机盐培养基(MSM)：磷酸氢二钾0.2g，磷酸二氢钾0.8g，硫酸镁0.2g， 硫酸钙0.1g，钼酸钠0.003g，硫酸亚铁0.005g，硫酸铵1.0g，去离子水1000mL， 调pH至7.2。

分离培养基：无机盐培养基中按实验设计要求添加不同浓度菌核净唯一碳 源，pH7.0(固体培养基添加20g琼脂)。

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，去离子 水1000mL，pH 7.4-7.6。

以上培养基均在高压锅中121℃灭菌20～30min。培养基中，30～35℃，150～200rpm下振荡培养至对数生长期，获得菌种。

以上只是本发明的具体应用范例，本发明还有其他的实施方式，凡采用等同 替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明所要求的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 贵州大学

<120> 一株单孢属菌J3及其应用及使用方法

<130> nm:

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1340

<212> DNA

<213> 单孢属菌（Brevundimonas naejangsanensis）

<400> 1

cgtgg tcggc tgcct ccatt gctgg ttagc gcacc gcctt cgggt agaac caact cccat 60

ggtgt gacgg gcggt gtgta caagg cccgg gaacg tattc accgc ggcat gctga tccgc 120

gatta ctagc gattc caact tcatg ccctc gagtt gcaga ggaca atccg aactg agacg 180

acttt taagg attaa ccctc tgtag tcgcc attgt agcac gtgtg tagcc caccc tgtaa 240

gggcc atgag gactt gacgt catcc ccacc ttcct ccggc ttagc accgg cagtc ccatt 300

agagt tccca actaa atgat ggcaa ctaat ggcga gggtt gcgct cgttg cggga cttaa 360

cccaa catct cacga cacga gctga cgaca gccat gcagc acctg tgtcc tagtc cccga 420

aggga aagcc acgtc tccgt ggcgg tccag gcatg tcaaa aggtg gtaag gttct gcgcg 480

ttgct tcgaa ttaaa ccaca tgctc caccg cttgt gcggg ccccc gtcaa ttcct ttgag 540

tttta atctt gcgac cgtac tcccc aggcg gattg cttaa tgcgt tagct gcgtc accga 600

actgc atgca gcccg acaac tagca atcat cgttt acggc gtgga ctacc agggt atcta 660

atcct gtttg ctccc cacgc tttcg cgcct cagcg tcagt aatga gccag tatgt cgcct 720

tcgcc actgg tgttc ttccg aatat ctacg aattt cacct ctaca ctcgg agttc cacat 780

acctc tctca tactc aagat cgcca gtatc aaagg cagtt ccagg gttga gccct gggat 840

ttcac ctctg actta acgat ccgcc tacgc gccct ttacg cccag taatt ccgag caacg 900

ctagc cccct tcgta ttacc gcggc tgctg gcacg aagtt agccg gggct tcttc tccgg 960

gtacc gtcat tatcg tcccc ggtga aagaa tttta caatc ctaag acctt catca ttcac 1020

gcggc atggc tgcgt caggc tttcg cccat tgcgc aagat tcccc actgc tgcct cccgt 1080

aggag tctgg gccgt gtctc agtcc cagtg tggct ggtca tcctc tcaga ccagc tactg 1140

atcgt cgcct tggtg agccg ttacc tcacc aacta gctaa tcaga cgcgg gccgc tctaa 1200

tggcg ataaa tcttt ccccc gaagg gcaca ttcgg tatta gcaca agttt ccctg agtta 1260

ttccg aacca aaagg cacgt tccca cgtgt tactc acccg tccgc cacta actcc gaaga 1320

gttcg ttcga cttgc atgtg 1340

Claims (7)

1.一株单孢属菌J3，其特征在于：其保藏号为CCTCC M 2017739。

2.根据权利要求1所述的一株单孢属菌J3，其特征在于：该菌株16S rDNA序列如SED IDNO.1所示。

3.含有权利要求1所述的单孢属菌J3的生物液体菌剂。

4.含有权利要求1所述的单孢属菌J3的生物固体菌剂。

5.含有权利要求1所述的单孢属菌J3在菌核净农药残留中的应用。

6.一种采用如权利要求1所述的单孢属菌J3生产降解菌液体制剂的方法，其特征在于：将单孢属菌J3的菌株作为活体成分，制备获得降解液体菌剂。

7.一种采用如权利要求1所述的单孢属菌J3生产降解菌固体制剂的方法，其特征在于：将单孢属菌J3的菌株作为活体成分，制备获得降解固体菌剂。